N-乙酰-L半胱氨酸對(duì)體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞老化的影響摘要本研究旨在探究N-乙酰-L半胱氨酸（NAC）對(duì)體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞老化的影響。通過(guò)設(shè)置不同濃度NAC處理組與對(duì)照組，對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察卵母細(xì)胞的形態(tài)變化，檢測(cè)活性氧（ROS）水平、線粒體膜電位、抗氧化酶活性等指標(biāo)。結(jié)果表明，適宜濃度的NAC能夠顯著降低卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平，提高線粒體膜電位和抗氧化酶活性，有效延緩卵母細(xì)胞老化，為改善卵母細(xì)胞質(zhì)量和輔助生殖技術(shù)提供理論依據(jù)。關(guān)鍵詞N-乙酰-L半胱氨酸；小鼠卵母細(xì)胞；卵母細(xì)胞老化；抗氧化一、引言卵母細(xì)胞老化是影響女性生育能力和輔助生殖技術(shù)成功率的重要因素。隨著女性年齡的增長(zhǎng)，卵母細(xì)胞質(zhì)量逐漸下降，表現(xiàn)為染色體異常、紡錘體結(jié)構(gòu)紊亂、活性氧（ROS）積累等，這些變化會(huì)導(dǎo)致受精率降低、胚胎發(fā)育異常以及妊娠并發(fā)癥增加。體外培養(yǎng)過(guò)程中，卵母細(xì)胞也會(huì)因氧化應(yīng)激等因素加速老化。N-乙酰-L半胱氨酸（NAC）是一種含巰基的抗氧化劑，能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽（GSH），增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，清除ROS。已有研究表明，NAC在改善精子質(zhì)量、保護(hù)胚胎發(fā)育等方面具有積極作用，但關(guān)于其對(duì)卵母細(xì)胞老化影響的研究相對(duì)較少。因此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞，探討NAC對(duì)卵母細(xì)胞老化的影響及其潛在機(jī)制，為提高輔助生殖技術(shù)成功率提供新的思路和方法。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取6-8周齡健康雌性ICR小鼠，購(gòu)自[具體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心名稱]，飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%、12h光照/12h黑暗循環(huán)的環(huán)境中，自由攝食飲水。（二）主要試劑與儀器N-乙酰-L半胱氨酸（NAC）、礦物油、M2培養(yǎng)液、M16培養(yǎng)液、透明質(zhì)酸酶、活性氧檢測(cè)試劑盒（DCFH-DA）、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒等均購(gòu)自[具體試劑公司名稱]。主要儀器包括體視顯微鏡（[品牌及型號(hào)]）、二氧化碳培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)]）、熒光顯微鏡（[品牌及型號(hào)]）、酶標(biāo)儀（[品牌及型號(hào)]）等。（三）卵母細(xì)胞的采集與分組小鼠腹腔注射7.5IU孕馬血清促性腺激素（PMSG），48h后注射7.5IU人絨毛膜促性腺激素（hCG）。注射hCG后14-16h，處死小鼠，取出輸卵管，在M2培養(yǎng)液中撕開(kāi)輸卵管壺腹部，釋放卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）。將COCs置于含0.1%透明質(zhì)酸酶的M2培養(yǎng)液中，輕輕吹打去除顆粒細(xì)胞，挑選形態(tài)正常的卵母細(xì)胞。將卵母細(xì)胞隨機(jī)分為5組：對(duì)照組（不添加NAC）、NAC0.1mM組、NAC1mM組、NAC10mM組、NAC50mM組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含20-30個(gè)卵母細(xì)胞。（四）體外培養(yǎng)與處理將分組后的卵母細(xì)胞分別置于含不同濃度NAC的M16培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO?、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，分別在培養(yǎng)0h、24h、48h觀察卵母細(xì)胞的形態(tài)變化，記錄卵母細(xì)胞的存活率、第一極體排出率等指標(biāo)。（五）指標(biāo)檢測(cè)活性氧（ROS）水平檢測(cè)：采用DCFH-DA探針?lè)?。在培養(yǎng)0h、24h、48h時(shí)，將卵母細(xì)胞置于含10μMDCFH-DA的M2培養(yǎng)液中，37℃孵育20min，然后用M2培養(yǎng)液洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越高表示ROS水平越高。線粒體膜電位檢測(cè)：采用JC-1探針?lè)āＴ谂囵B(yǎng)0h、24h、48h時(shí)，將卵母細(xì)胞置于含10μg/mLJC-1的M2培養(yǎng)液中，37℃孵育20min，然后用M2培養(yǎng)液洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。正常線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成紅色熒光的J-aggregates；線粒體膜電位降低時(shí)，JC-1以單體形式存在于胞質(zhì)中，發(fā)出綠色熒光。使用ImageJ軟件分析紅綠熒光強(qiáng)度比值，比值越高表示線粒體膜電位越高?？寡趸富钚詸z測(cè)：在培養(yǎng)48h時(shí)，收集卵母細(xì)胞，按照SOD活性檢測(cè)試劑盒和MDA含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)卵母細(xì)胞中SOD活性和MDA含量。