3.2基因工程的基本操作程序（第一步）2普通棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲棉1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。思考：1.你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎？2.培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟呢？3【資料1】蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲。

當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。1.Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理？2.抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會(huì)不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒(méi)有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生上述影響。4培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡(jiǎn)要過(guò)程蘇云金桿菌與載體拼接

棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測(cè)與鑒定5一、第一步：目的基因的篩選與獲取1目的基因：（1）概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。（2）實(shí)例：抗逆性基因生產(chǎn)藥物基因毒物降解基因工業(yè)用酶基因抗蟲棉產(chǎn)生胰島素的基因編碼蛋白質(zhì)的基因產(chǎn)生果膠酶的基因6一、第一步：目的基因的篩選與獲取資料：蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因2篩選合適的目的基因：①?gòu)南嚓P(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選目的基因：科學(xué)家已經(jīng)明確Bt基因的序列信息，也對(duì)Bt抗蟲蛋白有深入了解。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）、序列比對(duì)工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來(lái)越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知。789知識(shí)拓展——基因的結(jié)構(gòu)基因1基因2基因3DNA片段放大基因通常是___。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段不直接編碼蛋白質(zhì)，能調(diào)控基因表達(dá)不直接編碼蛋白質(zhì)，能調(diào)控基因表達(dá)有遺傳效應(yīng)的DNA片段10與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA啟動(dòng)子終止子本質(zhì)：位置：作用：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位于基因上游也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位于基因下游終止轉(zhuǎn)錄本質(zhì)：位置：作用：?jiǎn)?dòng)子終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)連續(xù)的、不間隔的112、真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)外顯子：內(nèi)含子：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的序列能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的序列間隔的、不連續(xù)的123、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點(diǎn)都由能夠

的編碼區(qū)和具有

作用的非編碼區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼蛋白質(zhì)調(diào)控13一、第一步：目的基因的篩選與獲取3獲取目的基因的方法：（1）從生物組織中直接獲取從供體細(xì)胞直接獲取目的基因常用的方法是“鳥槍法”。缺點(diǎn):工作量大，具有一定的盲目性。14一、第一步：目的基因的篩選與獲取3獲取目的基因的方法：（2）從基因文庫(kù)中獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。供體生物基因組DNADNA片段限制酶酶切與載體重組導(dǎo)入成熟的mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA與載體重組導(dǎo)入基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)基因文庫(kù)提取提?。ò环N生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）15【思考】真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？轉(zhuǎn)錄初級(jí)RNA成熟mRNA剪切、拼接DNA聚合酶單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制cDNA不含有非編碼序列。即啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合部位外顯子內(nèi)含子12345啟動(dòng)子終止子文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小有無(wú)非編碼區(qū)基因中內(nèi)含子基因多少小大真核生物有無(wú)真核生物有某種生物的部分基因某種生物的全部基因cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)的比較無(wú)，（在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，必須加入_________等調(diào)控元件才能實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)）啟動(dòng)子如果要將人胰島素基因?qū)氲酱竽c桿菌中表達(dá)，從哪種基因文庫(kù)獲取目的基因較好？為什么？從cDNA文庫(kù)獲取目的基因較好?；蚪M文庫(kù)的基因含內(nèi)含子，大腸桿菌缺乏真核基因轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制（剪切、連接RNA），而cDNA文庫(kù)不含內(nèi)含子。173獲取目的基因的方法：（3）人工合成目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成反轉(zhuǎn)錄法：根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成①前提：②方法：DNA合成儀基因比較小、核苷酸序列已知通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因183獲取目的基因的方法：（4）利用PCR（PolymeraseChainReaction）獲取和擴(kuò)增目的基因蘇云金桿菌Bt基因？大量Bt基因提取全稱：原理：操作環(huán)境：目的：優(yōu)點(diǎn)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)PCR擴(kuò)增儀①PCR的概念：模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程，在體外快速擴(kuò)增特定的DNA片段。要點(diǎn)回顧

