附件4皮膚吸收體外試驗方法SkinAbsorption:InvitroMethod1范圍本方法規(guī)定了皮膚吸收體外試驗的基本要求和方法。本方法適用于單一成分的化妝品用化學(xué)原料。2試驗?zāi)康念A(yù)測和評價化妝品用化學(xué)原料在離體皮膚中的經(jīng)皮吸收率。3定義3.1受試物testsubstances被測試的化妝品原料，為單一化學(xué)物質(zhì)。3.2吸收量absorbeddose在一定時間內(nèi)透過皮膚的受試物的量。4試驗原理在特定條件下，將受試物（可以是放射標(biāo)記物）暴露于擴散池中的皮膚表面一定時間后，采用適當(dāng)?shù)那逑闯绦蚝头椒ǔテつw表面的受試物。在整個試驗過程中，設(shè)置不同的時間點采集接收液，采用適當(dāng)?shù)姆椒y定受試物或其代謝產(chǎn)物。當(dāng)受試物具有代謝活性時，可以分析受試物的代謝活性產(chǎn)物，試驗結(jié)束后，采用適當(dāng)?shù)姆椒y定受試物及其代謝產(chǎn)物的分布情況。在本方法所描述的條件下，收集接收液和試驗皮膚中的所有受試物，監(jiān)測給定時間內(nèi)受試物的吸收情況（一般試驗周期為24h）。應(yīng)同時測定皮膚表面清洗液中的受試物、留在皮膚里的受試物、接收室中接收液里的受試物，得到受試物在各接收液里的分布和總體回收率。殘留在皮膚角質(zhì)層中的受試物可能會被吸收，參考本方法6數(shù)據(jù)處理和計算部分判定角質(zhì)層的殘留量是否計入皮膚吸收率。5試驗方法5.1擴散池擴散池由供給室和接收室組成（示例圖見圖1），離體皮膚放置于兩者之間。擴散池的供給室和接收室之間應(yīng)有良好的密封性，能較好控制擴散池及其內(nèi)容物的溫度，并保證與皮膚接觸的接收液混合良好和取樣方便（靜態(tài)式或流通池式擴散池均可使用）。正常情況下，供給室在暴露于有限劑量受試物過程中保持開放，但在無限劑量和部分有限劑量的情況下，供給室可以封閉。圖1一種用于皮膚吸收體外試驗的直立式擴散池示例圖5.2接收液接收液應(yīng)優(yōu)先選擇有益于生理的溶液，需提供接收液的精確組分，并證實受試物在接收液中能充分溶解，不影響皮膚吸收和完整性。在循環(huán)流動系統(tǒng)中，流速不能妨礙受試物擴散進(jìn)入接收液。在靜態(tài)滲透式系統(tǒng)中，接收液應(yīng)連續(xù)攪拌。如果研究受試物在皮膚中的代謝效應(yīng)，接收液必須能維持整個試驗過程中皮膚的代謝活性。5.3皮膚制備皮膚來源為動物，首選小型豬。須符合我國相關(guān)倫理要求，首選活性皮膚，也可以使用非活性皮膚，應(yīng)證明皮膚的完整性。采用表皮層（酶、熱或化學(xué)分離的）或用植皮刀分離的皮膚均可以使用。應(yīng)避免使用太厚的皮膚，除非特殊受試物需使用全層皮膚測試。同時還應(yīng)明確皮膚種類、解剖位置以及制備技術(shù)。5.4皮膚完整性應(yīng)正確制備和儲存離體皮膚，使用前檢查皮膚及其屏障的完整性。研究受試物在皮膚的代謝作用時，應(yīng)使用新鮮皮膚，并確保其在試驗過程中的代謝活性。一般新鮮的離體皮膚應(yīng)在24h內(nèi)使用，也可證明在合理可行的情況下，根據(jù)代謝酶系統(tǒng)和貯藏溫度的不同而做適當(dāng)調(diào)整，但在使用前應(yīng)測試和證明其屏障功能的完整性。5.5受試物制備受試物可以采用放射性標(biāo)記或使用其他定量方法。受試樣品的制備盡可能與實際使用的狀態(tài)保持一致，偏離使用情況的制備應(yīng)做合理說明。受試物每個濃度要設(shè)置3個平行皮膚（皮膚來自同一個體），至少進(jìn)行4次重復(fù)試驗（皮膚來自不同個體）。5.6受試物濃度和組成通常將受試物配制成系列濃度，其濃度范圍應(yīng)覆蓋人體實際接觸的可能暴露范圍。受試物配制過程中需確保其穩(wěn)定性和均一性，對于固體、半固體制劑和混懸液，需驗證受試物在溶媒中的均勻性。5.7皮膚暴露根據(jù)人體可能接觸受試物的情況，常選擇有限劑量暴露。劑量應(yīng)模仿人體暴露量，通常固體受試物為2~5mg/cm2，液體受試物最高為10μL/cm2。實際劑量可根據(jù)預(yù)期的上樣條件、研究目標(biāo)或受試物的物理特性進(jìn)行調(diào)整。