蛋白質(zhì)工程概論第1頁(yè)，共53頁(yè)。優(yōu)選蛋白質(zhì)工程概論第2頁(yè)，共53頁(yè)。蛋白質(zhì)工程（proteinengineering）研究在過(guò)去的25年間發(fā)展迅速，已取得一批較好成果，并開(kāi)始應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、輕工等各個(gè)領(lǐng)域。2000年6月26日，人類(lèi)基因組的工作草圖宣告完成，并進(jìn)入了后基因組時(shí)代（post-genomeera）。后基因組時(shí)代，中心任務(wù)是揭示基因組及其所包含的全部基因的功能，并在此基礎(chǔ)上闡明生命體的遺傳、進(jìn)化、發(fā)育、生長(zhǎng)、衰老、死亡的基本生物學(xué)規(guī)律，以及與人類(lèi)健康和疾病相關(guān)的生物學(xué)問(wèn)題。第3頁(yè)，共53頁(yè)。由于基因的功能最終是通過(guò)其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因此，在人類(lèi)基因組測(cè)序之后進(jìn)一步集中研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能，是揭示基因組功能，闡釋生命活動(dòng)規(guī)律和生命現(xiàn)象本質(zhì)的基本途徑，也是闡釋疾病發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)理并進(jìn)而戰(zhàn)勝疾病的重要途徑。研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，繼而人工改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并獲得我們所需要的活性蛋白質(zhì)，正是蛋白質(zhì)工程的主要任務(wù)和目標(biāo)。第4頁(yè)，共53頁(yè)。一、蛋白質(zhì)工程的概念

ProteinEngineering蛋白質(zhì)工程是在重組DNA技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究之后發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興學(xué)科。所謂蛋白質(zhì)工程，就是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)已知結(jié)構(gòu)和功能的了解，借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，利用基因定點(diǎn)誘變等技術(shù)，特異性地對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行改造，產(chǎn)生具有新的特性的蛋白質(zhì)的技術(shù)，并由此深入研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。第5頁(yè)，共53頁(yè)。蛋白質(zhì)工程是在遺傳工程取得的成就的基礎(chǔ)上，融合蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)、蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)化學(xué)等學(xué)科而迅速發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新興研究領(lǐng)域，它開(kāi)創(chuàng)了按照人類(lèi)意愿設(shè)計(jì)制造符合人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)的新時(shí)期，因此，被譽(yù)為第二代遺傳工程。蛋白質(zhì)工程的出現(xiàn)，為認(rèn)識(shí)和改造蛋白質(zhì)分子提供了強(qiáng)有力的手段。第6頁(yè)，共53頁(yè)。二、蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)（一）工、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的高速發(fā)展為蛋白質(zhì)工程的開(kāi)展開(kāi)拓了廣闊應(yīng)用前景（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究技術(shù)的建立推動(dòng)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究，從而為蛋白質(zhì)改造提供了理論依據(jù)（三）基因工程理論和技術(shù)的發(fā)展，為蛋白質(zhì)的改造和生產(chǎn)提供了必要的技術(shù)手段第7頁(yè)，共53頁(yè)。（一）工、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的高速發(fā)展

為蛋白質(zhì)工程的開(kāi)展開(kāi)拓了廣闊應(yīng)用前景1.酶的開(kāi)發(fā)利用依賴(lài)于蛋白質(zhì)工程的研發(fā)酶的專(zhuān)一性強(qiáng)，在溫和條件下能有效地催化化學(xué)反應(yīng)，使酶的應(yīng)用日益廣泛。藥品、化學(xué)、食品工業(yè)及分析服務(wù)行業(yè)是酶開(kāi)發(fā)的重要領(lǐng)地。加酶去污劑:洗衣粉、漂白分等；醫(yī)藥：

