PCR實驗室知識及新冠檢測生物安全培訓(xùn)考試(試題及答案)一、單項選擇題（每題2分，共30分）1.PCR實驗室核心工作區(qū)域中，需設(shè)置為正壓環(huán)境的是：A.試劑準備區(qū)B.樣本處理區(qū)C.擴增區(qū)D.產(chǎn)物分析區(qū)答案：A解析：PCR實驗室為防止交叉污染，試劑準備區(qū)需保持正壓（相對于相鄰區(qū)域），避免外界空氣進入污染試劑；樣本處理區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)通常為負壓或與外界壓差更小。2.新冠病毒核酸檢測中，樣本處理時使用的生物安全柜應(yīng)符合：A.Ⅰ級生物安全柜B.Ⅱ級A1型生物安全柜C.Ⅱ級B2型生物安全柜D.Ⅲ級生物安全柜答案：C解析：新冠病毒屬于乙類傳染病病原（按甲類管理），樣本處理涉及可能產(chǎn)生氣溶膠的操作（如加樣、離心），需使用Ⅱ級B2型（全排型）生物安全柜，確保操作區(qū)空氣經(jīng)高效過濾器（HEPA）過濾后直接外排，避免污染實驗室環(huán)境。3.新冠檢測實驗室工作人員穿戴防護裝備的正確順序是：A.戴口罩→穿防護服→戴護目鏡→戴手套→穿鞋套B.穿鞋套→穿防護服→戴口罩→戴護目鏡→戴手套C.戴口罩→戴護目鏡→穿防護服→戴手套→穿鞋套D.穿鞋套→戴口罩→穿防護服→戴護目鏡→戴手套答案：D解析：正確順序為：先穿鞋套（固定防護基礎(chǔ)）→戴醫(yī)用防護口罩（調(diào)整鼻夾）→穿防護服（拉好拉鏈、密封頸部）→戴護目鏡/面屏（調(diào)整至合適位置）→戴雙層手套（內(nèi)層緊貼合手，外層覆蓋防護服袖口）。4.新冠樣本保存運輸時，若無法2小時內(nèi)送檢，應(yīng)置于：A.4℃冰箱（28℃）B.20℃冰箱C.室溫（1825℃）D.37℃孵箱答案：A解析：根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南（第四版）》，樣本采集后應(yīng)在2小時內(nèi)送到實驗室；若2小時內(nèi)無法送檢，應(yīng)置于4℃（28℃）保存，保存時間不超過48小時；需長期保存則應(yīng)置于70℃以下。5.PCR實驗室避免交叉污染的關(guān)鍵措施不包括：A.各區(qū)專用設(shè)備（移液器、離心機等）B.嚴格單向工作流程（試劑準備→樣本處理→擴增→產(chǎn)物分析）C.所有區(qū)域使用同一套清潔工具D.每次實驗后進行環(huán)境消毒（如紫外線照射、75%乙醇擦拭）答案：C解析：PCR實驗室需分區(qū)使用專用清潔工具（如抹布、拖布），避免不同區(qū)域的工具交叉使用導(dǎo)致污染；其他選項均為關(guān)鍵防污染措施。6.新冠檢測實驗室醫(yī)療廢物處理時，感染性廢物應(yīng)裝入：A.黃色醫(yī)療廢物袋（雙層）B.黑色生活垃圾袋C.紅色危險廢物袋D.藍色可回收袋答案：A解析：新冠檢測產(chǎn)生的感染性廢物（如樣本管、移液器吸頭、防護服等）需裝入雙層黃色醫(yī)療廢物袋，分層鵝頸式封口，標注“新冠病毒感染性廢物”，暫存于專用暫存柜，由有資質(zhì)的醫(yī)療廢物處置單位48小時內(nèi)轉(zhuǎn)運。7.進行新冠樣本核酸提取時，若離心管意外破裂，正確的應(yīng)急處理是：A.立即用手清理碎片，再用75%乙醇消毒B.停止操作，關(guān)閉生物安全柜，靜置30分鐘后，戴手套用吸水紙覆蓋（含有效氯2000mg/L消毒液），作用30分鐘后清理C.直接用含氯消毒液噴灑，繼續(xù)操作D.打開生物安全柜風機最大檔，快速吹散氣溶膠答案：B解析：離心管破裂可能產(chǎn)生氣溶膠，需立即停止操作，關(guān)閉生物安全柜風機（避免氣溶膠擴散），靜置30分鐘讓氣溶膠沉降；隨后戴手套用浸有2000mg/L有效氯消毒液的吸水紙覆蓋污染區(qū)域，作用30分鐘后清理，再用消毒液擦拭臺面，最后紫外線照射30分鐘。