微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)名詞及其解讀一、引言微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是研究微生物形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理、遺傳及生態(tài)的核心手段，其操作的規(guī)范性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與安全性。本文梳理了微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中基礎(chǔ)操作、培養(yǎng)檢測(cè)、分子技術(shù)、安全質(zhì)控四大類關(guān)鍵名詞，結(jié)合原理、操作要點(diǎn)與應(yīng)用場(chǎng)景進(jìn)行解讀，旨在為實(shí)驗(yàn)人員提供系統(tǒng)的參考指南。二、基礎(chǔ)操作類名詞（一）無(wú)菌操作（AsepticTechnique）1.定義無(wú)菌操作是指在實(shí)驗(yàn)中防止外界微生物污染實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)避免實(shí)驗(yàn)微生物擴(kuò)散至環(huán)境的一系列標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。2.核心原理通過(guò)物理滅菌（火焰灼燒、高壓蒸汽）或化學(xué)消毒（75%乙醇、碘伏）去除操作體系（工具、材料、環(huán)境）中的微生物，維持“無(wú)菌屏障”。3.關(guān)鍵操作要點(diǎn)環(huán)境準(zhǔn)備：操作前開(kāi)啟超凈工作臺(tái)/生物安全柜30分鐘（通風(fēng)凈化），用75%乙醇擦拭臺(tái)面；工具滅菌：接種環(huán)、鑷子等金屬工具需火焰灼燒至紅熱（冷卻后使用，避免燙死微生物）；試管口、培養(yǎng)皿蓋需快速通過(guò)火焰（滅活表面微生物）；操作規(guī)范：實(shí)驗(yàn)材料（如菌液、培養(yǎng)基）需貼近火焰進(jìn)行轉(zhuǎn)移，動(dòng)作迅速，避免空氣微生物落入；操作人員雙手需用75%乙醇消毒，避免直接接觸無(wú)菌物品。4.注意事項(xiàng)操作過(guò)程中避免說(shuō)話、咳嗽，如需調(diào)整姿勢(shì)用肘部接觸物品；接種環(huán)冷卻時(shí)不可接觸試管壁或培養(yǎng)基，以免污染。5.應(yīng)用場(chǎng)景微生物分離、純化、接種、傳代等所有涉及活微生物的實(shí)驗(yàn)。（二）稀釋涂布平板法（SpreadPlateMethod）1.定義將微生物樣品進(jìn)行梯度稀釋后，取適量稀釋液涂布于固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)菌落的方法，用于活菌計(jì)數(shù)。2.核心原理稀釋后的樣品中，單個(gè)活菌在培養(yǎng)基上繁殖形成肉眼可見(jiàn)的菌落（CFU，菌落形成單位），通過(guò)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)可計(jì)算樣品中的活菌濃度。3.操作要點(diǎn)梯度稀釋：用無(wú)菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液將樣品依次稀釋（如10?1、10?2……10??），每稀釋一步更換一支吸管；涂布：取0.1mL稀釋液滴于培養(yǎng)基表面，用滅菌的涂布棒（蘸取乙醇灼燒冷卻后）均勻涂布，確保液體完全吸收；培養(yǎng)：倒置平板（防止冷凝水沖刷菌落），置于適宜溫度（如37℃）培養(yǎng)18-24小時(shí)。4.注意事項(xiàng)稀釋度選擇：需保證平板上的菌落數(shù)在____之間（計(jì)數(shù)范圍，避免誤差）；涂布棒冷卻：灼燒后需在培養(yǎng)基邊緣冷卻，避免燙死樣品中的微生物；平行實(shí)驗(yàn)：每個(gè)稀釋度做2-3個(gè)重復(fù)平板，取平均值。5.應(yīng)用場(chǎng)景食品、水、土壤等樣品中的微生物活菌計(jì)數(shù)（如細(xì)菌總數(shù)測(cè)定）。