Streptokinase

(鏈激酶)、urokinase(尿激酶)、TPA(組織型纖溶酶原激活劑）等。第8頁(yè)，共53頁(yè)。妨礙酶開(kāi)發(fā)利用的原因主要有：生物材料中酶含量甚少，用傳統(tǒng)方法分離純化酶蛋白成本太高；酶蛋白分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性差，過(guò)酸、過(guò)堿、高溫、氧化等因素可破壞其結(jié)構(gòu)，使其喪失生物活性，因而在工業(yè)加工條件下，酶的半衰期短，利用率低；酶催化活性的最適pH值及底物專(zhuān)一性的范圍較窄，與工業(yè)應(yīng)用的要求有較大差距。因此，要想擴(kuò)大酶蛋白的開(kāi)發(fā)利用，需要建立適當(dāng)?shù)姆椒?，以改善酶蛋白的生物特性，使之適合于工業(yè)應(yīng)用的需求，這就需要利用蛋白質(zhì)工程對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造。第9頁(yè)，共53頁(yè)。如加酶洗衣粉就是在洗衣粉中加入一種蛋白水解酶枯草桿菌蛋白酶,提高洗衣粉的洗滌效果.但是,由于其穩(wěn)定性較差,最適pH值和最適溫度較窄,在洗衣機(jī)中洗衣服時(shí)效果較差.經(jīng)蛋白質(zhì)工程改造后大大提高了其應(yīng)用價(jià)值,現(xiàn)已成為加酶洗衣粉的重要成分.第10頁(yè)，共53頁(yè)。2.在多肽藥物、抗體以及其他活性蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究中，同樣存在著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改造問(wèn)題如白細(xì)胞介素-2（IL-2）是一種免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，在醫(yī)學(xué)上具有廣泛的用途。結(jié)構(gòu)研究證明，IL-2是由133個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，有3個(gè)半胱氨酸，1個(gè)二硫鍵，而125位上的半胱氨酸處于游離狀態(tài)，在分離純化IL-2的過(guò)程中，易發(fā)生二硫鍵錯(cuò)配，致使整個(gè)多肽活性降低。定點(diǎn)誘變將編碼鏈上編碼125位半胱氨酸的密碼子TGT轉(zhuǎn)換成絲氨酸或丙氨酸的密碼(TCT或GCA)，結(jié)果可以避免二硫鍵的錯(cuò)配，使產(chǎn)品IL-2的活性提高了7倍。第11頁(yè)，共53頁(yè)。再如:單克隆抗體是很有希望的疾病治療用藥,但是,單克隆抗體技術(shù)建立起已有數(shù)十年,并早已認(rèn)識(shí)到其藥用價(jià)值,但至今應(yīng)用不佳,原因是鼠源單抗對(duì)人來(lái)說(shuō)是異體蛋白。其人源化改造需蛋白質(zhì)工程才能完成?？梢?jiàn)，改造蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)以改變蛋白質(zhì)的某些生物學(xué)特性，在拓寬蛋白質(zhì)的用途，推動(dòng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化方面至關(guān)重要。而蛋白質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)的改造，只有利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)才能得以實(shí)現(xiàn)。第12頁(yè)，共53頁(yè)。（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究技術(shù)的建立推動(dòng)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究，從而為蛋白質(zhì)改造提供了理論依據(jù)蛋白質(zhì)工程的重要目標(biāo)之一，是通過(guò)改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)提高其開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值。這就是說(shuō)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變了，其生物學(xué)功能不能變。研究表明，蛋白質(zhì)功能部位的幾個(gè)氨基酸殘基決定著蛋白質(zhì)的功能，但是這幾個(gè)負(fù)責(zé)功能的氨基酸殘基必須處于一個(gè)極其精密的空間狀態(tài)下才能發(fā)揮功能。只有能維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的必須氨基酸及其空間構(gòu)象不變，其功能域的生物學(xué)活性才會(huì)保持不變。第13頁(yè)，共53頁(yè)。第14頁(yè)，共53頁(yè)。第15頁(yè)，共53頁(yè)。因此在對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造之前必需對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行充分地研究，了解影響蛋白質(zhì)特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改變這個(gè)（些）氨基酸是否會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能？闡明蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而研究其與生物學(xué)功能的關(guān)系已成為了解生命現(xiàn)象的關(guān)鍵，并成為蛋白質(zhì)工程的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究技術(shù)主要包括蛋白質(zhì)晶體學(xué)、蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)、生物信息學(xué)等。第16頁(yè)，共53頁(yè)。1．蛋白質(zhì)晶體學(xué)蛋白質(zhì)晶體學(xué)（proteincrystallography）是利用X射線衍射法（X-raydiffraction

