(12)發(fā)明專利(10)授權(quán)公告號(hào)CN1184066(65)同一申請的已公布的文獻(xiàn)號(hào)(73)專利權(quán)人湖南艾科瑞生物工程有限公司地址410000湖南省長沙市岳麓區(qū)學(xué)士街道學(xué)士路336號(hào)湖南省檢驗(yàn)檢測特色產(chǎn)業(yè)園C5棟103號(hào)房(72)發(fā)明人朱益波瞿芳陶穎胡莉琴周啟政張慧(74)專利代理機(jī)構(gòu)廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司44205專利代理師羅新 US11639499B審查員蔡玉品本發(fā)明公開了一種MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其應(yīng)用，所述MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體在如SEQIDNO:1所示的野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)的突變；所述氨基酸突變的2所示的氨基酸序列。2.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼如權(quán)利要求1所述的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。3.與權(quán)利要求2所述的核酸分子相關(guān)的生物材料，其特征在于，所述生物材料包含a1)~a7)中至少一種：al)包含權(quán)利要求2所述的核酸分子的表達(dá)盒；a2)包含權(quán)利要求2所述的核酸分子的載體；a3)包含a1)所述的表達(dá)盒的載體；a4)包含權(quán)利要求2所述的核酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；a5)包含al)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；a6)包含a2)所述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；a7)包含a3)所述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。4.權(quán)利要求1所述的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體、權(quán)利要求2所述的核酸分子和權(quán)利要求3所述的生物材料的至少一種在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品包含試劑、檢測板、試劑盒、檢測芯片中的至少一種。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑、檢測板、檢測芯片或試劑盒具有b1)～b3)中至少一種功能：6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒選自逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、RT-序試劑盒中的一種。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒還包括：逆轉(zhuǎn)錄反PCR擴(kuò)增引物中的至少一種；qPCR擴(kuò)增引物和探針中的至少一種；8.一種如權(quán)利要求1所述的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的制備方法，其特征在于，包驟：通過權(quán)利要求3中所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系表達(dá)得到。3技術(shù)領(lǐng)域背景技術(shù)合成cDNA鏈，是現(xiàn)代生物技術(shù)和分子診斷的標(biāo)準(zhǔn)工具，被廣泛用于許多研究應(yīng)用中，包括[0003]目前，市面上最常用的逆轉(zhuǎn)錄酶是來自Moloney鼠白血病病毒的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶。野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶最佳工作溫度為37-42℃,在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程中，遇到具有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)RNA模板，會(huì)暫停逆轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物截短。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度從37℃升高到55℃時(shí)，復(fù)雜的RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵打開，變成線性單鏈RNA,使得逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)性以及擴(kuò)增效率更優(yōu)的逆轉(zhuǎn)錄酶。發(fā)明內(nèi)容[0004]本發(fā)明旨在至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出一[0006]本發(fā)明還提出與上述的核酸分子相關(guān)的生物材料。[0008]本發(fā)明還提出一種產(chǎn)品。示的野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)的突變，所述氨基酸突變的位一所示的氨基酸序列。