（三）劃線分離法（StreakPlateMethod）1.定義用接種環(huán)蘸取微生物樣品，在固體培養(yǎng)基表面進(jìn)行連續(xù)劃線，通過(guò)稀釋作用將樣品中的微生物分離成單個(gè)菌落的方法。2.核心原理劃線過(guò)程中，微生物細(xì)胞隨接種環(huán)的移動(dòng)逐漸稀釋，最終在劃線末端形成單個(gè)菌落，實(shí)現(xiàn)微生物的純化。3.操作要點(diǎn)接種環(huán)滅菌：灼燒至紅熱，冷卻后蘸取樣品；劃線方式：常用“三區(qū)劃線法”——第一區(qū)密集劃線，第二區(qū)從第一區(qū)邊緣劃線，第三區(qū)從第二區(qū)邊緣劃線（每區(qū)劃線前接種環(huán)需灼燒滅菌）；培養(yǎng)：倒置平板培養(yǎng)，待菌落形成后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化。4.注意事項(xiàng)劃線時(shí)接種環(huán)與培養(yǎng)基表面呈45°角，力度適中，避免劃破培養(yǎng)基；每區(qū)劃線需銜接前一區(qū)，確保微生物逐漸稀釋。5.應(yīng)用場(chǎng)景微生物分離、純化（如從土壤中分離芽孢桿菌）。二、培養(yǎng)與檢測(cè)類名詞（一）培養(yǎng)基（Medium）1.定義人工配制的、用于微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，需滿足微生物對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水的需求。2.分類按物理狀態(tài)：固體培養(yǎng)基（加1.5%-2%瓊脂）、液體培養(yǎng)基（無(wú)瓊脂）、半固體培養(yǎng)基（加0.3%-0.5%瓊脂）；按用途：基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如LB培養(yǎng)基，用于一般微生物培養(yǎng)）、選擇培養(yǎng)基（如SS培養(yǎng)基，抑制革蘭陽(yáng)性菌，選擇沙門菌）、鑒別培養(yǎng)基（如伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，鑒別大腸桿菌）、富集培養(yǎng)基（如肉湯培養(yǎng)基，富集腸道菌）。3.制備要點(diǎn)配料：按配方準(zhǔn)確稱量，溶解于蒸餾水中；調(diào)pH：用NaOH或HCl調(diào)整pH至適宜范圍（如細(xì)菌pH7.0-7.2，真菌pH5.0-6.0）；滅菌：高壓蒸汽滅菌（121℃，15-20分鐘），不耐熱成分（如抗生素、血清）需過(guò)濾滅菌；倒平板：滅菌后培養(yǎng)基冷卻至50℃左右（不燙手），倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿（約15-20mL/皿），凝固后倒置保存。4.注意事項(xiàng)瓊脂需完全溶解（可加熱煮沸）；倒平板時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡可用接種環(huán)挑破；培養(yǎng)基需現(xiàn)配現(xiàn)用，或4℃保存（不超過(guò)1周）。5.應(yīng)用場(chǎng)景微生物培養(yǎng)、分離、鑒定、計(jì)數(shù)等所有實(shí)驗(yàn)。（二）革蘭染色（GramStaining）1.定義由丹麥科學(xué)家革蘭（HansChristianGram）發(fā)明的細(xì)菌染色法，用于區(qū)分革蘭陽(yáng)性菌（G?）與革蘭陰性菌（G?）。2.核心原理細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異：G?菌細(xì)胞壁肽聚糖層厚，交聯(lián)度高，不含脂多糖，經(jīng)乙醇脫色后肽聚糖層收縮，保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物，呈紫色；G?菌細(xì)胞壁肽聚糖層薄，交聯(lián)度低，含大量脂多糖，乙醇脫色后脂多糖溶解，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被洗脫，復(fù)染后呈紅色。