農(nóng)藥殘留快速檢測中乙酰膽堿酯酶來源的篩選付勁，羅欣明，陳敏儀，張曉君，肖治理*（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院食品質量與安全實驗室，廣東廣州510642）摘要：從小麥粉、鯽魚肌肉、蠶蛹頭部和蠶蛹整體中提取和純化乙酰膽堿酯酶，并對4種酶液的酶活性及其對甲胺磷的敏感性進行比較，結果表明：來源于鯽魚肌肉的乙酰膽堿酯酶粗酶液的比活力最高，為0.4396U/mgpro；來源于蠶蛹頭部的乙酰膽堿酯酶對甲胺磷的敏感性最高，被抑制率為17.424％。綜上所述，來自蠶蛹頭部的乙酰膽堿酯酶可以作為常見有機磷農(nóng)藥快速檢測的最佳酶制劑。關鍵詞：乙酰膽堿酯酶比活力甲胺磷抑制率前言我國是農(nóng)業(yè)大國，同時也是世界上最大的農(nóng)藥生產(chǎn)國，由農(nóng)藥殘留引起的食品安全問題也越來越受到人們的關注。建立農(nóng)藥殘留的監(jiān)測體系已成為各方的共識，因此對農(nóng)藥殘留的監(jiān)測手段和檢測水平也提出了更高的要求，并促進了農(nóng)藥殘留快速檢測方法朝著更加快速、方便、靈敏可靠的方向發(fā)展。目前農(nóng)藥殘留分析的主要方法是氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）等，這些方法雖然分析精度高，定量準確，但其樣品的前處理復雜、檢測耗時長、成本高、需要技術熟練的操作人員等缺點[1]。酶抑制法是利用OPs的毒理特性建立的一種快速檢測方法。酶抑制法的基本原理是有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶有強烈的抑制作用，將水果和蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留提取液添加到酶的反應體系中，通過顯色反應能夠快速測定農(nóng)藥的殘留情況。[3]在一定條件下,有機磷農(nóng)藥對某些酯酶催化水解的正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關[2]。酶抑制率法檢測農(nóng)藥殘留具有快速、簡便、靈敏及成本低等優(yōu)點，適用于現(xiàn)場快速檢測[3]。有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥能對膽堿酯酶(cholinesterase,ChE)起到抑制作用：在一定條件下，ChE的活性變化與有機磷農(nóng)藥的濃度存在良好的相關性，通過測定農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留提取液對ChE酶活的抑制可判定農(nóng)藥殘留的情況[3]。其中，酶的性能是技術關鍵。從不同酶源中提取的膽堿酯酶，對不同的農(nóng)藥的敏感度是不同的[4]。膽堿酯酶(Cholinesterase,ChE)分為乙酰膽堿酯酶(AChE,EC3.1.1.7)和丁酰膽堿酯酶(BchE,EC3.1.1.8)兩類。AChE又稱為真性或特異性膽堿酯酶,是一種絲氨酸水解酶，AchE是一種大分子糖蛋白，糖基占總重量的15%，AchE按其分子特征可分為球型和尾型。主要分布于腦、脊髓、肌肉和紅細胞等組織中,是生物神經(jīng)傳導中的一種關鍵性酶,能高效水解神經(jīng)遞質則能更好地保證檢測的覆蓋面[5]。由于不同生物來源的AChE在結構上有一定的差異,表現(xiàn)在受有機磷農(nóng)藥抑制時具有不同的選擇性和敏感程度。因此,篩選敏感性較高的AChE是當前的研究熱點。本實驗從幾種常見的原料：小麥粉、鯽魚肉、蠶蛹中提取和純化乙酰膽堿酯酶，通過比較不同來源的AChE酶活及其受農(nóng)藥體外抑制作用，篩選出較優(yōu)的酶源作為酶抑制率法檢測農(nóng)藥殘留的最佳酶制劑。