8.PCR實驗室空氣質(zhì)量檢測的關(guān)鍵指標是：A.二氧化碳濃度B.塵埃粒子數(shù)（≥0.5μm）C.溫度（22±2℃）D.相對濕度（50±10%）答案：B解析：PCR實驗室屬于生物安全二級實驗室（BSL2），需符合《實驗室生物安全通用要求》（GB194892008），其中空氣質(zhì)量關(guān)鍵指標為塵埃粒子數(shù)（≥0.5μm的粒子數(shù)≤352000個/m3），確保實驗環(huán)境潔凈度。9.新冠病毒核酸檢測結(jié)果判讀時，“N基因陽性、ORF1ab基因陰性”的可能原因是：A.樣本中病毒載量極低，僅部分靶基因擴增B.引物探針失效C.擴增儀溫度異常D.樣本被污染（如強陽性樣本氣溶膠污染）答案：A解析：新冠病毒核酸檢測通常檢測2個靶基因（如N、ORF1ab），若僅1個陽性，可能因病毒載量低（如處于感染早期），需結(jié)合Ct值（一般≤35）及臨床癥狀復(fù)核；若Ct值＞35或重復(fù)檢測仍單靶標陽性，需考慮假陽性可能（如污染）。10.實驗室工作人員發(fā)生職業(yè)暴露（如樣本濺入眼內(nèi)），應(yīng)立即：A.用生理鹽水沖洗眼睛15分鐘，報告負責人B.用手揉搓眼睛，再用清水沖洗C.繼續(xù)完成實驗后處理D.自行服用抗病毒藥物預(yù)防答案：A解析：職業(yè)暴露后需立即進行局部處理（如眼暴露用生理鹽水或流動清水沖洗15分鐘），同時報告實驗室負責人，啟動暴露后預(yù)防措施（如評估是否需要隔離觀察、核酸檢測）。11.PCR實驗室“三區(qū)兩緩”中的“兩緩”指：A.試劑準備區(qū)緩沖間、樣本處理區(qū)緩沖間B.清潔區(qū)緩沖間、污染區(qū)緩沖間C.擴增區(qū)緩沖間、產(chǎn)物分析區(qū)緩沖間D.更衣間、淋浴間答案：A解析：PCR實驗室標準布局為“三區(qū)兩緩”，即試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增及產(chǎn)物分析區(qū)，以及試劑準備區(qū)與樣本處理區(qū)之間的緩沖間、樣本處理區(qū)與擴增區(qū)之間的緩沖間，用于人員換鞋、穿脫防護裝備，減少區(qū)域間交叉污染。12.新冠樣本接收時，需核對的關(guān)鍵信息不包括：A.樣本編號與申請單是否一致B.樣本類型（咽拭子/鼻拭子）C.樣本采集時間D.被檢者家庭住址答案：D解析：樣本接收需核對：樣本編號、類型、采集時間、保存條件（如是否4℃運輸）、被檢者姓名/ID、申請檢測項目等；家庭住址不屬于實驗室檢測必需信息。13.生物安全實驗室中，“定向氣流”的作用是：A.保持室內(nèi)溫度均勻B.防止污染空氣流向清潔區(qū)域C.降低濕度D.提高通風效率答案：B解析：定向氣流指空氣從清潔區(qū)（如試劑準備區(qū)）流向污染區(qū)（如產(chǎn)物分析區(qū)），形成負壓梯度（如試劑準備區(qū)＞樣本處理區(qū)＞擴增區(qū)），防止污染空氣逆流到清潔區(qū)，避免交叉污染。14.新冠檢測使用的一次性病毒采樣管（含保存液）屬于：A.Ⅰ類醫(yī)療器械B.Ⅱ類醫(yī)療器械C.Ⅲ類醫(yī)療器械D.普通耗材答案：B解析：根據(jù)《醫(yī)療器械分類目錄》，病毒采樣管（含滅活型/非滅活型保存液）用于樣本采集、運輸，屬于Ⅱ類醫(yī)療器械（管理類別：6840臨床檢驗分析儀器及體外診斷試劑）。15.PCR擴增儀的溫度校準周期通常為：A.1個月B.3個月C.6個月D.12個月答案：C解析：PCR擴增儀的溫度準確性直接影響檢測結(jié)果，需每6個月由計量機構(gòu)校準一次，確保各孔溫度偏差≤±0.5℃，升溫/降溫速率符合儀器要求。