如皮膚用量為無限劑量時，單位面積的劑量可以加大。5.8溫度受試物皮膚吸收一般屬于被動吸收，受溫度的影響較大，因此試驗時擴散池和皮膚應(yīng)保持恒定接近于皮膚正常溫度32±1℃。不同的擴散池可根據(jù)自身情況調(diào)整水浴或干加熱參數(shù)到一定溫度，以確保離體皮膚溫度在其正常生理標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。實驗室相對濕度保持在30~70%之間。5.9暴露時間和取樣一般情況下接收液的采樣點應(yīng)滿足能夠以作圖形式表現(xiàn)受試物的透皮吸收情況。根據(jù)受試物理化性質(zhì)結(jié)合預(yù)試驗確定合適的采樣頻率，試驗周期內(nèi)通常需要6~12個采樣點。5.10樣品分析對試驗系統(tǒng)的所有組成部分均應(yīng)進(jìn)行分析測定，以確定回收率。其中包括供給室、皮膚表面、皮膚中、接收液/池中的所有受試物。試驗應(yīng)得到足夠的回收率，放射性標(biāo)記試驗的回收率應(yīng)為100±10%，其他定量方法建議回收率應(yīng)為100±15%，若偏離應(yīng)合理解釋，必要時重新進(jìn)行試驗。6數(shù)據(jù)處理和計算應(yīng)列出接收液的分析結(jié)果，不同時間內(nèi)受試物在試驗系統(tǒng)中的分布和吸收情況。對于有限暴露劑量，應(yīng)計算皮膚洗液中受試物的量、與皮膚結(jié)合的數(shù)量（分析不同皮膚層）以及接收液中受試物的量。經(jīng)皮吸收試驗的結(jié)果有時只能用接收液的數(shù)據(jù)表示，對于受試物在試驗結(jié)束時仍殘留于皮膚內(nèi)的情況，總的吸收量要考慮是否扣除角質(zhì)層含量，并結(jié)合化合物作用位置和透過特性給出合理解釋。無限劑量暴露試驗時不做吸收百分比的計算?；厥章视嬎愎剑夯厥章?注：*代表皮膚中的量包含角質(zhì)層、活性表皮層和真皮層的總和皮膚吸收率計算公式：皮膚吸收率=注：#是否去除角質(zhì)層應(yīng)給予合理說明

附錄皮膚吸收體外試驗方法應(yīng)用示例（咖啡因）1試驗?zāi)康谋敬卧囼灨鶕?jù)《皮膚吸收體外試驗方法》文件中的基本原則，參考相關(guān)文獻(xiàn)中具體方法，研究咖啡因在離體豬皮膚的吸收特性，定量分析咖啡因的透皮吸收率。本試驗是以水溶性成分咖啡因為研究對象獲得其皮膚透過率，因角質(zhì)層中咖啡因含量較少，故在計算皮膚吸收率時未計入皮膚吸收量中。條件不同數(shù)據(jù)會產(chǎn)生變化，本示例中的所有設(shè)備參數(shù)僅供參考。2受試物和皮膚類型試驗使用咖啡因（MW=194.2Dal，LogPo/w=-0.07，水中溶解度=21.6mg/mL25℃）作為受試物。皮膚模型：3月齡巴馬小型豬背部或腹部皮膚。貯藏條件：制備后-20℃凍存，10天內(nèi)用完，凍融不超過2次。3試劑和設(shè)備耗材3.1試劑生理鹽水、甲醇（色譜級）、磷酸（色譜級）。3.2設(shè)備透皮吸收擴散儀（配備適宜的池體，能保證受試物于接收液中均勻擴散）、超高效液相色譜儀、經(jīng)皮水分流失測定儀、渦旋混勻器、離心機。3.3耗材色譜柱、離心管、2mL進(jìn)樣瓶、移液器、槍頭、0.22μm尼龍濾膜、皮膚膠帶、刀片、取皮刀、外科剪刀、1mL注射器、吸水紙、棉簽、離體豬皮。4試驗方法4.1受試物制備經(jīng)預(yù)試驗研究確定，配制0.1%、0.3%、1.0%三種濃度咖啡因溶液。取樣該溶液，經(jīng)前處理、稀釋等步驟，用液相檢測并計算溶液中咖啡因?qū)嶋H含量，用以計算實際加樣量。將配好的咖啡因溶液在試驗條件下放置24h取樣，檢測咖啡因含量有無變化。4.2接收液保證其滿足漏槽條件，即接收液的體積至少是咖啡因達(dá)到飽和溶解時所需介質(zhì)體積的3~10倍。配制好的接收液pH值應(yīng)保持在pH6.5~7.5范圍內(nèi)。根據(jù)溶液中咖啡因濃度和加樣體積估算不同時間點的可能最高和最低濃度設(shè)計濃度曲線，于0.5h、1h、2h、4h、8h、24h取樣，測定咖啡因在接收液中的穩(wěn)定性。4.3離體豬皮的制備離體豬皮采自豬背或腹側(cè)皮膚，符合相關(guān)動物倫理要求，保證豬皮角質(zhì)屏障的完整性（如不可采用熱水淋洗或刮毛，以確保皮膚角質(zhì)層完整性等）。