：體內(nèi)DNA復(fù)制19模板：原料：能量：酶：DNA的兩條母鏈4種游離的脫氧核苷酸③復(fù)制特點(diǎn):①邊解旋邊復(fù)制

堿基互補(bǔ)配對(duì)原則（保證復(fù)制的準(zhǔn)確進(jìn)行）①條件②復(fù)制原則:要點(diǎn)回顧

：體內(nèi)DNA復(fù)制ATP②半保留復(fù)制DNA聚合酶（形成磷酸二酯鍵）解旋酶（解螺旋，打開(kāi)氫鍵）④子鏈的延伸方向：5'端→3'端引物：使DNA聚合酶能從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸DNA聚合酶特點(diǎn)1：只能5'端→3'端21是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列___________的短單鏈核酸。DNA聚合酶特點(diǎn)2：無(wú)法從頭合成DNA鏈拓展

：引物3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2解旋酶引物結(jié)合在模板鏈的____端。3’引物的概念：細(xì)胞外（PCR）一般以DNA單鏈為引物（不切除）細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制通常以RNA單鏈為引物（后續(xù)被酶切除）引物的本質(zhì)：互補(bǔ)配對(duì)22體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分在DNA復(fù)制中的作用PCR中參與的組分

反應(yīng)還需要其它條件：解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常為小的單鏈RNA）無(wú)需解旋酶，用高溫代替DNA（目的基因）模板4種脫氧核苷酸(dNTP)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常與兩條模板鏈結(jié)合的2種短的單鏈DNA）如緩沖液（一般添加Mg2+）、和控溫設(shè)備②PCR的進(jìn)行需要的條件：dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）打開(kāi)DNA雙鏈，破壞氫鍵提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸功能：①提供原料；②提供能量3獲取目的基因的方法：23【拓展】DNA的復(fù)制的原料--dNTP

dNTP是脫氧核苷三磷酸的縮寫，N是指A、T、G、C四種含氮堿基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它們是由兩個(gè)磷酸分子和一個(gè)脫氧核苷酸組成的，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖如下：PPP～～N脫氧核糖ATGC脫氧核苷酸dNTP還通過(guò)高能磷酸鍵的斷裂釋放能量，供給DNA聚合酶進(jìn)行合成反應(yīng)dATPdGTPdCTPdTTP在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。24體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分在DNA復(fù)制中的作用PCR中參與的組分

反應(yīng)還需要其它條件：解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常為小的單鏈RNA）無(wú)需解旋酶，用高溫代替DNA（目的基因）模板4種脫氧核苷酸(dNTP)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常與兩條模板鏈結(jié)合的2種短的單鏈DNA）如緩沖液（一般添加Mg2+）、和控溫設(shè)備②PCR的進(jìn)行需要的條件：dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）打開(kāi)DNA雙鏈，破壞氫鍵提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸功能：①提供原料；②提供能量3獲取目的基因的方法：25③PCR的過(guò)程：3獲取目的基因的方法：2627（4）利用PCR（PolymeraseChainReaction）獲取和擴(kuò)增目的基因③PCR的過(guò)程：當(dāng)溫度超過(guò)______以上時(shí)，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條條__________。

(1)變性：氫鍵單鏈DNA變性90℃待擴(kuò)增的DNA片段3’3’5’5’3’5’3’5’不需要解旋酶【思考】變性的溫度為何是90℃以上的一個(gè)溫度范圍，而不是95℃？因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時(shí)，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時(shí)，所需溫度也就越低。變性

復(fù)性延伸28（4）利用PCR（PolymeraseChainReaction）獲取和擴(kuò)增目的基因③PCR的過(guò)程：變性

復(fù)性延伸3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’【思考】為什么需要引物？

引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因?yàn)門aq酶不能從頭開(kāi)始添加核苷酸。②引物結(jié)合在DNA模板鏈3'端位置，引導(dǎo)子鏈從5'端→3'端方向復(fù)制。當(dāng)溫度下降

到左右時(shí)，

種引物通過(guò)_____________與兩條單鏈DNA結(jié)合。

(2)復(fù)性：堿基互補(bǔ)配對(duì)50℃兩便于引物與互補(bǔ)DNA鏈結(jié)合【思考】若設(shè)計(jì)的引物與模板不完全配對(duì)，可適當(dāng)_______PCR復(fù)性的溫度。降低設(shè)計(jì)引物時(shí)必須依據(jù)：目的基因的核苷酸序列

29（4）利用PCR（PolymeraseChainReaction）獲取和擴(kuò)增目的基因③PCR的過(guò)程：變性

復(fù)性延伸當(dāng)溫度上升到______左右時(shí)，溶液中的4種_____________在耐高溫的_______的作用下，根據(jù)_______________原則合成新的DNA鏈。