二、判斷題（每題1分，共10分）1.PCR實驗室可以在樣本處理區(qū)同時處理新冠樣本和其他病原體樣本。（）答案：×解析：樣本處理區(qū)需專用于同一類型樣本（如新冠樣本），避免不同病原體交叉污染。2.新冠檢測實驗室的工作人員只需在樣本處理區(qū)佩戴N95口罩，其他區(qū)域可佩戴醫(yī)用外科口罩。（）答案：×解析：新冠檢測屬于BSL2實驗室加強型操作，所有工作區(qū)域（包括試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)）均需佩戴醫(yī)用防護口罩（如N95），并與護目鏡/面屏配合使用。3.醫(yī)療廢物袋裝滿后（超過3/4）需立即封口，避免遺漏。（）答案：×解析：醫(yī)療廢物袋應(yīng)裝至3/4滿時封口，避免過滿導(dǎo)致袋體破裂，增加暴露風險。4.PCR實驗中，陽性對照可以使用高濃度質(zhì)粒標準品替代臨床陽性樣本。（）答案：√解析：為避免臨床陽性樣本的生物安全風險，PCR實驗的陽性對照通常使用經(jīng)滅活的高濃度質(zhì)粒標準品或假病毒，其擴增特性與真實病毒一致。5.實驗室冰箱內(nèi)可以同時存放檢測樣本和個人食品。（）答案：×解析：實驗室冰箱為專用設(shè)備，嚴禁存放個人物品或食品，防止交叉污染及誤食風險。6.新冠樣本離心時，必須使用帶螺旋蓋的離心管，并在生物安全柜內(nèi)進行平衡。（）答案：√解析：螺旋蓋離心管可防止液體泄漏，平衡操作在生物安全柜內(nèi)進行可避免樣本氣溶膠擴散到實驗室環(huán)境。7.實驗室紫外線消毒燈的有效照射距離為12米，照射時間應(yīng)≥30分鐘。（）答案：√解析：紫外線消毒的有效性與距離和時間相關(guān)，有效距離12米時，需照射30分鐘以上才能達到殺菌效果（對新冠病毒的滅活需≥30分鐘）。8.進行PCR試劑配制時，移液器可以在不同區(qū)域共用，只需每次使用后用75%乙醇擦拭。（）答案：×解析：PCR各區(qū)域需使用專用移液器（固定分區(qū)），避免交叉污染；即使擦拭，仍可能殘留核酸片段導(dǎo)致污染。9.新冠檢測結(jié)果為“陰性”時，無需記錄原始擴增曲線，只需保存報告即可。（）答案：×解析：根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》，檢測原始數(shù)據(jù)（包括擴增曲線、Ct值）需保存至少2年，以備追溯。10.實驗室發(fā)生火災(zāi)時，應(yīng)優(yōu)先搶救實驗樣本和設(shè)備，再撤離人員。（）答案：×解析：實驗室安全中“人員安全優(yōu)先”，發(fā)生火災(zāi)時應(yīng)立即撤離至安全區(qū)域，撥打火警電話，禁止返回搶救物品。三、簡答題（每題6分，共30分）1.簡述PCR實驗室的四個核心功能分區(qū)及其主要功能。答案：PCR實驗室的四個核心功能分區(qū)為：（1）試劑準備區(qū)：用于儲存、配制和分裝PCR反應(yīng)所需的試劑（如引物、探針、dNTP、Taq酶等），需避免核酸污染，配備專用冰箱、移液器、離心機等設(shè)備。（2）樣本處理區(qū)：用于樣本的接收、登記、前處理（如核酸提?。┘凹訕?，需處理可能含活病毒的樣本（如未滅活的咽拭子），需在生物安全柜內(nèi)操作，配備核酸提取儀、生物安全柜等。（3）擴增區(qū)：用于PCR擴增反應(yīng)的設(shè)置（將提取的核酸加入反應(yīng)體系）及擴增儀運行，需避免擴增產(chǎn)物污染，配備PCR擴增儀、離心機等。（4）產(chǎn)物分析區(qū)：用于擴增產(chǎn)物的檢測（如瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光讀?。