3.操作步驟涂片固定：取少量細(xì)菌樣品涂于載玻片上，干燥后通過(guò)火焰固定（殺死細(xì)菌并使其黏附于玻片）；初染：滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，水洗；媒染：滴加碘液，染色1分鐘，水洗；脫色：用95%乙醇沖洗至無(wú)紫色流出（約30秒），水洗；復(fù)染：滴加番紅染液，染色1分鐘，水洗；干燥鏡檢：自然干燥后，用油鏡觀察。4.注意事項(xiàng)涂片厚度適中（過(guò)厚不易脫色，過(guò)薄難以觀察）；脫色是關(guān)鍵步驟（時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致G?菌脫色，時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致G?菌不脫色）；染液需新鮮（如結(jié)晶紫染液放置過(guò)久會(huì)沉淀）。5.結(jié)果判斷G?菌：紫色（如金黃色葡萄球菌）；G?菌：紅色（如大腸桿菌）。6.應(yīng)用場(chǎng)景細(xì)菌分類鑒定、臨床病原學(xué)診斷（如判斷細(xì)菌感染類型）。（三）菌落（Colony）1.定義單個(gè)微生物細(xì)胞（或孢子、菌絲片段）在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)繁殖形成的肉眼可見(jiàn)的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。2.特征菌落的大小、形狀、顏色、邊緣、表面紋理、隆起度、透明度等特征是微生物分類鑒定的重要依據(jù)。例如：金黃色葡萄球菌：圓形、凸起、表面光滑、金黃色菌落；大腸桿菌：圓形、扁平、表面光滑、灰白色菌落；青霉菌：絨毛狀、邊緣不整齊、綠色菌落。3.形成條件固體培養(yǎng)基（提供固定生長(zhǎng)表面）；適宜的溫度、濕度、pH；單個(gè)微生物細(xì)胞（避免重疊生長(zhǎng)）。4.應(yīng)用場(chǎng)景微生物分離純化（挑取單個(gè)菌落獲得純培養(yǎng)）、分類鑒定（通過(guò)菌落特征判斷微生物種類）、活菌計(jì)數(shù)（平板計(jì)數(shù)法）。（四）藥敏試驗(yàn)（AntimicrobialSusceptibilityTesting,AST）1.定義測(cè)定微生物對(duì)不同抗菌藥物敏感性的實(shí)驗(yàn)，用于指導(dǎo)臨床合理用藥。2.核心原理將抗菌藥物紙片貼于接種有測(cè)試菌的培養(yǎng)基表面，藥物通過(guò)擴(kuò)散作用形成濃度梯度，若測(cè)試菌對(duì)藥物敏感，則在紙片周圍形成抑菌圈（無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的區(qū)域），抑菌圈的大小反映藥物的敏感性。3.常用方法紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）：最常用，操作簡(jiǎn)單；肉湯稀釋法：測(cè)定最低抑菌濃度（MIC，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度）；E-試驗(yàn)：結(jié)合紙片擴(kuò)散法與稀釋法，可定量測(cè)定MIC。4.操作要點(diǎn)（紙片擴(kuò)散法）菌液制備：將測(cè)試菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋s1.5×10?CFU/mL）；涂布接種：用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于Mueller-Hinton（MH）培養(yǎng)基表面（需覆蓋整個(gè)平板）；貼紙片：用無(wú)菌鑷子將抗菌藥物紙片貼于培養(yǎng)基表面（每片間距≥24mm，紙片邊緣距平板邊緣≥15mm）；培養(yǎng)：35℃培養(yǎng)16-18小時(shí)；結(jié)果判斷：測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)CLSI（臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)）標(biāo)準(zhǔn)判斷敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。