SOD活性反映細(xì)胞的抗氧化能力，MDA含量反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度。（六）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示，采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA）和Dunnett's多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果（一）NAC對(duì)卵母細(xì)胞形態(tài)和存活率的影響培養(yǎng)0h時(shí)，各組卵母細(xì)胞形態(tài)均正常，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞質(zhì)均勻。培養(yǎng)24h后，對(duì)照組部分卵母細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞質(zhì)顆粒化等老化現(xiàn)象；隨著NAC濃度的增加，老化卵母細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。培養(yǎng)48h后，對(duì)照組卵母細(xì)胞存活率顯著低于各NAC處理組（P＜0.05），其中NAC1mM組卵母細(xì)胞存活率最高，與其他NAC處理組相比差異顯著（P＜0.05），見(jiàn)圖1。（二）NAC對(duì)卵母細(xì)胞ROS水平的影響培養(yǎng)0h時(shí)，各組卵母細(xì)胞ROS水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。培養(yǎng)24h和48h后，對(duì)照組卵母細(xì)胞ROS水平顯著高于各NAC處理組（P＜0.05）；在NAC處理組中，隨著NAC濃度的增加，ROS水平先降低后升高，NAC1mM組ROS水平最低，與其他NAC處理組相比差異顯著（P＜0.05），見(jiàn)圖2。（三）NAC對(duì)卵母細(xì)胞線粒體膜電位的影響培養(yǎng)0h時(shí)，各組卵母細(xì)胞線粒體膜電位無(wú)顯著差異（P＞0.05）。培養(yǎng)24h和48h后，對(duì)照組卵母細(xì)胞線粒體膜電位顯著低于各NAC處理組（P＜0.05）；在NAC處理組中，隨著NAC濃度的增加，線粒體膜電位先升高后降低，NAC1mM組線粒體膜電位最高，與其他NAC處理組相比差異顯著（P＜0.05），見(jiàn)圖3。（四）NAC對(duì)卵母細(xì)胞抗氧化酶活性的影響培養(yǎng)48h后，對(duì)照組卵母細(xì)胞SOD活性顯著低于各NAC處理組（P＜0.05），MDA含量顯著高于各NAC處理組（P＜0.05）；在NAC處理組中，NAC1mM組SOD活性最高，MDA含量最低，與其他NAC處理組相比差異顯著（P＜0.05），見(jiàn)表1。四、討論卵母細(xì)胞老化過(guò)程中，氧化應(yīng)激發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ROS的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)損傷和DNA氧化損傷，破壞細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的正常功能和發(fā)育潛能。本研究結(jié)果表明，體外培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)照組卵母細(xì)胞ROS水平隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞質(zhì)顆粒化等老化現(xiàn)象，卵母細(xì)胞存活率降低，線粒體膜電位下降，抗氧化酶SOD活性降低，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量升高，這些結(jié)果與以往研究報(bào)道一致，說(shuō)明體外培養(yǎng)會(huì)加速小鼠卵母細(xì)胞老化。NAC作為一種抗氧化劑，能夠通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗氧化作用。一方面，NAC可以直接清除ROS，減少ROS對(duì)細(xì)胞的損傷；另一方面，NAC在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為GSH，GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，能夠參與維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。本研究中，添加不同濃度NAC處理后，卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低，線粒體膜電位升高，抗氧化酶SOD活性增強(qiáng)，MDA含量減少，卵母細(xì)胞存活率提高，老化現(xiàn)象得到明顯改善，說(shuō)明NAC能夠有效延緩體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞的老化。然而，本研究還發(fā)現(xiàn)，NAC對(duì)卵母細(xì)胞老化的影響存在濃度依賴性。當(dāng)NAC濃度為1mM時(shí)，對(duì)卵母細(xì)胞的保護(hù)作用最佳；過(guò)高或過(guò)低濃度的NAC對(duì)卵母細(xì)胞的保護(hù)效果均減弱。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腘AC抗氧化能力有限，無(wú)法有效清除過(guò)多的ROS；而過(guò)高濃度的NAC可能會(huì)打破細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡，產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，從而影響卵母細(xì)胞的正常功能。五、結(jié)論本研究表明，適宜濃度的N-乙酰-L半胱氨酸（1mM）能夠有效降低體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，提高線粒體膜電