菍嶒炇抑泻怂嵛廴撅L險最高的區(qū)域，配備凝膠成像系統(tǒng)、熒光分析儀等。2.列舉新冠檢測實驗室生物安全防護的5項關(guān)鍵措施。答案：（1）人員防護：穿戴醫(yī)用防護口罩（N95及以上）、護目鏡/面屏、防護服、雙層手套、鞋套，接觸污染物后及時手消毒（如含醇速干手消毒劑）。（2）環(huán)境控制：實驗室保持定向氣流（清潔區(qū)→污染區(qū)），各區(qū)域壓差符合要求（如試劑準備區(qū)+10Pa，樣本處理區(qū)10Pa）；每日實驗前后進行環(huán)境消毒（紫外線照射≥30分鐘，75%乙醇或2000mg/L含氯消毒液擦拭臺面）。（3）操作規(guī)范：樣本處理在Ⅱ級B2型生物安全柜內(nèi)進行，避免氣溶膠產(chǎn)生（如緩慢開蓋、離心管平衡后密封）；使用一次性吸頭（帶濾芯），避免交叉污染。（4）廢物管理：感染性廢物雙層黃色袋包裝，鵝頸式封口，標注“新冠病毒感染性廢物”，暫存于專用柜，48小時內(nèi)由資質(zhì)單位轉(zhuǎn)運；實驗廢液經(jīng)2000mg/L含氯消毒液作用30分鐘后排放。（5）健康監(jiān)測：工作人員每日測量體溫，定期進行核酸檢測（至少每周1次）；建立暴露登記制度，發(fā)生職業(yè)暴露后立即處理并報告。3.簡述新冠病毒核酸檢測的主要流程（從樣本接收到報告發(fā)放）。答案：（1）樣本接收與核對：檢查樣本編號、類型、采集時間、保存條件（4℃運輸）是否符合要求，與申請單信息一致后登記。（2）樣本前處理：在樣本處理區(qū)生物安全柜內(nèi)拆封樣本，核對管帽編號，記錄樣本狀態(tài)（如是否滲漏）；若為滅活型樣本（如含胍鹽保存液），可直接進行核酸提?。蝗舴菧缁顦颖?，需先56℃滅活30分鐘。（3）核酸提取：使用自動化核酸提取儀（如磁珠法）或手工提取，加入陽性對照（質(zhì)粒標準品）、陰性對照（無核酸酶水），記錄提取試劑批號、儀器編號。（4）PCR體系配制：在試劑準備區(qū)將提取的核酸與PCR反應(yīng)液（含引物、探針、酶）混合，避免氣溶膠污染，使用帶濾芯吸頭。（5）擴增與檢測：將反應(yīng)管放入PCR擴增儀，設(shè)置程序（如95℃預(yù)變性→40循環(huán)的變性退火延伸），實時監(jiān)測熒光信號，記錄Ct值及擴增曲線。（6）結(jié)果判讀：根據(jù)試劑盒說明書判斷陽性（雙靶標Ct≤35）、陰性（無擴增或Ct＞40）、灰區(qū)（單靶標陽性或Ct3540），灰區(qū)樣本需重復(fù)檢測或更換試劑盒復(fù)核。（7）報告發(fā)放：審核結(jié)果準確性（對照是否符合要求），生成檢測報告（含樣本信息、檢測方法、結(jié)果、檢測時間、人員簽名），通過LIS系統(tǒng)或紙質(zhì)版發(fā)放，同時保存原始數(shù)據(jù)（擴增曲線、Ct值）至少2年。4.實驗室發(fā)生新冠樣本泄漏（如5mL樣本潑灑在生物安全柜臺面），應(yīng)如何進行應(yīng)急處置？答案：（1）立即停止操作，關(guān)閉生物安全柜風機（避免氣溶膠擴散），標記污染區(qū)域，禁止無關(guān)人員進入。（2）個人防護：穿戴額外防護裝備（如雙層手套、護目鏡），避免直接接觸污染物。（3）污染控制：用吸水紙覆蓋泄漏區(qū)域（避免擦拭導(dǎo)致氣溶膠擴散），緩慢傾倒2000mg/L有效氯消毒液（覆蓋吸水紙），作用30分鐘（確保病毒滅活）。（4）清理污染物：戴手套將吸水紙及污染物放入雙層黃色醫(yī)療廢物袋，分層封口，標注“新冠病毒污染廢物”。（5）環(huán)境消毒：用2000mg/L含氯消毒液擦拭臺面及生物安全柜內(nèi)壁，作用15分鐘后用清水擦拭；開啟生物安全柜風機運行10分鐘，排出殘留氣體。