用吸水紙吸干皮膚表面生理鹽水，制成肉眼觀察未受損傷、面積大小合適的皮膚備用。本試驗中同一濃度受試物設(shè)置3個平行皮膚（皮膚來自同一個體）重復(fù)4次（皮膚來自不同個體）。4.4皮膚完整性檢查使用經(jīng)皮水分流失儀測定豬皮角質(zhì)層經(jīng)皮水分流失值（TEWL）<15g/m2/h的皮膚才可用于試驗。加入受試物前調(diào)整溫度到32±1℃并保持穩(wěn)定，將皮膚固定在擴散池的供給室和接收室之間，皮膚角質(zhì)層朝向供給室，真皮層一側(cè)朝向接收室，并通過補液管向接收室中加入接收液，去除接收液與皮膚間的氣泡，確保豬皮與接收液完全接觸，開啟磁力攪拌器，轉(zhuǎn)速設(shè)為600rpm，擴散池體系在此狀態(tài)下平衡30~45min。5試驗步驟5.1上樣向接收室中加入接收液。通過加樣管加入接收液并準(zhǔn)確記錄接收液體積。接收液注入接收室后，去除皮膚與接收液接觸面滯留的氣泡，確保皮膚與接收液完全接觸。該擴散池體系在正常試驗條件下平衡30~45min，驗證皮膚完整性之后，方可加樣處理。向供給室中皮膚表面加入咖啡因測試溶液，并設(shè)置不含咖啡因的生理鹽水作為陰性對照。用移液器按照10μL/cm2的比例，將根據(jù)供給室內(nèi)徑面積計算所得體積的咖啡因溶液，均勻涂布于皮膚表面。試驗期間保持實驗室環(huán)境濕度為30~70%RH。設(shè)置磁力攪拌器以600rpm的速度攪拌，保持32±1℃恒溫水浴。5.2取樣分別于0.5h、1h、2h、4h、8h、24h時間點用注射器/自動取樣裝置取樣，具體取樣體積可根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果自行確定。0.22μm尼龍濾膜過濾后待測。供給室清洗：暴露結(jié)束后每次使用1mL生理鹽水清洗15次，將所有清洗液合并待測。皮膚表面殘留受試物清洗：皮膚暴露24h后每次使用3mL生理鹽水清洗3次，將所有清洗液合并震蕩，使用0.22μm尼龍濾膜過濾后待測。角質(zhì)層：受試皮膚在干燥條件下，使用皮膚膠帶進(jìn)行角質(zhì)層取樣，重復(fù)20次。取樣后將所有20張膠帶置于50mL離心管中，加入20mL甲醇震蕩過夜提取、離心，提取液過濾后待測。除去角質(zhì)層后的皮膚：去除角質(zhì)層后的皮膚剪碎，加入10mL甲醇過夜提取，離心取上清液過濾后待測。5.3檢測儀器：超高效液相色譜儀（UPLC）色譜柱：C18反相色譜柱流動相：A（0.1%磷酸水溶液）和B（0.1%磷酸甲醇溶液）A:B=9:1流速：0.25mL/min進(jìn)樣量：2μL柱溫：30℃時間：14min 檢測波長：280nm6數(shù)據(jù)分析6.1皮膚吸收率皮膚吸收率=其中Q：接收液中咖啡因總量；N:除角質(zhì)層皮膚中咖啡因總量。6.2累計皮下滲透量QnQn=C其中Cn：各時間點濃度；Ci：樣品收集時間點i的濃度，i為1~n-1；Vi：各樣品收集時間點i的取樣體積1mL；V0：接收池體積為8mL。6.3回收率回收率=其中Q：接收液中咖啡因總量；W：皮膚表面殘留受試物+供給室中咖啡因總量；M：角質(zhì)層中咖啡因總量；N：除角質(zhì)層后皮膚中咖啡因總量；回收率應(yīng)在100±15%范圍內(nèi)。附件5免疫毒性試驗方法Immunotoxicitytest1范圍本方法規(guī)定了動物免疫毒性試驗的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品原料的免疫毒性檢測。 2試驗?zāi)康谋痉椒ㄓ糜谠u價化妝品原料免疫毒性反應(yīng)的潛在可能性。3定義3.1免疫毒性immunotoxicity受試物對機體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能造成損害作用的能力，包括機體免疫系統(tǒng)的組織或器官損傷、免疫功能的抑制或增強。3.2體液免疫h(yuǎn)umoralimmunity抗原進(jìn)入機體后，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)B細(xì)胞和記憶細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生抗體，與相應(yīng)的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。