[0012]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提出了一種核酸分子，所述核酸分子編碼上述MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。[0013]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述核酸分子如SEQIDNO:17-26所示。[0014]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提出了與所述的核酸分子相關(guān)的生物材料，所述生物材料包含al)～a7)中至少一種：4[0015]al)包含上述核酸分子的表達(dá)盒；[0016]a2)包含上述核酸分子的載體；[0017]a3)包含a1)所述的表達(dá)盒的載體；[0018]a4)包含上述核酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；[0019]a5)包含a1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；[0020]a6)包含a2)所述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；[0021]a7)包含a3)所述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。[0022]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提出了上述MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體、核酸分子和生物材料的至少一種的應(yīng)用，所述應(yīng)用為在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用。[0023]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述產(chǎn)品包含試劑、檢測板、試劑盒、檢測芯片中的至少一種。[0024]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述試劑、檢測板、檢測芯片或試劑盒具有b1)～b3)中至少一種功能：[0027]b3)制備RT-PCR檢測試劑或RT-qPCR檢測試劑。[0028]根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提出了一種產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含上述的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。[0029]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述產(chǎn)品包含試劑、檢測板、試劑盒、檢測芯片中的至少一種。[0030]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述試劑、檢測板、檢測芯片或試劑盒具有b1)～b3)中至少一種功能：[0033]b3)制備RT-PCR檢測試劑或RT-qPCR檢測試劑。[0034]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述試劑盒選自逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、RT-PCR擴(kuò)增試劑盒、RT-qPCR試劑盒、cDNA文庫構(gòu)建試劑盒、cDNA末端快速擴(kuò)增試劑的一種。[0035]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒還包括：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物中的至少一種。[0036]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述RT-PCR擴(kuò)增試劑盒還包括：PCR水、RT-PCR擴(kuò)增[0037]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述RT-qPCR試劑盒還包括：PCR水、RT-qPCR擴(kuò)增緩[0038]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述cDNA文庫構(gòu)建試劑盒還包括：接頭。[0039]根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提出了上述MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：通過上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系表達(dá)得到。[0040]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述方法具體包括以下步驟：[0041](1)將包含上述核酸分子的載體的重組載體轉(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單5克隆細(xì)胞進(jìn)行篩選；[0042](2)提取篩選的陽性克隆的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培[0044](4)向所得菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.8～1mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體；[0045](5)向所得菌體中加入裂解緩沖液進(jìn)行重懸，高壓破碎菌體，離心取上清液；并采[0046](6)將過濾得到的液相進(jìn)行鎳離子親和層析，利用聚丙烯酰胺電泳檢測洗脫溶液，收集含有目的蛋白樣品；[0047](7)將步驟(6)中的含有目的蛋白樣品進(jìn)行陽離子交換層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測洗脫溶液，收集含有目的蛋白樣品透析至保存液中，即獲得所述的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變[0048]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟(2)和步驟(3)中所述的LB培養(yǎng)基均含80-120μg/mL氨芐西林。