method）的原理解釋蛋白質(zhì)晶體中的原子在空間的位置與排列，并了解其與功能的關(guān)系。20世紀(jì)50年代末用X射線晶體學(xué)方法測(cè)定了第一個(gè)蛋白質(zhì)——肌紅蛋白的結(jié)構(gòu).現(xiàn)已有400多種蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)被揭示。通過(guò)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的研究有助于了解蛋白質(zhì)是如何發(fā)揮生物學(xué)功能的。第17頁(yè)，共53頁(yè)。近年來(lái)又發(fā)展了核磁共振（NMR）技術(shù)，它是確定蛋白質(zhì)分子在溶液中結(jié)構(gòu)信息廣為使用的方法。核磁共振技術(shù)使用較低強(qiáng)度輻射能測(cè)定蛋白質(zhì)分子在流動(dòng)化液態(tài)下的三維結(jié)構(gòu)信息，從而更真實(shí)地反映蛋白質(zhì)在生物環(huán)境下的結(jié)構(gòu)信息，并能確定小分子與大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。第18頁(yè)，共53頁(yè)。2．蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)線性多肽是如何折疊成具有三維特征的天然結(jié)構(gòu)？蛋白質(zhì)在與其他物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸或酶的底物等）相互作用時(shí)，其三維結(jié)構(gòu)又是經(jīng)歷怎樣的動(dòng)態(tài)過(guò)程而發(fā)揮其活性？只有了解這些問(wèn)題，才能預(yù)測(cè)基因水平的改造最終會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生何種后果，才能談得上具有真正意義的分子設(shè)計(jì)，才能真正的理解生命現(xiàn)象。蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)正是研究這一課題的。