脫氧核苷酸72℃(3)延伸：Taq酶3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’Taq酶3’Taq酶3’【思考】為什么溫度要上升至72℃？72℃是Taq酶的最適溫度堿基互補(bǔ)配對(duì)【思考】Taq酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？Taq酶結(jié)合在引物的3’端30③PCR的過(guò)程：耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（dNTP）引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）5’5’變性復(fù)性延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈31③PCR的過(guò)程：DNA解鏈為單鏈高溫(95℃)變性低溫(50℃)復(fù)性中溫(72℃)延伸引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈Taq酶從引物起始進(jìn)行子鏈的合成PCR過(guò)程可以在PCR擴(kuò)增(PCR儀)中自動(dòng)完成322、PCR擴(kuò)增過(guò)程中

需要源源不斷的加入。1、一個(gè)循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的______。模板引物、原料第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物第一輪循環(huán)的產(chǎn)物復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)含引物的DNA分子數(shù)含引物1的DNA分子數(shù)同時(shí)含引物1和2的DNA分子數(shù)消耗引物數(shù)量2n2n2n-12n-22n+1-22482481370262614引物1引物233長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)211第一次擴(kuò)增34中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)2長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)233第二次擴(kuò)增35第三次擴(kuò)增中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)4長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)277短鏈-短鏈DNA______個(gè)2出現(xiàn)完整的目的基因

36第四次擴(kuò)增中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)6長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)21515短鏈-短鏈DNA______個(gè)8含脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)0＝21－20＝22－42＝23－62n－2n373839【小試牛刀】：根據(jù)查詢的Bt基因編碼鏈序列，嘗試設(shè)計(jì)引物。要求：1.寫出互補(bǔ)鏈的堿基序列，并注明方向。2.從①－④中選擇2個(gè)合適的位置設(shè)計(jì)引物，寫出引物的部分序列，并注明方向。5’-ATG……ATCGAGACCGGT……TAA-3’3’-TAC……TAGCTCTGGCCA……ATT-5’①②③④3’…ATT-5’5’-ATG…3’1、PCR擴(kuò)增時(shí)至少需要____種引物，原因是__________________________________22、設(shè)計(jì)引物的要求：①2種引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，原因是：__________________________。②同種引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，原因是：_____________________。防止引物自身配對(duì)折疊防止引物之間配對(duì)，導(dǎo)致引物不能與模板鏈結(jié)合DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模ㄐ蛄胁煌〨TCCGA40思考

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討論問(wèn)題1：復(fù)性的過(guò)程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？有沒(méi)有其他可能？不一定；可能會(huì)出現(xiàn)：①引物與DNA模板結(jié)合②解開(kāi)的兩條模板鏈重新結(jié)合③引物與引物結(jié)合④引物自身匹配結(jié)合加入過(guò)量的引物，引物與模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會(huì)。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，避免引物之間的堿基序列互補(bǔ)成雙鏈問(wèn)題2：怎樣提高復(fù)性時(shí)引物與模板配對(duì)結(jié)合率，

而不是模板鏈之間配對(duì)結(jié)合呢？（概率學(xué)）問(wèn)題3：如何避免引物與引物結(jié)合？41思考

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討論問(wèn)題4：用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？（p79）問(wèn)題5：如果需要擴(kuò)增mRNA上的遺傳信息，該如何操作？①DNA聚合酶無(wú)法識(shí)別RNA；②高溫變性步驟會(huì)破壞RNA的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其降解。不能！單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNA引物、DNA聚合酶雙鏈DNAPCR擴(kuò)增需要將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再進(jìn)行擴(kuò)增。42思考

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討論問(wèn)題7：PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？問(wèn)題8：由此可知在擴(kuò)增目的基因時(shí)，引物是根據(jù)什么來(lái)設(shè)計(jì)的？一般不是；擴(kuò)增的是兩種引物之間所對(duì)應(yīng)的特定DNA片段；設(shè)計(jì)引物時(shí)必須依據(jù)：目的基因的核苷酸序列

PCR進(jìn)行的前提條件是：已知目的基因的DNA序列43思考

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討論問(wèn)題6：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段(即出現(xiàn)完整的目的基因)？5’3’5’5’3’5’3’3’第三次循環(huán)44課堂檢測(cè)1.PCR是一種在體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，其最大的特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅度擴(kuò)增。引物的設(shè)計(jì)對(duì)DN