[0049]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟(2)中所述的培養(yǎng)的條件為20-30℃,150-200r/min振蕩培養(yǎng)。[0050]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟(3)中所述的培養(yǎng)的條件為：20-30℃,150~200r/min振蕩培養(yǎng)至0D600為0.6～0.8。[0051]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟(3)中所述的種子液按1:(80-120)的體積比接[0052]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟(4)中所述的誘導(dǎo)條件為20-30℃,誘導(dǎo)4-6h。[0053]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟(4)所述的離心條件為：2-6℃以4000-5000rpm的轉(zhuǎn)速離心15-25min。[0054]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟(5)中所述的裂解緩沖液用量按每克菌體中加入8～10mL;[0055]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟(5)中所述的離心條件為2-6℃以10000-14000rpm的轉(zhuǎn)速離心25-35min;[0056]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟(5)中所述的裂解緩沖液的組分含有：45-55mM[0057]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟(6)中所述的鎳離子親和層析所用的結(jié)合緩沖液的組分含有：45-55mMTris-HC1、280-320mMNaC1、15-25mMImidazole、2%-6%[0058]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，鎳離子親和層析所用洗脫緩沖液的組分含有：45-[0059]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述陽離子交換層析所用結(jié)合緩沖液的組分含有：[0060]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，陽離子交換層析所用梯度洗脫緩沖液的組分含有：6[0061]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述保存液的組分含有：15-25mMTris-HC1、550-[0062]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，至少具有以下有益效果：本發(fā)明制備得到的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，是通過使用預(yù)測3D結(jié)構(gòu)和與模板相互作用的軟件進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，獲得眾多產(chǎn)量高、熱穩(wěn)定高、靈敏度高的優(yōu)勢，可實(shí)現(xiàn)用于在復(fù)雜RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄，以及在微量RNA附圖說明[0063]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，其中：[0064]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中的增強(qiáng)型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖，紫色部分為突變位點(diǎn)；[0065]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中的純化后突變體及野生型的SDS圖，其中，M為[0066]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中的增強(qiáng)型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體與野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)圖；[0067]圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中的不同溫度處理下，增強(qiáng)型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體與野生型變體Mut10;[0068]圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中的不同濃度模板下，增強(qiáng)型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體與野生型變體Mut10;[0069]圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中10pg濃度模板下，增強(qiáng)型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體與野生型CN118406670B說明書5/20頁7例，而不是全部實(shí)施例，基于本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的其他實(shí)施例，均屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。