第19頁(yè)，共53頁(yè)。3.生物信息學(xué)生物信息學(xué)的神速發(fā)展為蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的研究提供了方便有效的技術(shù)。生物信息學(xué)是利用計(jì)算機(jī)控制的圖像顯示系統(tǒng)，把所要研究蛋白質(zhì)的已知三維結(jié)構(gòu)顯示在屏幕上，分析哪些殘基對(duì)分子內(nèi)相互作用可能是重要的，哪些殘基對(duì)分子間相互作用可能是重要的。前者通常為結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定所必需，后者多系分子識(shí)別及活性重要部位。然后通過(guò)計(jì)算機(jī)按預(yù)先設(shè)想替換一些側(cè)鏈基團(tuán)，再用計(jì)算機(jī)尋找經(jīng)過(guò)“微擾”后蛋白質(zhì)分子的能量趨于極小的狀態(tài)，預(yù)測(cè)由于這種替換可能造成的后果。生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)工程研究必不可少的。目前已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與特性分析所需的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，可供選擇。第20頁(yè)，共53頁(yè)。（三）基因工程理論和技術(shù)的發(fā)展，為蛋白質(zhì)的改造和生產(chǎn)提供了必要的技術(shù)手段1.基因克隆、表達(dá)與純化技術(shù)的成熟為提高蛋白質(zhì)得率提供了重要技術(shù)策略隨著基因工程理論和技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)能克隆特異蛋白質(zhì)的基因，并令其在適宜宿主菌中表達(dá)，使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量大大提高，因而降低蛋白質(zhì)純化成本的問(wèn)題已基本解決。重要的問(wèn)題是提高酶蛋白的穩(wěn)定性，改良其生物學(xué)特性。第21頁(yè)，共53頁(yè)。2.定點(diǎn)誘變技術(shù)的建立為改造蛋白質(zhì)的特性提供了技術(shù)策略穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的主要因素是蛋白質(zhì)分子眾多基團(tuán)間的相互作用，如肽鍵、氫鍵、靜電作用、疏水殘基間的疏水鍵以及二硫鍵等。研究表明，上述穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的因素是由蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中某一個(gè)或某一段氨基酸序列決定的，人工改變或修飾這些氨基酸殘基，有可能增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，又不影響其生物學(xué)活性。第22頁(yè)，共53頁(yè)。如野生型枯草桿菌蛋白酶的218位天冬酰胺(Asn)是酶活性部位有關(guān)的氨基酸殘基，若將其變成絲氨酸(Ser)，用65℃的失活半衰期衡量，從59分鐘增到223分鐘，酶的穩(wěn)定性顯著增加。再如氧化失活使枯草桿菌蛋白酶在工業(yè)上的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制?？莶輻U菌蛋白酶在少量H2O2作用下很快失活是由于埋藏在催化部位Ser221鄰近的Met222氧化成硫氫化物的原因。1985年Wells證明若用其他氨基酸取代Met222，可以提高酶的氧化穩(wěn)定性而又保持高催化活性。第23頁(yè)，共53頁(yè)。目前我們已經(jīng)能對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，甚至于能制造出全新的蛋白質(zhì)，這得益于分子生物學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展。20世紀(jì)70年代初期，DNA重組技術(shù)誕生，并成功地應(yīng)用于基因操作，從而產(chǎn)生了基因工程。而基因工程的誕生，特別是DNA重組技術(shù)和定點(diǎn)誘變技術(shù)的建立，使我們有可能從基因水平改造蛋白質(zhì)分子中氨基酸的序列，為蛋白質(zhì)工程的誕生，奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。第24頁(yè)，共53頁(yè)。所謂基因定點(diǎn)誘變（site-directedmutagenesis），就是在DNA水平上，在體外試管中通過(guò)堿基取代、插入或缺失改變基因DNA序列中任何一個(gè)（或幾個(gè)）特定的堿基，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因中某個(gè)或某些氨基酸編碼順序加以改變，從而改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的技術(shù)。該技術(shù)具有簡(jiǎn)單易行重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。它適用于:基因結(jié)構(gòu)與功能的研究，通過(guò)改變基因的密碼子來(lái)改造天然蛋白質(zhì)，用于確定蛋白質(zhì)中每一個(gè)氨基酸在結(jié)構(gòu)和功能上的作用，為人工改造蛋白質(zhì)提供理論依據(jù)。第25頁(yè)，共53頁(yè)。寡核苷酸定點(diǎn)誘變技術(shù)所依據(jù)的原理是:按照體外DNA重組技術(shù)，將待誘變的目的基因插入到M13噬菌體上，制備此種含有目的基因的M13單鏈DNA，即正鏈DNA。再使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段作引物，啟動(dòng)單鏈DNA分子進(jìn)行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸引物更新成為新合成的DNA子鏈的一個(gè)組成部分。因此所產(chǎn)生的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列，經(jīng)表達(dá)即可獲得改造后的蛋白質(zhì)。為了使目的基因的特定位點(diǎn)發(fā)生突變，所設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物的序列除了所需的突變堿基外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補(bǔ)。第26頁(yè)，共53頁(yè)。第27頁(yè)，共53頁(yè)。定點(diǎn)誘變?cè)硎疽鈭D第28頁(yè)，共53頁(yè)。第29頁(yè)，共53頁(yè)。第30頁(yè)，共53頁(yè)?？傊鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)研究是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的重要手段，而改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，則依靠基因工程，基因工程的發(fā)展從技術(shù)上提供了改變蛋白質(zhì)個(gè)別氨基酸殘基或肽段的手段，使結(jié)構(gòu)改變已能在實(shí)驗(yàn)室實(shí)施，二者結(jié)合則產(chǎn)生了蛋白質(zhì)工程。第31頁(yè)，共53頁(yè)。三、蛋白質(zhì)工程的研究?jī)?nèi)容（一）利用已知蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的信息作為應(yīng)用研究（二）定量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究（三）根據(jù)已知結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系人工改造蛋白質(zhì)第32頁(yè)，共53頁(yè)。（一）利用已知蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的信息作為應(yīng)用研究

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的功能和理化性質(zhì)，而蛋白質(zhì)功能區(qū)的某個(gè)或某些氨基酸殘基可能在維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、理化性質(zhì)中起重要作用。因此，定點(diǎn)改變這些氨基酸序列，即可能改變蛋白質(zhì)的功能和特性，使之更適合于工業(yè)化生產(chǎn)的要求。如前所述枯草桿菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的Ser221鄰近的Met222易被氧化成硫氫化物，若以其他氨基酸取代Met222，則可提高酶的氧化穩(wěn)定性而又不影響其催化活性。這是結(jié)構(gòu)分析和定點(diǎn)突變改造蛋白質(zhì)的成功范例。