5.注意事項(xiàng)培養(yǎng)基厚度需均勻（約4mm），否則會(huì)影響藥物擴(kuò)散；菌液濃度需準(zhǔn)確（過(guò)高會(huì)導(dǎo)致抑菌圈縮小，過(guò)低會(huì)導(dǎo)致抑菌圈增大）；紙片需新鮮（避免藥物失效）。6.應(yīng)用場(chǎng)景臨床病原學(xué)診斷（如判斷細(xì)菌對(duì)青霉素、頭孢菌素等藥物的敏感性）、抗生素耐藥性監(jiān)測(cè)。三、分子生物學(xué)類名詞（一）PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PolymeraseChainReaction）1.定義一種體外擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)將微量DNA擴(kuò)增至可檢測(cè)水平。2.核心原理通過(guò)變性-退火-延伸三步循環(huán)，利用DNA聚合酶（如Taq酶）催化DNA合成，實(shí)現(xiàn)DNA片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增（2?，n為循環(huán)次數(shù)）。變性：94-95℃，使雙鏈DNA解鏈為單鏈；退火：50-65℃，使引物與單鏈DNA模板互補(bǔ)結(jié)合；延伸：72℃，Taq酶催化引物延伸，合成新的DNA鏈。3.反應(yīng)體系模板DNA：待擴(kuò)增的微生物DNA（如細(xì)菌基因組DNA）；引物：一對(duì)特異性寡核苷酸（與模板DNA兩端互補(bǔ)）；DNA聚合酶：熱穩(wěn)定的Taq酶（來(lái)自嗜熱菌*Thermusaquaticus*）；dNTPs：脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），合成DNA的原料；緩沖液：提供適宜的pH（通常含Mg2?，促進(jìn)酶活性）；無(wú)菌水：調(diào)整反應(yīng)體積（通常25-50μL）。4.操作要點(diǎn)模板DNA提?。盒璞ＷCDNA純度（避免蛋白質(zhì)、RNA、抑制劑污染）；引物設(shè)計(jì)：長(zhǎng)度18-25bp，GC含量40%-60%，避免引物二聚體；循環(huán)參數(shù)：變性時(shí)間（30秒-1分鐘）、退火溫度（根據(jù)引物Tm值調(diào)整）、延伸時(shí)間（根據(jù)片段長(zhǎng)度調(diào)整，1kb/分鐘）；產(chǎn)物檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳（觀察目的片段大?。?、測(cè)序（驗(yàn)證序列準(zhǔn)確性）。5.注意事項(xiàng)防止交叉污染（使用帶濾芯的槍頭、分開(kāi)操作區(qū)）；Taq酶需-20℃保存，避免反復(fù)凍融；反應(yīng)體系需冰上配制，避免提前啟動(dòng)反應(yīng)。6.應(yīng)用場(chǎng)景微生物鑒定（如16SrRNA基因測(cè)序）、病原微生物檢測(cè)（如新冠病毒核酸檢測(cè)）、基因克隆、突變分析。（二）16SrRNA基因測(cè)序（16SrRNAGeneSequencing）1.定義通過(guò)測(cè)定微生物16SrRNA基因的序列，分析微生物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，實(shí)現(xiàn)微生物種類鑒定的分子技術(shù)。2.核心原理16SrRNA基因是原核生物核糖體小亞基的編碼基因，具有高度保守性（用于屬級(jí)以上分類）和可變區(qū)（用于種級(jí)分類），是微生物分類鑒定的“分子條形碼”。3.操作步驟DNA提取：從樣品（如土壤、糞便、臨床標(biāo)本）中提取微生物總DNA；PCR擴(kuò)增：用通用引物（如27F/1492R）擴(kuò)增16SrRNA基因的可變區(qū)（如V3-V4區(qū)）；測(cè)序：用二代測(cè)序技術(shù)（如Illumina）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序；數(shù)據(jù)分析：通過(guò)生物信息學(xué)軟件（如QIIME、RDPClassifier）對(duì)序列進(jìn)行聚類（OTU，操作分類單元）、注釋（匹配數(shù)據(jù)庫(kù)，如SILVA、NCBI），分析微生物群落結(jié)構(gòu)。