3.3細(xì)胞免疫cell-mediatedimmunity又稱細(xì)胞介導(dǎo)免疫。狹義的細(xì)胞免疫僅指T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，即T細(xì)胞受到抗原刺激后，分化、增殖、轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞，對抗原的直接殺傷作用及致敏T細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子的協(xié)同殺傷作用。T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的特征是出現(xiàn)以單核細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)和/或特異性的細(xì)胞毒性。廣義的細(xì)胞免疫還包括原始的吞噬作用以及NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。4試驗的基本原則本方法用于評價受試物是否改變或損傷免疫系統(tǒng)的機能狀態(tài)。免疫毒性試驗應(yīng)分層級開展，初始篩選免疫毒性試驗是在重復(fù)劑量毒性試驗免疫毒性相關(guān)檢查基礎(chǔ)上增加淋巴細(xì)胞亞群分布、免疫球蛋白含量測定等項目。初始篩選試驗提示存在免疫毒性風(fēng)險時，則需開展附加免疫毒性試驗。附加免疫毒性試驗時，給予不同劑量組受試物至少28d，每天對動物進(jìn)行觀察，記錄所出現(xiàn)的任何臨床毒性表現(xiàn)。給予受試物結(jié)束后處死動物，對相應(yīng)的評價指標(biāo)進(jìn)行檢測或分析。5初始篩選免疫毒性試驗5.1初始篩選試驗方法采用初始篩選免疫毒性試驗，對受試物潛在免疫毒性進(jìn)行初步評估。初始篩選試驗可整合至重復(fù)劑量毒性試驗中。為發(fā)現(xiàn)免疫毒性指征，需評價以下指標(biāo)：（1）血液學(xué)檢查：白細(xì)胞總數(shù)及分類計數(shù)等。（2）血液生化檢查：球蛋白、白蛋白/球蛋白比值。（3）大體病理學(xué)檢查：淋巴器官/組織。（4）臟器重量/臟器系數(shù)：胸腺、脾臟的濕重，必要時可選代表性淋巴結(jié)進(jìn)行稱重，并計算臟器系數(shù)。（5）組織病理學(xué)檢查：胸腺、脾臟、骨髓（股骨、胸骨或肋軟骨部位的骨髓）、有代表性的淋巴結(jié)（黏膜附近或周圍淋巴結(jié)）、所有肉眼可見的損傷。此外，免疫毒性初始篩選試驗還應(yīng)增加以下指標(biāo)的檢測：（1）免疫球蛋白分類（IgG、IgM、IgA和IgE）水平測定。（2）淋巴細(xì)胞亞群測定：該試驗屬于免疫表型分析，目的是對淋巴細(xì)胞亞型進(jìn)行鑒定和計數(shù)，通常采用流式細(xì)胞儀測試。對全血、外周血或從淋巴組織分離的免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等進(jìn)行計數(shù)；檢測免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物的改變，評估CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞或其它亞群的數(shù)量及比值。5.2試驗結(jié)果的評價初始篩選試驗結(jié)果，應(yīng)基于淋巴細(xì)胞亞群分布、免疫球蛋白分類的結(jié)果，并考慮重復(fù)劑量毒性試驗中的免疫毒性相關(guān)檢查，如血液學(xué)、血清免疫球蛋白含量、免疫器官重量、組織病理學(xué)（胸腺、脾、淋巴結(jié)）等結(jié)果進(jìn)行綜合評價。上述檢查項目出現(xiàn)異常時，即受試物各劑量組與溶劑對照組比較存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異（但應(yīng)考慮動物正常的參考范圍和變化，存在毒理學(xué)意義的改變），提示受試物存在潛在免疫毒性風(fēng)險，應(yīng)開展附加免疫毒性試驗研究，以驗證受試物潛在的免疫毒性，并明確免疫細(xì)胞和免疫功能受影響的程度。