第33頁(yè)，共53頁(yè)。（二）定量研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系這是目前蛋白質(zhì)工程研究的主體。這一類(lèi)研究的課題很廣泛，包括蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型的建立，配體結(jié)合和酶催化的性質(zhì)，蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性研究，蛋白質(zhì)變異等等。這類(lèi)研究看起來(lái)偏重理論，但對(duì)于指導(dǎo)實(shí)際工程意義重大。第34頁(yè)，共53頁(yè)。（三）根據(jù)已知結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系人工改造蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)工程是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和定點(diǎn)改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一門(mén)學(xué)科，其創(chuàng)造性成就在于開(kāi)創(chuàng)了按照人類(lèi)意愿設(shè)計(jì)制造符合人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)的新時(shí)期。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，采用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)，人工改造蛋白質(zhì)則是蛋白質(zhì)工程的主要研究?jī)?nèi)容之一。其主要研究?jī)?nèi)容如下：第35頁(yè)，共53頁(yè)。

通過(guò)改變蛋白質(zhì)的活性部位，提高其生物功效及獨(dú)立工作的能力

用定點(diǎn)誘變技術(shù)不僅可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，還可以提高酶的活性。要改變酶的活性，需要一個(gè)詳細(xì)描述了酶的活性位點(diǎn)的圖譜。有了這樣的資料，研究者們即可推測(cè)酶與底物的親和程度，并利用定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，提高酶的活性。第36頁(yè)，共53頁(yè)。表4－4天然和誘變酪氨酰-tRNA合成酶活性酶Kcat(s-1)Km(mmol/L)Kcat/Km(s-1mol-1)Thr-514.72.51.860Ala-514.01.23.200Pro-511.80.01995.800第37頁(yè)，共53頁(yè)。通過(guò)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)順序，提高其在極端條件（如酸、堿、熱等）下的穩(wěn)定性；例如:

蛋白質(zhì)分子中兩個(gè)半胱氨酸殘基上的巰基（－SH）之間氧化脫氫即形成二硫鍵（－Ｓ－Ｓ－）。二硫鍵的數(shù)量與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關(guān)，增加蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，可提高蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。在一項(xiàng)研究中，通過(guò)寡核苷酸定點(diǎn)誘變構(gòu)建了T4溶菌酶的六種變異體,比較了它們的活性.第38頁(yè)，共53頁(yè)。表4－1T4溶菌酶和6種設(shè)計(jì)的變體特性酶氨基酸的位置二硫鍵的數(shù)目相對(duì)活性Tm

39215497142164(%)(℃)wtαIleIleThrCysCysThrLeu010041.9pwtIleIleThrThrAlaThrLeu010041.9ACysIleThrThrCysThrLeu19646.7BIleCysThrThrAlaThrCys110648.3CIleIleCysThrAlaCysLeu1052.9DCysCysThrThrCysThrCys29557.6EIleCysCysThrAlaCysCys2058.9FCysCysCysThrCysCysCys3065.9wtα：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；A－F：六種設(shè)計(jì)的半胱氨酸變體；Tm:熔點(diǎn)溫度第39頁(yè)，共53頁(yè)。通過(guò)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)順序

使其便于分離純化這項(xiàng)研究雖然難度較大，但隨著人類(lèi)基因組研究、后基因組研究的不斷深入和完善，隨著蛋白質(zhì)工程研究技術(shù)和手段的不斷發(fā)展，該項(xiàng)研究必將獲得豐碩的成果。第40頁(yè)，共53頁(yè)。四、蛋白質(zhì)工程的基本程序蛋白質(zhì)工程是從DNA的水平改變基因入手，設(shè)計(jì)合成或改造蛋白質(zhì)的技術(shù)。該技術(shù)綜合運(yùn)用蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的詳細(xì)信息，用定點(diǎn)誘變基因的方法直接修飾改變基因，或人工合成基因，從而定向改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其成為具有人們所希望性能的新型蛋白質(zhì)，或者創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì)。第41頁(yè)，共53頁(yè)。