[0072]1、增強(qiáng)型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的設(shè)計(jì)[0073]根據(jù)預(yù)測3D結(jié)構(gòu)和與模板相互作用的軟件mutcompute進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，預(yù)測得到[0074]野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體：CN118406670B說明書6/20頁8AITETPDTSTLLI(SEQI[0088]Mut2氨基酸序列：AITETPDTSTLLI(SEQIAITETPDTSTLLI(SEQICN118406670B說明書7/20頁9[0131]HIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAE[0142]HIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAE[0153]HIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAECN118406670B說明書8/20頁AITETPDTSTLLI(SEQIDNO.10)。AITETPDTSTLLI(SEQIDNO.11)。[0187]其中，下劃線“—”表示突變位點(diǎn)。[0188]2、增強(qiáng)型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的合成列(如SEQIDNO.16所示)的重組表達(dá)載體(原始載體為PET-32a)。[0190]編碼MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶野生型的核苷酸序列：CN118406670B說明書9/20頁11ATCATTCCGCTGAAGGCGACGTCTACCCCGGTTTCCATCAAACAGTACCCGATGTCCCAGGAAGCTCAAACCGCACATCCAGCGTCTGCTGGATCAGGGCATCCTGGTGCCGTGCCAAAGCCCATGATTCACCCGACCGTTCCGAACCCGTACAATCTGCTGTCCGGCCTGCCGCCGTCCCACCAATGGTATCTGAAAGACGCGTTTTTTTGTCTGCGTCTGCACCCGACCTCTCAGCCACTGTTCGCGTTTGAGGGAGATGGGCATCTCTGGTCAGCTGACCTGGACCCGTCTGCCGCAGGGCTTCAAAAACTCGAGGCTCTGCATCGCGATCTGGCGGACTTCCGTATCCAGCACCCGGACCTGATCCTGCTGTGCTGCTGGCGGCAACTTCCGAACTGGAGTTCCTGGGTACTGCCGGTTTCTGCCGTCTGTGGATCCCAGGCTTCGCTGAAATGGCCGCGCCGACTGCGCCGGCTCTGGGTCTGCCGGATCTGACTAAACCGTTCGAACTGTTCGTTGATGAAAAGCAGAAGGCGTACTGACCCAGAAACTGGGTCCGTGAGCTGGTTGGCCGCCGTGCCTGCGTATGGTCAGCCGCTGGTAATCCTGGCTCCGCATGCTGTGGAAGCTCTGGTAAAACAGCCTCCGACGCACGCATGACCCATTATCAGGCGCTGCTGCTGGACACTGATCGCGTGCAATTCGGTCCTGTTACTCGTCCTGATCTGACTGACCAACCTCTGCCTGACGCGGATCACACCTGGTACACCGACGGTTCTATACCGATTCTCGTTACGCTTTCGCCACCGCCCACATTCATGGTGAAATTTACCGTCGTCCGTAAAGCTGCAATCACTGAAACTCCGGATACCTCTACGCTGCTGATC(SEQIDNO:16)。[0192]編碼MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體Mut1的核苷酸序列：[0193]ATGCTGAACATCGAAGATGAACACCGCCTGCACGAAACTTCCAAAGAACCGGACGTCTCTCTGGCACCTGGCTGTCCGACTTCCCGCAAGCATGGGCAGAAATTATCCCTCTGAAGGCCACCTCCACCCCGGTCAGCATTAAACAGTACCCGATGTCCCTGGAGGCTCAAACCGCACATTCAGCGTCTGCTGGATCAGGGCATCCTGGTGCCGTGCCAGTCCCCGTGATCCACCCTACCGTACCGAACCCGTACAACCTGCTGTCTGGCCTGCCGCCGTCCCACCAGTGGTACCTGAAGGATGCGAACTTCCACCTGCGCCTGCACCCGACCTCCCAGCCGCTGTTCGCCTTTGAGGAAATGGGCATTTCTGGTCAGCTGACTTGGACCCGTCTGCCGCAGGGTTTCAAAAACTCGAAGCTCTGCATCGTGACCTGGCTGATTTCCGTATCCAGCACCCGGACCTGATCCTGCTGTGCTGCTGGCCGCTACCTCCGAACTGGATTGCCAGCAAATTCCTGGGTACCGCGGGCTTCTGCCGCCTGTGGATTCCGGGTTTCGCTGAGATGGCTGCTCCGACTGCCCCGGCCCTGGGTCTGCCGGATCTGACCAAGAGGGTGTCCTGACTCAGAAACTGGGCCCGTGGCGCCGTCCGGTTGCGTATCTGTCTAAGAAGCTGGTGCTGGCTGGCCGCCGTGCCTGCGCATGGTTGCCGCAGGTCAGCCGCTGGTGATTCTGGCTCCGCACGCAGTTACGCTCGTATGACGCACTACCAGGCGCTGCTGCTGGATACGGACCGTGTGCAGTTTGGCCCGGTAGACCCGTCCAGATCTGACGGATCAACCGCTGCCGGACGCAGTATACCGACTCCCGTTACGCGTTCGCGACCGCGCATATCCACGGTGAAATTTATCGTCGCCCGTAAAGCGGCAATCACCGAAACCCCAGACACCTCTACCCTGCTGATT(SEQ[0194]編碼MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體Mut2的核苷酸序列：TCAAACCGCACATCCAGCGCCTGCTGGATCAGGGTATCCTGGTCCCGTGCCAGTCCCCGTGATCCACCCGACCGTGCCGAACCCGTACAACCTGCTGTCTGGTCTGCCTCCGTCTCACCAATGGTACCTGAAGGATGCGAACTTCTGCCTGCGTCTGCATCCGACCTCCCAGCCGCTGTTCGCGTTCGAGGGAAATGGGCACCTCTGGTCAGCTGACTTGGACTCGTCTGCCACAAGGCTTCAAAAACTCGAAGCTCTGCATCGCGATCTGGCGGATTTCCGTATCCAGCACCCTGACCTGATTCTGCTGAATTCCTGGGCACTGCAGGTTTTTGCCGTCTGTGGATCCCGGGTTTCGCGGAAATGGCGGCGCCTCTGACCGCACCGGCCCTGGGTCTGCCGGATCTGACCAAACCGTTCGAACTGTTTGTTGACGAGAAACAGAAGGTGTGCTGACCCAGAAACTGGGCCCATGGCGTCGTCCGGTTGCTTACCTGTCCAAAAAACTGGGGCGGGTTGGCCGCCGTGTCTGCGTATGGTTGCGGCCATTGCTGTCCTGACCAAAGATGCGGGTCAGCCGCTGGTGATCCTGGCTCCGCACGCAGTTGAAGCTCTGGTTAAACAGCCGCCAACGCGCGTATGACTCACTATCAGGCGCTGCTGCTGGACACTGATCGTGTTCAGTTCGGTCCGGTGCCCGGCTACCCTGCTGCCTCTGCCGGAGGAGGGTCTGCAGCACAACTGTCTGGATATCCTACTCGCCCTGATCTGACCGATCAGCCGCTGCCGGATGCTGACCACACCTGGTACACTGACGGCTCTACACGGATAGCCGTTACGCATTTGCCACCGCGCACATCCATGGTGAAATTTACCGTCGTCCGTAAAGCAGCGATCACCGAAACCCCTGATACTTCTACCCTGCTGATC(SEQIDNO:18)。[0197]ATGCTGAACATCGAAGACGAACACCGCCTGCACGAAACCTCCAAGGAACCGGATGTATCCCTGGGTTCCACTTGGCTGTCTGATTTCCCACAGGCGTGGGCTGAAACCGGCGGCATGGGCCTGGCGGTATTATCCCGCTGAAAGCCACCTCCACCCCGGTTTCCATCAAACAATATCCGATGAGCCAAGAAGCTCAAGCCGCACATCCAGCGCCTGCTGGATCAGGGTATCCTGGTTCCGTGTCAGAGCCCGTGATCCACCCGACTGTGCCGAATCCGTACAACCTGCTGTCCGGTCTGCCTCCGTCCCACCAGTGGTACCTGAAAGATGCTTTCTTTCATCTGCGTCTGCACCCGACGTCCCAGCCTCTGTTTGCTTTTGAGGAGATGGGCATCAGCGGCCAGCTGACTTGGACTCGTCTGCCGCAGGGTTTCAAAAACTCTGAGGCACTGCATCGTGATCTGGCTGATTTTCGTATCCAGCACCCAGATCTGATCCTGCTGTGCTGCTGGCTGCAACTTCCGAACTGGAATTTCTGGGTACCGCCGGCTTCCAGCGTCTGTGGATCCCAGGTTTCGCGGAAATGGCAGCTCCGACTGCGCCTGCGCTGGGCCTGCCTGACCTGACTAAACCTTTTGAGCTGTTCGTGGACGAAAAACAAAGGTGTGCTGACGCAAAAGCCGCCGGTTGGCCACCGTGTCTGCGTATGGTTGCTGCTATCGCGGTGCTGACCAAAGATGCGGTCAACCTCTGGTCATTCTGGCTCCGCACGCCGTCGAAGCGCTGGTAAAGCAGCCGCCGACGCACGCATGACCCATTACCAGGCTCTGCTGCTGGATACCGACCGTGTACAGTTCGGCCCGGAACCCGGCAACTCTGCTGCCGCTGCCGGAAGAAGGCCTGCAGCATAACTGTCTGGATATCCTACCCGCCCGGATCTGACTGATCAGCCGCTGCCGGATGCTGACCACACCTGGTACACCGATGGTTCCACCTCTGCTCAGCGTGCCTACACTGATTCCCGTTATGCGTTCGCTACTGCCCACATTCATGGTGAAATTTATCGTCGCCCATCATTCACTGTCCGGGCCATCAGACGCAAAGCCGCAATCACTGAAACTCCGGATACCAGCACCCTGCTGATT(SEQIDNO:19)。