6附加免疫毒性試驗附加免疫毒性試驗包括：體液免疫、特異性細(xì)胞免疫、巨噬細(xì)胞檢測、NK細(xì)胞活性四個方面，每個方面應(yīng)至少選擇一種試驗方法進(jìn)行。6.1體液免疫試驗給予受試物后用抗原免疫動物，采用抗體形成細(xì)胞試驗（也稱溶血空斑試驗）方法或酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測抗體滴度的方法評價受試物對體液免疫的影響。6.1.1抗體形成細(xì)胞試驗（AntibodyPlagueFormingCell，PFC）受試物固體受試物應(yīng)溶解或懸浮于合適的溶劑中，臨用前稀釋至適當(dāng)濃度；液體受試物可以直接加入試驗系統(tǒng)和/或臨用前稀釋至適當(dāng)濃度。受試物應(yīng)在臨用前新鮮配制，否則須確認(rèn)貯存不影響其穩(wěn)定性。實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境.1動物種系的選擇選用健康嚙齒類動物，推薦使用小鼠（近交系）或大鼠。如果已知受試物對其中一種性別的動物更敏感，則應(yīng)使用這種性別的動物。雌性動物應(yīng)未孕、未產(chǎn)。試驗開始時每一性別的動物體重差異應(yīng)控制在±20%內(nèi)。.2動物的性別和數(shù)量 每一個劑量組和對照組至少應(yīng)該有20只動物（雌雄各半）。若計劃在試驗過程中處死動物，則應(yīng)增加計劃處死的動物數(shù)。.3飼養(yǎng)環(huán)境實驗動物和實驗動物設(shè)施應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，不限制飲水量。劑量分組至少要設(shè)三個劑量組、一個溶劑對照組和一個陽性對照組，如果受試物采用未知免疫毒性的溶劑時，還應(yīng)設(shè)立一個不作任何處理的空白對照組。高劑量應(yīng)不使動物產(chǎn)生明顯的應(yīng)激、營養(yǎng)不良或死亡，但最好可使動物產(chǎn)生一些可測量的一般中毒表現(xiàn)。低劑量最好不使動物產(chǎn)生任何免疫毒性作用。陽性對照組可選用已知的免疫抑制劑（如環(huán)磷酰胺等）作為陽性對照物。受試物給予開始給予受試物前至少要有3~5d時間使實驗動物適應(yīng)實驗室飼養(yǎng)環(huán)境。實驗動物隨機分組。受試物或溶劑經(jīng)口和/或經(jīng)皮和/或經(jīng)吸入給予，給予受試物途徑一般與90d重復(fù)劑量毒性試驗的途徑一致。每周給予受試物7d，至少28d。臨床觀察試驗期間，每天對動物至少進(jìn)行1次臨床觀察，記錄毒性癥狀的出現(xiàn)時間、嚴(yán)重程度及其持續(xù)時間。觀察應(yīng)包括但不限于以下方面：皮膚、被毛；眼、黏膜；呼吸系統(tǒng)；自主性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)；循環(huán)系統(tǒng)；肢體運動功能；行為特征；抗感染能力等。每周測量1次動物的攝食量。動物給予受試物前稱體重，之后每周1次，處死前再次稱體重。任何瀕死動物一被發(fā)現(xiàn)應(yīng)與其他動物分開并被安樂死。對試驗過程中任何瀕死的或死亡的動物都應(yīng)進(jìn)行大體解剖。試驗方法給予受試物結(jié)束前4d，經(jīng)靜脈注射T細(xì)胞依賴性抗原綿羊紅細(xì)胞（SRBCs），通過計數(shù)動物脾臟中特異性抗體生成細(xì)胞的數(shù)量來反映抗體的產(chǎn)量，可用于檢測受試物對脾臟內(nèi)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的毒性作用。試驗時，應(yīng)考慮如下因素：（1）注射T細(xì)胞依賴性抗原SRBCs，應(yīng)對動物注射抗原后測定PFC的最佳時間作出評價。（2）測定每批補體的活性。（3）使用雙盲法進(jìn)行PFC計數(shù)。（4）測定脾細(xì)胞的活性。6.1.2免疫球蛋白定量測定受試物、實驗動物、劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。