4.注意事項(xiàng)樣品DNA提取需充分（避免抑制PCR反應(yīng)）；引物選擇需覆蓋目標(biāo)微生物的可變區(qū)（如V3-V4區(qū)適用于細(xì)菌鑒定）；測(cè)序深度需足夠（避免遺漏低豐度微生物）。5.應(yīng)用場(chǎng)景環(huán)境微生物群落分析（如土壤微生物多樣性）、臨床病原微生物鑒定（如難培養(yǎng)細(xì)菌）、微生物進(jìn)化研究。四、安全與質(zhì)控類名詞（一）生物安全柜（BiologicalSafetyCabinet,BSC）1.定義一種用于處理有害微生物的防護(hù)設(shè)備，通過(guò)空氣過(guò)濾系統(tǒng)（HEPAfilter，高效空氣過(guò)濾器）保護(hù)操作人員、環(huán)境和樣品免受污染。2.分類Ⅰ級(jí)：用于處理低風(fēng)險(xiǎn)微生物（如枯草芽孢桿菌），保護(hù)操作人員和環(huán)境，不保護(hù)樣品；Ⅱ級(jí)：最常用，用于處理中等風(fēng)險(xiǎn)微生物（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌），保護(hù)操作人員、環(huán)境和樣品（分為A1、A2、B1、B2型，其中A2型適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室）；Ⅲ級(jí)：用于處理高風(fēng)險(xiǎn)微生物（如炭疽桿菌、埃博拉病毒），完全密封，通過(guò)手套操作，保護(hù)操作人員、環(huán)境和樣品。3.操作要點(diǎn)開(kāi)機(jī)準(zhǔn)備：開(kāi)啟生物安全柜后，運(yùn)行30分鐘以上（讓HEPAfilter達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)）；操作規(guī)范：將實(shí)驗(yàn)物品放在柜內(nèi)前1/3與后2/3之間（避免阻擋氣流）；手臂進(jìn)出柜時(shí)需緩慢（避免破壞氣流）；清潔消毒：操作后用75%乙醇擦拭柜內(nèi)表面，關(guān)閉電源前運(yùn)行10分鐘（排出殘留微生物）。4.注意事項(xiàng)生物安全柜需定期檢測(cè)（如每年進(jìn)行HEPAfilter效率測(cè)試）；禁止在柜內(nèi)使用明火（會(huì)破壞氣流，且可能引燃有機(jī)試劑）；柜內(nèi)物品需擺放整齊（避免遮擋回風(fēng)口）。5.應(yīng)用場(chǎng)景處理病原微生物（如臨床標(biāo)本中的致病菌）、基因工程操作（如重組DNA）、高風(fēng)險(xiǎn)微生物實(shí)驗(yàn)。（二）滅菌（Sterilization）與消毒（Disinfection）1.定義滅菌：殺死或去除所有微生物（包括細(xì)菌芽孢、真菌孢子、病毒）的過(guò)程，是微生物實(shí)驗(yàn)的“絕對(duì)無(wú)菌”標(biāo)準(zhǔn)；消毒：去除或抑制微生物的生長(zhǎng)（不一定殺死芽孢），用于環(huán)境或物品的清潔。2.常用方法方法原理適用對(duì)象注意事項(xiàng)高壓蒸汽滅菌高溫（121℃）+高壓（15psi）培養(yǎng)基、玻璃器皿、手術(shù)器械需排盡冷空氣（否則溫度達(dá)不到）干熱滅菌高溫（____℃）玻璃器皿、金屬工具物品需干燥（避免炸裂）過(guò)濾滅菌微孔濾膜（0.22μm或0.45μm）不耐熱液體（如抗生素、血清）濾膜需滅菌（高壓蒸汽或射線）化學(xué)滅菌化學(xué)試劑（如環(huán)氧乙烷）塑料器械、電子設(shè)備需通風(fēng)（避免殘留試劑毒性）紫外線消毒紫外線（254nm）破壞DNA工作臺(tái)、空氣、水需直接照射（不能穿透物體）3.區(qū)別與聯(lián)系滅菌是“徹底殺菌”，消毒是“部分殺菌”；實(shí)驗(yàn)中需根據(jù)物品性質(zhì)選擇方法（如培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌，抗生素用過(guò)濾滅菌）。（三）質(zhì)控菌株（Q