材料與方法2.1實驗材料淀粉、鯽魚：購于華南農(nóng)業(yè)大學三角農(nóng)貿(mào)市場蠶蛹：購于廣州市江南西農(nóng)貿(mào)市場透析袋，透析夾：購于廣州威佳科技2.2實驗試劑農(nóng)藥標準品：甲胺磷，購于廣州威佳科技考馬斯亮藍試劑盒：南京建成科技十二烷基硫酸鈉（SDS）：廣東光華化學廠雙二硝基苯甲酸（DTNB）：Sigma硫化硫代乙酰膽堿（AtchI）：FlukaTritonX－100：上海凌峰化學試劑磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、硫酸銨均為分析純2.3實驗儀器與設備分析天平，PB203N，MettlerToledoGroup小型高速冷凍離心機：Centrifuge5417R，EppendorfGermanyTDL5型離心機：上海安亭科學儀器廠制造722型可見分光光度計，廈門儀器分析廠DK8D型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器高速組織搗碎機:上海標本模型廠制造2.4實驗方法主要試劑的配制碘化硫代乙酞膽堿(AtchI)溶液：稱取100mgAtchI溶于蒸餾水并定容于l0mL容量瓶中，置0-4℃冰箱中保存，保存期不超過兩周;5,5’二硫代雙2硝基苯甲酸(DTNB)溶液：稱取60mgDTNB溶于0.1M(pH7.27)的磷酸緩沖液，并定容于l0mL容量瓶中，置0-4℃冰箱中保存;十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液：稱取2.5gSDS，用蒸餾水溶解并定容于250mL容量瓶中;甲胺磷溶液：取甲胺磷標準品稀釋至濃度為2mg/L；小麥粉中提取與純化AChE酶液[6]稱取小麥粉(約30g)，加入3倍小麥粉質量的磷酸緩沖溶液(pH=6，0.2mol/L)作為提取液,于4℃下浸泡16h,研磨后于常溫下離心10min(5000r/min)，即得粗酶液，并記錄體積。按每100mL提取液加入17.6g固體硫酸銨粉末(30%硫酸銨飽和度),攪拌混勻后以3500r/min離心10min,收集上清液；再按每100mL上清液加入27.3g固體硫酸銨粉末(70%硫酸銨飽和度)，攪拌混勻后以3500r/min離心10min,收集沉淀。用pH=7.0,濃度為0.2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液溶解沉淀,裝入透析袋,透析24h,收集透析袋內(nèi)的液體，并記錄其體積，得到AChE酶液1號。鯽魚中提取與純化AChE酶液去除鯽魚魚體內(nèi)臟，取出背部肌肉，洗凈,瀝干。稱重鯽魚肌肉，加入1.5倍鯽魚肌肉質量的Tris緩沖溶液（pH=8，0.05mol/L）作為提取液，用高速組織搗碎機制備勻漿,4℃冷凍離心10min（6000r/min），收集上清液，即為AChE酶液2號。蠶蛹頭部提取與純化AChE酶液新鮮家蠶的蛹用自來水沖洗干凈,瀝干水。取120頭蠶蛹的頭部，稱重,加入1ml含有0.l%TritonX－100、pH7.0的25mmol/L磷酸緩沖溶液作為提取液，研磨，4℃條件下冷凍離心20min（15000r/min），收集上清液，即為AChE酶液３號。蠶蛹整體提取與純化AChE酶液[7]取180頭蠶蛹，稱重,加入3ml含有0.l%TritonX－100、pH7.0的25mmol/L磷酸緩沖溶液作為提取液，用高速組織搗碎機制備勻漿，4℃條件下冷凍離心20min（15000r/min），收集上清液，即為AChE酶液4號。蛋白質含量的測定參照考馬斯亮藍G250方法進行測定[8]。AChE酶活性的測定酶活力單位（U）：37℃條件下，在pH8.0，0.2mol/L磷酸緩沖溶液中,每毫克酶蛋白每分鐘催化水解底物AtchI的微摩爾數(shù)。