試驗方法在給予受試物結(jié)束前4d，用牛血清白蛋白免疫動物，2周后再次用抗原免疫動物，然后測定每只動物血清中IgG和IgM的滴度。測定抗體滴度的時間點應(yīng)足夠多（通常選擇3~5個），以便對受試物組和對照組動物的初級抗體反應(yīng)和次級抗體反應(yīng)進(jìn)行比較。測定抗體時受試物的給予時間至少為28d。試驗時，應(yīng)考慮測定血清中IgG和IgM滴度的方法應(yīng)足夠敏感以便測得每只動物的IgG和IgM滴度。該試驗評價受試物是否影響抗體對抗原的反應(yīng)性。6.2特異性細(xì)胞免疫試驗采用下列3種試驗方法中的任一種進(jìn)行試驗，評價給予受試物至少28d對特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響。如選擇淋巴細(xì)胞增殖試驗或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞檢測，可與NK細(xì)胞活性共用一組動物。6.2.1淋巴細(xì)胞增殖試驗受試物、實驗動物、劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。試驗方法可通過測量放射性標(biāo)記物（一般為3H-胸腺嘧啶，簡稱3H-TdR）摻入DNA的量來說明淋巴細(xì)胞的增殖，也可采用MTT、BrdU-ELISA/FCM法等方法。該方法可以證明給予受試物至少28d對同種異品系淋巴細(xì)胞刺激引起的淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。采用3H-TdR摻入試驗時，應(yīng)對如下因素進(jìn)行考慮：（1）應(yīng)答細(xì)胞來自對照組和受試物組動物的脾細(xì)胞，在無菌條件下制備脾細(xì)胞。應(yīng)答細(xì)胞的DNA合成沒有采取阻斷處理。（2）刺激細(xì)胞來自未給予受試物的同種異品系動物的脾細(xì)胞，在無菌條件下制備脾細(xì)胞。刺激細(xì)胞的DNA合成用絲裂霉素或X線處理進(jìn)行阻斷。（3）測定應(yīng)答細(xì)胞和刺激細(xì)胞的活力。（4）應(yīng)設(shè)3份或4份對照，保證刺激細(xì)胞的非反應(yīng)性、測定DNA合成的基礎(chǔ)水平。（5）對空白對照和溶劑對照同時進(jìn)行測定。（6）用每個培養(yǎng)皿中摻入應(yīng)答細(xì)胞的放射性標(biāo)記物的量來表示脾細(xì)胞的增殖程度，表示為每分鐘居里數(shù)（curieperminute，CPM）。要計算凈CPM（nCPM），即應(yīng)答細(xì)胞被刺激細(xì)胞刺激后摻入的CPM均值減去未經(jīng)刺激的脾細(xì)胞摻入CPM的均值。受試物組與對照組差異的百分比表示為：[1-（受試物組nCPM/對照組nCPM）]。（7）不同的淋巴細(xì)胞增殖試驗存在許多不同，應(yīng)說明所引用的試驗方法及詳細(xì)的試驗步驟，說明主要試劑的來源，最好也說明這些試劑的純度。（8）為了證明方法的靈敏性，應(yīng)設(shè)立陽性對照組，給予已知的免疫抑制劑。6.2.2遲發(fā)型過敏（Delayed-typeHypersensitivity，DTH）反應(yīng)受試物同。實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境選用近交系小鼠，如果已知受試物對其中一種性別的動物更敏感，則應(yīng)使用這種性別的動物。雌性動物應(yīng)未孕、未產(chǎn)。動物6~8周齡時開始試驗，試驗開始時每一性別的動物體重差異應(yīng)控制在±20%內(nèi)。動物的性別和數(shù)量、飼養(yǎng)環(huán)境同。劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。試驗方法在給予受試物結(jié)束前4d，用牛血清白蛋白致敏動物，1~2周后用相同的抗原進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)后24~48h，比較受試物組和對照組DTH反應(yīng)的差異，以激發(fā)前后反應(yīng)的差值來表示DTH的程度。