[0198]編碼MMLV逆轉(zhuǎn)[0199]ATGCTGAACATCGAAGACGAACACCGCCTGCACGAAACCTCTAAAGAACTACTTGGCTGTCTGATTTCCCGCAAGCCTGGGCAGAAACGGGTGGTATGGGCCTGGCTGTGCATCATCCCGCTGAAAGCTACGAGCACTCCGGTCTCCATCAAACAGTACCCAATGTCTCAGGAAGCTCAAACCGCATATCCAGCGCCTGCTGGACCAGGGTATCCTGGTTCCATGCCAGTCTCCGTGATCCATCCGACCGTTCCGAATCCGTATAACCTGCTGTCTGGTCTGCCGCCGTCCCATCAGTGGTATCTGAAAGACGCGTTCTTTCACCTGCGCCTGCATCCAACCTCTCAGCCGCTGTTCGCATTCGAAAGAGATGGGTATCTCTGGCCAGCTGACCTGGACCCGCCTGCCGCAGGGCTTCAAGAACTCCCCGAGAGGCTCTGCATCGTGATCTGGCTGACTTCCGTATCCAGCATCCGGATCTGATCCTGCTGAGTTCCTGGGTACGGCCGGTTTCTGCCGTCTGTGGATCCCGGGCTTCGCTGAAATGGCGGCGCCTAGCCGGTTGGCCGCCATGCCTGCGTATGGCCAACCACTGGTTATCCGTGCTCCGCACGCCGTTGAGGCACTGGTTAAACAGCCACCGACGCTCGTATGACCCACTATCAAGCGCTGCTGCTGGATACCGATCGTGTTCAGTTCGGCCCGGTTCCCAGCCACTCTGCTGCCGCTGCCTGAAGAAGGCCTGCAGCATAATTGTCTGGACATCCTACCCGCCCGGATCTGACTGATCAGCCTCTGCCAGATGCCGACCACACCTGGTATACTGACGGTTTACACCAATAGCCGTTACGCGTTCGCCACGGCTCATATCCATGGTGAAATTTACCGTCGTCCGTAAAGCGGCGATCACTGAAACCCCGGATACCAGCACCCTGCTGATC(SEQIDNO:20)。[0200]編碼MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體Mut5的核苷酸序列：[0201]ATGCTGAACATTGAAGACGAGCACCGCCTGCACGAAACCTCTAAAGAACCGGACGTATCCCTGGGTAGCACCTGGCTGTCCGACTTCCCTCAGGCGTGGGCTGAAACTGGCGGTATGGGTCTGGCGGTTCAAGCCGCACATCCAGCGTCTGCTGGACCAGGGTATCCTGGTGCCGTGTCAGTCTCCGTGATCCACCCGACCGTTCCGAACCCTTACAACCTGCTGTCTGGTCTGCCACCGTCCCATCAGTGGTACCTGAAAGACGCCAATTTCTGCCTGCGCCTGCACCCGACCTCTCAGCCGCTGTTCGCTTTCGAGGAAATGGGCATCTCTGGCCAGCTGACTTGGACCCGCCTGCCGCAGGGTTTCAAAAACTCGAAGCACTGCATCGCGATCTGGCGGATTTCCGTATTCAGCACCCAGACCTGATCCTGCTGTGCTGCTGGCTGCCACTAGCGAACTGGATTGTCAGCAAGGCACTCGTGCCCTGCTGCAAACAATTCCTGGGTACCGCAGGCTTCTGCCGTCTGTGGATCCCGGGTTTCGCCGAAATGGCGGCCCCGAAGGCGTTCTGACGCAGAAACTGGGTCCGTGTGCCGGTTGGCCGCCGTGTCTGCGTATGGTAGCCGCGGGCCAGCCGCTGGTGATCCCGGCTCCGCACGCGGTTGACGCGCGTATGACCCACTACCAGGCGCTGCTGCTGGACACCGATCGTGTTCAGTTCGGTCCTGTGACCCGTCCAGATCTGACTGATCAGCCGCTGCCAGACGCTGATCATACCTGGTATACCGACGGTAGTATACCAACTCCCGTTATGCGTTTGCTACTGCCCACATCCACGGTGAAATCTACCGTCGTCCATCATCCACTGTCCAGGCCATCAGAAGGGTCATTCTGCCGAGGCACGTGGTAACCGTATCGTAAGGCAGCCATTACCGAGACCCCGGACACTTCCACCCTGCTGATC(SEQIDN[0202]編碼MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體Mut6的核苷酸序列：[0203]ATGCTGAACATCGAAGACGAACACCGCCTGCACGAAACCTCTAAAGAACCACTTGGCTGTCTGATTTCCCACAGGCGTGGGCAGAGACTGGCGGCCTGGGCCTGGCAGTATTATCCCGCTGAAAGCGACTTCTACCCCGGTGAGCATTAAGCAGTACCCTATGTCTCAGGAAGCTCAAACCGCACATTCAGCGTCTGCTGGATCAGGGCATTCTGGTTCCGTGCCAGAGCCCGTGATCCACCCTACTGTGCCGAACCCGTACAACCTGCTGTCCGGTCTGCCGCCGAGCCACCAATGGTAACCTGAAGGACGCGAACTTTTGCCTGCGTCTGCACCCAACGTCTCAACCGCTGTTCGCATTTGAAGGAAATGGGTATCTCTGGCCAACTGACCTGGACCCGTCTGCCACAGGGTTTCAAAAACAGCGAAGCACTGCATCGCGATCTGGCTGACTTCCGCATCCAGCATCCTGACCTGATCCTGCTGAATTTCTGGGTACTGCCGGTTTCTGCCGCCTGTGGATCCCAGGCTTCGCAGAAATGGCGGCGCCGACCGCGCCGGCACTGGGTCTGCCAGACCTGACTAAATGCTGGTTGGCCGCCGTGCCTGCGTATGGTAGCAGCAGGCCAGCCGCTGGTTATCAAAGCGCCGCACGCTGTTGAGGCTCTGGTCAAACAACCGCCGGACGCCCGTATGACGCACTATCAGGCGCTGCTGCTGGACACTGACCGCGTTCAGTTTGGCCCGGTAACCCGTCCGGACCTGACTGACCAGCCACTGCCGGATGCGGACCACACCTGGTACACCGCTGGCTTACACTAACTCCCGTTATGCGTTCGCTACCGCACATATCCACGGCGAAATCTATCGTCGCCCGCAAAGCGGCGATTACCGAAACCCCGGACACCAGCACTCTGCTGATC(SEQID[0204]編碼MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體Mut7的核苷酸序列：[0205]ATGCTGAACATCGAAGATGAACACCGCCTGCACGAAACTTCCAAAGAACCN118406670B說明書1TACTTGGCTGTCTGACTTTCCGCAGGCTTGGGCCGAAACTGGTGGCCTGGGTCTGGCAGTAATCATCCCGCTGAAAGCCACCTCCACCCCTGTTTCTATCAAACAGTACCCGATGTCCCGTGAAGCTTAAACCGCACATCCAGCGTCTGCTGGATCAGGGCATTCTGGTGCCGTGCCAGTCTCCTTGATTCATCCGACTGTTCCGAATCCATACAACCTGCTGAGCGGCCTGCCGCCTTCTCACCAATGGTATCTGAAAGACGCCTTCTTCCATCTGCGTCTGCACCCGACCTCTCAACCGCTGTTCGCTTTCGATGAAATGGGTATTAGCGGTCAGCTGACCTGGACCCGCCTGCCGCAGGGTTTCAAGAACTCCGAAGCCCTGCACCGTGACCTGGCTGATTTTCGCATCCAACACCCGGACCTGATCCTGCTGTGCTGCTGGCCGCCACCTCTGAACTGGATTGCCAGCAGGGTACCCGTGCCCTGCTGCAGACAATTCCTGGGTACCGCAGGTTTCTGTCGTCTGTGGATCCCAGGCTTCGCTGAAATGGCGGCCCCGACTGCTCCGGCTCTGGGTCTGCCTGATCTGACGAAACCGTTCGAGCTGTTTGTGGACGAAAAGCAGAAGGTGTTCTGACGCAGAAACTGGGCCCGTGGGCAGGTTGGCCGCCGTGTCTGCGCATGGTTGCTGCGATTGCAGTTCTGACGAAAGATGCCGGCCAGCCTCTGGTCATCCTGGCTCCGCACGCTGTCGAGGCTCTGGTTAAACAGCCACCGACGCCCGTATGACTCATTACCAGGCGCTGCTGCTGGATACCGATCGTGTGCAATTTGGCCCGGAACCCGGCTACCCTGCTGCCGCTGCCGGAGGACCCGCCCTGATCTGACTGATCAGCCGCTGCCAGACGCCGATCACACTTGGTACACTGACGGTTTATACCGACTCTCGTTATGCGTTCGCAACTGCACATATTCATGGTGAGATCTACCGCCGTCCGCAAGGCGGCAATTACTGAGACTCCGGACACTAGCACTCTGCTGATC(SEQIDNO:23)。[0207]ATGCTGAACATCGAAGATGAACACCGCCTGCATGAAACTTCCAAGGAACCAGACGTATCTCTGGCACTTGGCTGTCCGATTTCCCGCAGGCTTGGGCGGAAACTGGTGGTCTGGGTCTGGCTGTTCAAACCGCATATCCAGCGTCTGCTGGATCAGGGTATCCTGGTACCGTGCCAGTCTCCGTGATCCACCCTACTGTCCCGAACCCATACAATCTGCTGAGCGGTCTGCCACCGAGCCATCAATGGTAACCTGAAAGATGCTAACTTCTGTCTGCGTCTGCACCCAACTTCTCAACCTCTGTTCGCTTTCGAAGGAAATGGGCATCAGCGGCCAACTGACGTGGACCCGTCTGCCGCAGGGTTTTAAAAACTCTGAAGCCCTGCACCGCGATCTGGCAGACTTCCGTATCCAGCACCCAGATCTGATCCTGCTGTGCTGCTGGCTGCTACGAGCGAACTGGACTGTCAGCAAGTTCCTGGGCACTGCAGGTTTCCAGCGCCTGTGGATCCCAGGTTTTGCGGAAATGGCAGCCCCGAGGGTGTGCTGACTCAGAAATGCGGGCTGGCCTCCTTGCCTGCGTATGGTTGCCGCGATCGCGGTTCTGACTAAGGATGCTACGCACGTATGACTCACTATCAGGCTCTGCTGCTGGACACCGATCGTGTTCAGTTCGGTCCTGTTTCCGGCTACTCTGCTGCCGCTGCCAGAAGAAGGTCTGCAGCATAACTGTCTGGATATCCTGACTCGCCCTGATCTGACCGACCAGCCGCTGCCGGACGCAGACCATACCTGGTACACTGCCGGTTCTACACCGATTCCCGTTATGCTTTCGCAACTGCACACATCCACGGCGAAATCTACCGCCGTCCGTAAAGCAGCAATCACTGAAACGCCAGACACCTCTACTCTGCTGATC(SEQ[0208]編碼MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體MutCACGTGGCTGTCTGACTTCCCTCAGGCGTGGGCTGAAACTGGCGGTATGGGTCTGGCGGTGATTATTCCGCTGAAAGCAACTTCCACCCCGGTCTCCATCAAACAGTATCCGATGAGCCGTGAAGCTTAAGCCGCATATCCAGCGTCTGCTGGACCAGGGCATTCTGGTTCCGTGCCAGTCCCCGTGATCCATCCGACCGTGCCGAACCCTTACAACCTGCTGTCTGGCCTGCCGCCAAGCCACCAGTGGTAACCTGAAGGACGCTTTCTTCTGCCTGCGTCTGCATCCGACCTCCCAACCGCTGTTCGCATTCGAGGGAAATGGGCACGTCTGGTCAACTGACGTGGACCCGCCTGCCTCAGGGCTTCAAGAACTCGAAGCGCTGCATCGTGACCTGGCTGACTTCCGTATCCAGCACCCTGACCTGATCCTGCTGTGCTGCTGGCGGCTACCAGCGAACTGGATTGTCAGCAAATTTCTGGGTACTGCTGGTTTCTGCCGCCTGTGGATCCCGGGTTTCGCAGAAATGGCAGCGCCGGACCAAATCTGGTACTCTGTTTAACTGACCGCACCAGCTCTGGGTCTGCCGGACCTGACTAAACCGTTTGAACTGTTTGTGGATGAGAAACAGTGCGGGTTGGCCGCCGTGCCTGCGTATGGTCGCTGCTATTGCAGTTCTGACCAAAGATGCGGACGCACGTATGACCCACTACCAGGCGCTGCTGCTGGACCCGTCCGGATCTGACCGATCAGCCACTGCCGGATGCGGATCATACCTGGTACACTGACGGTAGTACCTCTGCTCAACGTGCGGAACTGATCGTACACCAACTCCCGTTACGCGTTCGCGACCGCACATATCCATGGTGAAATCTACCGCCGCCCGCAAAGCGGCGATCACCGAAACCCCGGATACTAGCACCCTGCTGATC(SEQID[0211]ATGCTGAACCACGTGGCTGTCCGATTTTCCGCAAGCGTGGGCTGAAACTGGCGGCATGGGTCTGGCTGTATCATTCCGCTGAAAGCGACTTCTACTCCGGTTAGCATCAAACAGTACCCTATGTCCCAGGAGGCTGAAGCCGCACATTCAGCGTCTGCTGGATCTGGGCATCCTGGTACCGTGTCAAAGCCCATGATCCATCCTACCGTGCCGAACCCATATAACCTGCTGTCCGGTCTGCCGCCGTCCCACCAATGGTATCTGAAGGACGCAAACTTCCATCTGCGTCTGCACCCGACCTCTCAGCCGCTGTTTGCATTCGAAGGAAATGGGCACGTCTGGCCAGCTGACTTGGACCCGTCTGCCGCAGGGCTTCAAAAACTCGAAGCACTGCACCGCGACCTGGCAGACTTTCGCATCCAGCACCCAGACCTGATCCTGCTGAATTTCTGGGCACCGCAGGTTTTTGTCGCCTGTGGATCCCGGGTTTTGCGGAAATGGCGGCTCCAAAGGCGTTCTGACCCAGAAACTGGGTCCATGGCGTCGTCCAGCTGGTTGGCCGCCTTGCCTGCGCATGGTCGCGGCTACGCACGTATGACCCACTACCAGGCTCTGCTGCTGGACACTGACCGTGTACAGTTTGGTCCGGTTACCCGTCCGGATCTGACTGATCAGCCGCTGCCGGATGCGGACCATACCTGGTACACCGATGGCAGTACACGGACAGCCGTTACGCATTCGCAACCGCACACATCCACGGCGAGATCTATCGTCGTCCGTAAAGCTGCTATCACCGAAACGCCGGACACGTCCACCCTGCTGATC(SEQ[0212](2)將獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞E.coliBLDE3中，培養(yǎng)后，挑取單菌落，接種至LB(含100μg/mL的氨芐西林)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8,加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L,25℃誘導(dǎo)5h,4℃、4200rpm離心收集菌體，加入裂解緩沖液并超聲破碎，SDS電泳檢測目的蛋白的表達(dá)情況，檢測結(jié)果如圖2所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠高效表達(dá)[0213](3)將步驟(2)中獲得的能夠表達(dá)所述增強(qiáng)型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的重組菌，接種至含100μg/mL的氨芐西林的100mLLB培養(yǎng)基中，放置于25℃搖床中振蕩培養(yǎng)過夜，獲得種CN118406670B說明書17/20頁子液。解緩沖液(50mMTris-HC1,300mMNaCl,0.15%Triton碎儀裂解菌體。將裂解后菌體在4℃下12000rpm離心30min。上清液于4℃下12000rpm離心5%Glycerol,pH7.8;洗脫緩沖液為緩沖液B:50mMTris-HC1,300mMNaC1,250mM[0220]實(shí)驗(yàn)試劑：結(jié)合緩沖液為緩沖液C:20mMTris-HC1,200mMNaC1,5%(V/V)DTT,50%Glycerol,1mMEDTA,pH7.8。[0221]實(shí)驗(yàn)方法：將Ni親和層析柱純化獲得的透析液樣品上樣至已用緩沖液C平衡好的[0223]本實(shí)施例對實(shí)施例1中得到的增強(qiáng)型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體進(jìn)行酶活檢測。具體方[0224]將實(shí)施例1中純化得到的增強(qiáng)型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體Mut1,Mut2,Mut3,Mut4,[0225]Test1:5’-TT轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：