酶活性的測定如表1所示：表1游離酶活力的測定反應液酶液（μl）磷酸緩沖液（μl）AtchI溶液（μl）DTNB（μl）SDS（μl）對照管0295050501000測定管50290050501000在干凈試管中加入50μl酶液（對照管不加酶液）和2900μl（對照管加2950μl）pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液，置于37℃水浴中預熱3min，然后加入50μl底物AtchI溶液反應5min，加入1000μlSDS溶液終止反應，最后加入50μl顯色劑DTNB顯色，對照管調零，立即在412nm處測定吸光度，記錄數(shù)值。平行測定3次。比酶活力單位（U/mg）的計算公式為[9]：式中：⊿A412：反應前后吸光度的差值V：反應體系總體積，為3.15mlε：黃色產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)，為1.36×104L·（mol·cm）d：為比色皿寬度（cm），為1cmT：反應時間，為5minC：酶蛋白的濃度（mg/ml）v：酶活測定時所取酶提取液的體積，為0.05（ml）106：摩爾轉化為微摩爾的轉化系數(shù)酶活力可簡單用反應前后的吸光度之差（⊿A）來表征酶活力的大小，⊿A值越大，表示酶活力越大。AChE酶對甲胺磷的敏感性測定根據(jù)2.4.7步驟中測定的酶活活力，調整各種酶液至相等的酶活力,采用2mg/L的甲胺磷做為抑制劑與AChE酶進行反應。具體方法如下[3]：在干凈試管中加入50μL酶液和200μl的抑制劑甲胺磷溶液，搖勻，置于37℃水浴中預熱10min后加入2700μlpH＝8.0的磷酸鹽緩沖液，置于37℃水浴中預熱3min，然后加入50μlAtchl溶液反應5min，立即加入1000μlSDS溶液終止反應，最后加入50μl顯色劑DTNB顯色，以加酶液但不加抑制劑的作為對照管，以不加酶液且不加抑制劑的空白管調零，在412nm處測定吸光度，記錄數(shù)值。平行測定3次。計算公式如下[10]式中U0：未受抑制AChE的比活力U1：受農(nóng)藥抑制AChE的比活力結果與分析不同來源的提取液中蛋白質含量比較對不同來源的提取液中蛋白質含量的測定結果如圖1所示：圖1不同來源的酶液中蛋白質含量比較由圖1可以看出，小麥粉、鯽魚肌肉、蠶蛹頭部和整體中提取的酶液中的蛋白質含量為：蠶蛹中總蛋白質含量最高，達到1.34mg/ml以上，其中來自蠶蛹整體粗酶液的蛋白質含量略高于蠶蛹頭部的；鯽魚肌肉中蛋白質含量為其次，為0.45mg/ml；小麥粉中蛋白質含量最低，為0.26mg/ml。上述結果表明，蠶蛹中可提取得到的酶量最多，可以粗略估計其所含乙酰膽堿酯酶的量最多。不同來源的乙酰膽堿酯酶的比活力比較對不同來源的乙酰膽堿酯酶的比活力測定，結果如圖2所示：圖2不同來源的酶比活力比較由圖2可知，從小麥粉、鯽魚肌肉、蠶蛹頭部和蠶蛹整體中提取的AchE的比酶活力高低依次為：鯽魚肌肉，為0.4396U/mg，蠶蛹整體，為0.3735U/mg；蠶蛹頭部，為0.3239U/mg；小麥粉，為0.1527U/mg。由結果可知，來源于動物的AchE的比活力明顯高于來源于植物的AchE，因此最好選用來源于動物的AchE作為有機磷農(nóng)藥殘留快速檢測的最佳酶制劑乙酰膽堿酯酶對甲胺磷敏感性的比較不同來源的乙酰膽堿酯酶對甲胺磷敏感性的比較結果如圖3所示：圖3不同來源的酶對甲胺磷的敏感性比較由圖3可知，蠶蛹頭部中的乙酰膽堿酯酶對甲胺磷最敏感，受抑制率為17.425％；其次鯽魚肌肉中的乙酰膽堿酯酶，受抑制率為9.091％；小麥粉中的乙酰膽堿酯酶受抑制率為7.576％；而蠶蛹整體中的乙酰膽堿酯酶被抑制率最低，為3.788％。由于甲胺磷能破壞乙酰膽堿酯酶的活性，從表觀上表現(xiàn)為酶活的抑制率。因此，乙酰膽堿酯酶的被抑制率可以從側面上反映出對甲胺磷的敏感性，各種來源的酶在比活力相等的情況下，酶活受抑制率越高，表明該來源的酶對甲胺磷的敏感性越高。同時，蠶蛹的來源較為廣泛，蠶蛹頭部中AChE含量豐富，故選用來自蠶蛹頭部AChE作為酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留的酶制劑。討論小麥粉中的乙酰膽堿酯酶實驗結果表明，從小麥粉中提取的膽堿酯酶與甲胺磷的特異性反應程度最低，其檢測甲胺磷等有機磷類農(nóng)藥靈敏度明顯不及動物來源的乙酰膽堿酯酶。