該方法是一種檢測受試物對實驗動物誘導(dǎo)性DTH影響的體內(nèi)方法。開展該試驗時，應(yīng)對如下因素進(jìn)行考慮：（1）DTH檢測方法有數(shù)種，如耳腫脹法、足跖增厚法等，應(yīng)選用靈敏度高、可重復(fù)性好、并適用于所選用實驗動物品系的方法；不同的方法中下列參數(shù)也可能不同，如致敏及激發(fā)動物所用抗原的性質(zhì)，免疫注射的次數(shù)及途徑，免疫激發(fā)的時間，同位素的使用等。試驗時選用的這些參數(shù)及其他相關(guān)的參數(shù)應(yīng)可以使所選用的實驗動物產(chǎn)生足夠的DTH反應(yīng)。（2）測定DTH反應(yīng)前，應(yīng)對動物給予受試物至少28d。6.2.3細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CytotoxicT-lymphocyte，CTL）檢測受試物、實驗動物、劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。試驗方法該方法用于證明給予受試物至少28d對CTL生成的影響。常取動物脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞試驗，檢測采用放射免疫法或流式細(xì)胞術(shù)。放射法使用同種異品系腫瘤抗原對CTL進(jìn)行誘導(dǎo)（體內(nèi)或體外誘導(dǎo)），然后，來自受試物組和對照組動物的脾細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的同種異品系腫瘤細(xì)胞共孵育4h后，腫瘤細(xì)胞所釋放的放射性標(biāo)記物的量可以說明T淋巴細(xì)胞溶解腫瘤細(xì)胞的能力。試驗時，考慮如下因素：（1）應(yīng)設(shè)立對照組來測定效應(yīng)細(xì)胞不存在時靶細(xì)胞釋放的放射性標(biāo)記物的本底量和放射性標(biāo)記物的總釋放量。（2）應(yīng)可以證明試驗中所選用的動物可產(chǎn)生CTLs，所選用的試驗方法應(yīng)適合于誘導(dǎo)動物CTL的生成。（3）CTL檢測有數(shù)種不同的方法，引用某一種方法時應(yīng)做到完全引用，對方法進(jìn)行修改時應(yīng)予以說明，合適的情況下應(yīng)說明主要試劑的來源、活性和/或純度。6.3NK細(xì)胞的活性6.3.1受試物、實驗動物、劑量分組、受試物給予方式及臨床觀察同~。6.3.2試驗方法建議采用Reynolds和Herberman的微量培養(yǎng)法來檢測給予受試物至少28d對NK細(xì)胞活性的影響，也可采用LDH釋放法等其他適合的方法。微量培養(yǎng)法是將受試物組和對照組動物的脾細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的YAC淋巴瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)4h后，靶細(xì)胞中釋放的放射性標(biāo)記物的量可用于表示NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。LDH釋放法是將受試物組和對照組動物的脾細(xì)胞與靶細(xì)胞（YAC細(xì)胞）共培養(yǎng)。靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)4h后，靶細(xì)胞中釋放的乳酸脫氫酶含量可用于表示NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。開展該試驗時，應(yīng)對如下因素進(jìn)行考慮：（1）應(yīng)設(shè)立幾個對照以說明在沒有效應(yīng)細(xì)胞存在時，靶細(xì)胞釋放放射性標(biāo)記物或乳酸脫氫酶的本底量以及放射性標(biāo)記物或乳酸脫氫酶總的釋放量。（2）試驗可使用除YAC細(xì)胞之外的靶細(xì)胞，任何情況下都應(yīng)測定靶細(xì)胞的存活力。（3）引用某一種方法時應(yīng)做到完全引用，對方法進(jìn)行修改時應(yīng)予以說明，合適的情況下應(yīng)說明主要試劑的來源、活性和/或純度