蛋白質(zhì)工程的程序分離純化0.1~1.0mg純蛋白質(zhì)，測(cè)定其部分肽段一段結(jié)構(gòu)，根據(jù)編碼原則合成相應(yīng)同位素標(biāo)記的寡苷酸探針;以此從基因庫(kù)中分離編碼該蛋白質(zhì)的克隆化基因，轉(zhuǎn)入噬菌體M13系統(tǒng)，用雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA序列分析;通過(guò)表達(dá)載體獲得較大量(0.1~1.0克)該蛋白質(zhì)用于空間結(jié)構(gòu)測(cè)定及結(jié)構(gòu)與功能研究，借助計(jì)算機(jī)提出分子預(yù)測(cè)性質(zhì)及改造方案;通過(guò)寡核苷酸M13系統(tǒng)定點(diǎn)誘變并分離其突變體，引入表達(dá)載體生產(chǎn)并純化多量突變性蛋白質(zhì)，分析其性質(zhì)指導(dǎo)進(jìn)一步分子設(shè)計(jì)，以最終獲得所預(yù)期性質(zhì)的分子。第42頁(yè)，共53頁(yè)。五、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用（一）研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（二）改變蛋白質(zhì)的特性（三）生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)活性物質(zhì)（四）設(shè)計(jì)合成全新蛋白質(zhì)第43頁(yè)，共53頁(yè)。（一）研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是按照人類(lèi)的意愿改造蛋白質(zhì)的特性、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)活性蛋白質(zhì)、甚至設(shè)計(jì)和制造全新蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。而蛋白質(zhì)工程則為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了必要的理論和技術(shù)，使我們有可能利用基因工程技術(shù)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。第44頁(yè)，共53頁(yè)。（二）改變蛋白質(zhì)的特性蛋白質(zhì)工程的建立，使人們有可能通過(guò)改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)改變蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性。如改變酶的催化活性、酶對(duì)底物的專(zhuān)一性、酶與配體的結(jié)合能力、酶在pH變化、溫度變化以及溶劑系統(tǒng)變化條件下分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等等。這些都可以通過(guò)蛋白質(zhì)工程將酶分子中某個(gè)或某一段氨基酸殘基更換、增加、刪除或修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。第45頁(yè)，共53頁(yè)。如前所述枯草桿菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的Ser221鄰近的Met222易被氧化成硫氫化物，若以其他氨基酸取代Met222，則可提高酶的氧化穩(wěn)定性而又不影響其催化活性。這是結(jié)構(gòu)分析和定點(diǎn)突變改造蛋白質(zhì)的成功范例?？莶輻U菌蛋白酶可作為洗滌劑的添加劑，但由于其只能水解笨丙氨酸Phe羧基所形成的肽鍵，底物作用范圍過(guò)窄而限制了洗滌劑的高效性，若用帶正電荷的賴(lài)氨酸Lys取代位于活性中心166位的甘氨酸Gly，所獲得的突變酶不僅能水解Phe羧基所形成的肽鍵，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸Glu所形成的肽鍵，使其底物作用范圍拓寬，因而可能成為最高效的洗滌劑添加酶，這是定點(diǎn)誘變改變蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的成功例子。第46頁(yè)，共53頁(yè)。（三）生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)活性物質(zhì)1．提高酶的產(chǎn)量和創(chuàng)建新型酶天然酶的產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差，限制了酶的開(kāi)發(fā)利用。DNA重組技術(shù)對(duì)酶工業(yè)的滲透，導(dǎo)致了酶工業(yè)的迅速發(fā)展。目前已有多種酶實(shí)現(xiàn)了克隆化，并在適宜宿主菌中表達(dá)成功，從而極大地提高了酶的產(chǎn)量。蛋白質(zhì)工程技術(shù)的興起，給創(chuàng)建新型酶、改變酶的生理特性提供了強(qiáng)有力的工具。如利用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)，將T4溶菌酶的第3位異亮氨酸變成半胱氨酸，后者與第97位的半胱氨酸形成二硫鍵，從而穩(wěn)定了兩個(gè)結(jié)構(gòu)域所形成的活性中心，使酶在高溫下的穩(wěn)定性大大提高。如果將該酶的第51位蘇氨酸換成脯氨酸，可使酶的活性提高25倍。第47頁(yè)，共53頁(yè)。2．設(shè)計(jì)和研制新型抗體傳統(tǒng)的抗體是經(jīng)過(guò)抗原免疫動(dòng)物獲得的，稱(chēng)為多克隆抗體。1975年，Kohler及Milstein等通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了單克隆抗體，這是免疫學(xué)上劃時(shí)代的偉大進(jìn)展之一。單抗用于臨床疾病治療，效果不盡人意，原因在于目前用于治療的單抗多為小鼠單抗，對(duì)人而言是一種異體