參考文獻可知，植物膽堿酯酶法能檢測出農(nóng)藥殘留是否超標,并且其結果與動物膽堿酯酶法檢測的結果一致[11]，同時具有來源豐富、取材方便、容易保存、價廉易得、成本較低等優(yōu)勢[12]。但是由于植物中的乙酰膽堿酯酶含量低，且酶活性遠低于動物來源的AChE，檢測農(nóng)藥殘留的精確度和靈敏度不如動物膽堿酯酶,不能定量地分析出農(nóng)藥的殘留量。綜上所述，一般不選用植物來源的AchE作為酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留的酶制劑。鯽魚肌肉中的乙酰膽堿酯酶在提取乙酰膽堿酯酶的3種實驗原料中，鯽魚肌肉中的AChE粗酶液與甲胺磷的特異性反應程度居中。雖然有資料表明，成年鯽魚體內(nèi)腦部所含AChE的比活力最高,含量占50%以上；其次是肌肉中AChE的比活力,含量占11.21％；心臟、肝臟、胰臟、腎臟中AChE的比活力大小位居第3,且它們之間AChE的比活力大小差異不顯著[13]。但是由于魚腦乙酰膽堿酯酶的提取因取材較難,不如肌肉組織方便[14]，故實驗中一般為了操作簡單易行，采用鯽魚肌肉作為來源提取AChE。雖然鯽魚肌肉中所含AChE的酶活力最高，但由于其受甲胺磷的抑制作用不如蠶蛹頭部提取的AChE敏感度高，因此，不選用來自鯽魚肌肉的AChE作為酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留的酶制劑。家蠶中的乙酰膽堿酯酶從蠶蛹頭部提取的乙酰膽堿酯酶受甲胺磷的抑制作用最為敏感，其整體提取的酶液敏感性最低。且蠶蛹頭部提取的酶的活性明顯高于植物來源和魚類動物來源的。這是因為家蠶是一種對化學農(nóng)藥等有毒物質非常敏感的昆蟲，極易發(fā)生急性或慢性中毒，且家蠶AChE的活性在幼蟲期變化不大，蛹期比幼蟲期略有增高[7]。參考文獻可知，昆蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),如騷擾角蠅頭部占85%,胸部占12%,腹部僅占3%。也有少數(shù)例外,如棉鈴象甲中,55%的活性在腹部,胸部僅占5%,頭部占40%[15]。實驗表明，AChE主要存在于蠶蛹頭部的神經(jīng)組織中，存在于蠶蛹身體內(nèi)的AChE含量很低。因此，選用來自蠶蛹頭部AChE作為酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留的酶制劑。結論本實驗通過對不同來源的膽堿酯酶（AChE）的比酶活力大小及其對甲胺磷農(nóng)藥的敏感性進行了研究。研究結果表明：由于實驗條件的限制，本實驗從不同來源的原料中提取乙酰膽堿酯酶，沒有采用過凝膠柱純化處理，因此提取所得到酶液的為AChE的粗酶液。動物性AChE的酶活力一般高于植物性AChE，但前者AChE粗酶液容易受到外界環(huán)境的破壞，提取過程中對提取溶液要求更高，同時，不易于保存，保存時間較短。AChE的粗酶液中蛋白質含量與AChE比活力不具有線性相關性，但仍存在一定的聯(lián)系。動物性AChE的酶活性和靈敏性均高于植物性AChE，因此一般選用來源于動物的AChE作為酶制劑。鯽魚肌肉中提取的AChE的粗酶液的比活力比蠶蛹中提取的高，但由于蠶蛹頭部來源的AChE對甲胺磷的敏感性最高，因此選擇來源于蠶蛹頭部的AChE作為最佳農(nóng)藥殘留的檢測用酶。AChE主要存在于蠶蛹頭部的神經(jīng)組織中，存在于蠶蛹身體內(nèi)的AChE含量很低。參考文獻高曉輝,朱光艷.蔬菜上農(nóng)藥殘毒快速檢測技術.農(nóng)藥科學與管理.2000,21(4):29～31楊東鵬,張春榮,董民,等.用于檢測蔬菜有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的酶抑制分光光度法研究進展.有機農(nóng)業(yè)與食品科學.2004,20(2):37～39劉暢,陳福生.農(nóng)藥殘留快速檢測用酶——膽堿酯酶的篩選.分