（6）記錄與填寫《實驗室事故登記表》，記錄泄漏時間、量、處理過程，報告實驗室負責人及生物安全委員會；對相關(guān)人員進行暴露風險評估（如接觸者核酸檢測、醫(yī)學觀察）。5.簡述PCR實驗室質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（至少5項）。答案：（1）人員資質(zhì)：檢測人員需經(jīng)PCR技術(shù)培訓(xùn)（含理論與實操），持《臨床基因擴增檢驗技術(shù)人員崗位培訓(xùn)合格證書》上崗。（2）試劑管理：使用經(jīng)國家藥監(jiān)局（NMPA）批準的新冠檢測試劑盒，核查有效期、批號，保存條件（如20℃避光）符合要求，避免反復(fù)凍融。（3）儀器校準：PCR擴增儀每6個月校準溫度（各孔溫度偏差≤±0.5℃），核酸提取儀定期檢查磁珠吸附效率，生物安全柜每年檢測風速及HEPA濾器完整性。（4）對照設(shè)置：每次實驗需設(shè)置陽性對照（已知陽性樣本或質(zhì)粒）、陰性對照（無核酸酶水）、內(nèi)標（監(jiān)測提取效率），確保對照結(jié)果符合預(yù)期（陽性Ct值在范圍內(nèi)，陰性無擴增）。（5）環(huán)境監(jiān)測：每周檢測實驗室壓差（如試劑準備區(qū)+10Pa，樣本處理區(qū)10Pa），每月檢測空氣潔凈度（塵埃粒子數(shù)≤352000個/m3），每季度檢測紫外線燈輻照強度（≥70μW/cm2）。（6）結(jié)果復(fù)核：對臨界值（Ct3540）、單靶標陽性結(jié)果需重復(fù)檢測或更換試劑盒驗證，避免假陽性/假陰性。四、案例分析題（每題10分，共30分）案例1：某PCR實驗室在進行新冠檢測時，發(fā)現(xiàn)多份樣本的擴增曲線出現(xiàn)“拖尾”現(xiàn)象（熒光信號緩慢上升，無明顯指數(shù)期），且陰性對照也出現(xiàn)弱擴增。問題：分析可能原因及解決措施。答案：可能原因：（1）核酸污染：擴增產(chǎn)物（如陽性樣本氣溶膠）污染了試劑準備區(qū)或樣本處理區(qū)，導(dǎo)致陰性對照被污染。（2）引物/探針降解：試劑保存不當（如反復(fù)凍融、未避光）導(dǎo)致引物或探針斷裂，非特異性結(jié)合模板。（3）擴增儀溫度異常：退火溫度過低或升溫速率過慢，導(dǎo)致非特異性擴增。（4）樣本交叉污染：核酸提取時吸頭未更換，或樣本管未密封，導(dǎo)致不同樣本間交叉。解決措施：（1）立即停止實驗，對實驗室環(huán)境進行徹底消毒（紫外線照射2小時，2000mg/L含氯消毒液擦拭所有臺面、設(shè)備）。（2）檢查試劑保存記錄，確認引物/探針是否在有效期內(nèi)，是否按要求保存（如20℃避光），必要時更換新批次試劑。（3）校準PCR擴增儀溫度，使用溫度驗證模塊檢測各孔溫度準確性，調(diào)整退火溫度（如提高23℃）。（4）核查核酸提取操作，確保使用帶濾芯吸頭，每樣本更換新吸頭，提取過程在生物安全柜內(nèi)進行，避免氣溶膠擴散。（5）重新進行實驗，增加空白對照（無核酸酶水）和陽性對照，確認結(jié)果可靠性后再發(fā)放報告。案例2：實驗室工作人員A在樣本處理時，未佩戴護目鏡，操作中樣本濺入右眼。問題：（1）A應(yīng)如何進行緊急處理？（2）實驗室需啟動哪些后續(xù)措施？答案：（1）緊急處理：①立即停止操作，用流動清水或生理鹽水沖洗眼睛15分鐘（翻開上下眼瞼，確保沖洗徹底）。②沖洗后，用0.5%碘伏或75%乙醇消毒眼周皮膚（避免接觸眼內(nèi)）。③報告實驗室負責人，記錄暴露時間、部位、樣本類型（如新冠陽性/待檢）。（2）后續(xù)措施：①暴露評估：由生物安全委員會評估樣本風險（如樣本是否為陽性、病毒載量），確定暴露等級（高風險）。②醫(yī)學觀察：A需立即