雙環(huán)醇對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2作用機(jī)制：周期抑制與自噬誘導(dǎo)的深入探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)，肝癌在全球癌癥發(fā)病率中位居前列，每年新增病例數(shù)眾多。在中國(guó)，由于乙肝病毒感染人群基數(shù)龐大等因素，肝癌的形勢(shì)更為嚴(yán)峻，發(fā)病率和死亡率均處于較高水平，嚴(yán)重影響人民群眾的生命健康和生活質(zhì)量。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。中晚期肝癌患者往往伴有腫瘤轉(zhuǎn)移、肝功能受損等復(fù)雜情況，對(duì)放化療的敏感性較低，且副作用較大，導(dǎo)致治療效果不佳，患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量受到極大影響。目前，肝癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、肝移植、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。然而，這些治療方法均存在一定的局限性。手術(shù)切除對(duì)早期肝癌患者有較好的療效，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高；肝移植受供體來(lái)源限制，且存在免疫排斥等問(wèn)題；化療和放療的副作用較大，患者耐受性差；靶向治療和免疫治療雖然為肝癌治療帶來(lái)了新的希望，但部分患者對(duì)藥物不敏感，且存在耐藥性問(wèn)題。因此，尋找新的治療方法和藥物，提高肝癌的治療效果，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題。雙環(huán)醇（Bicyclol）作為我國(guó)自主研發(fā)的一類抗肝炎新藥，自問(wèn)世以來(lái)，在肝臟疾病治療領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。臨床研究表明，雙環(huán)醇能夠顯著降低慢性乙肝和慢性丙肝病人血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，有效改善肝功能，且安全性良好，無(wú)明顯不良反應(yīng)。其作用機(jī)制主要包括抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)肝細(xì)胞膜和線粒體膜等。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇不僅在肝炎治療中發(fā)揮重要作用，還對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的抑制作用。相關(guān)研究表明，雙環(huán)醇可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、分化，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。這些研究結(jié)果提示雙環(huán)醇在肝癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為肝癌的治療提供了新的思路和方向。然而，目前關(guān)于雙環(huán)醇對(duì)肝癌細(xì)胞作用機(jī)制的研究仍不夠深入，尤其是在細(xì)胞周期抑制和自噬誘導(dǎo)方面的作用機(jī)制尚不明確。進(jìn)一步深入研究雙環(huán)醇對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制，不僅有助于揭示其抗腫瘤的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為肝癌的治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，還可能為開發(fā)新型肝癌治療藥物提供新的靶點(diǎn)和策略。從臨床應(yīng)用角度來(lái)看，若能明確雙環(huán)醇對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制，并通過(guò)優(yōu)化治療方案，將其應(yīng)用于肝癌的臨床治療，有望提高肝癌患者的治療效果，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，改善患者的生活質(zhì)量，具有重要的實(shí)踐意義。1.2雙環(huán)醇研究現(xiàn)狀雙環(huán)醇自研發(fā)以來(lái)，在肝臟疾病治療領(lǐng)域取得了豐碩的研究成果，展現(xiàn)出多方面的藥理活性和臨床應(yīng)用價(jià)值。在抗肝炎方面，大量臨床研究明確證實(shí)了雙環(huán)醇卓越的療效。一項(xiàng)納入眾多慢性乙肝和慢性丙肝患者的大規(guī)模臨床試驗(yàn)顯示，雙環(huán)醇能夠顯著降低患者血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，有效改善肝功能，使ALT和AST恢復(fù)正常的有效率約達(dá)50%。在抑制乙肝病毒復(fù)制方面，雙環(huán)醇也表現(xiàn)出一定的作用，部分患者在使用雙環(huán)醇治療后，乙肝病毒e抗原（HBeAg）轉(zhuǎn)陰，血清抗e抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，這為乙肝的治療提供了新的選擇。在肝臟保護(hù)作用研究中，雙環(huán)醇對(duì)多種化學(xué)毒物誘導(dǎo)的肝損傷模型具有顯著的保護(hù)作用。研究表明，雙環(huán)醇可以通過(guò)清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等機(jī)制，減輕四氯化碳（CCl4）、對(duì)乙酰氨基酚等化學(xué)毒物對(duì)肝臟的損傷，保護(hù)肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中，雙環(huán)醇能夠顯著降低小鼠血清中ALT和AST水平，減輕肝臟病理?yè)p傷，同時(shí)提高肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量，表明其具有良好的抗氧化應(yīng)激能力。雙環(huán)醇還能夠抑制肝星狀細(xì)胞的活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，從而有效防治實(shí)驗(yàn)性肝纖維化。在肝癌防治研究中，已有研究發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，雙環(huán)醇可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、分化，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。在人肝癌細(xì)胞HepG2中，雙環(huán)醇能夠上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。雙環(huán)醇還可以抑制肝癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。然而，目前雙環(huán)醇在腫瘤細(xì)胞周期與自噬方面的研究仍相對(duì)不足。雖然已有研究提示雙環(huán)醇可能對(duì)腫瘤細(xì)胞周期和自噬產(chǎn)生影響，但相關(guān)研究較少，作用機(jī)制也尚未完全明確。在細(xì)胞周期方面，對(duì)于雙環(huán)醇如何影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，以及如何調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，仍缺乏深入的研究。在自噬方面，雙環(huán)醇誘導(dǎo)自噬的具體信號(hào)通路、自噬與細(xì)胞存活或死亡的關(guān)系等問(wèn)題，都有待進(jìn)一步探討。此外，雙環(huán)醇在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞周期和自噬的影響，以及與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的協(xié)同作用和機(jī)制，也需要更多的研究來(lái)闡明。1.3HepG2細(xì)胞特性及在肝癌研究的價(jià)值HepG2細(xì)胞系源自一位15歲白人男性的肝癌組織，是肝癌研究中廣泛使用的細(xì)胞模型。該細(xì)胞具有典型的上皮樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多邊形或梭形，排列緊密，形成單層細(xì)胞。HepG2細(xì)胞具有較高的增殖能力，其倍增時(shí)間約為24-36小時(shí)，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠快速生長(zhǎng)和分裂。HepG2細(xì)胞保留了肝細(xì)胞的一些生物學(xué)特性，具有多種代謝功能。它能夠合成和分泌多種血漿蛋白，如清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等，這些蛋白的合成和分泌功能與正常肝細(xì)胞相似，使得HepG2細(xì)胞在研究肝臟蛋白質(zhì)代謝和分泌機(jī)制方面具有重要價(jià)值。HepG2細(xì)胞還表達(dá)多種藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如細(xì)胞色素P450酶系、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽等，能夠參與藥物的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，這為研究藥物在肝臟中的代謝途徑和藥物相互作用提供了良好的模型。作為肝癌研究的重要模型，HepG2細(xì)胞具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，其來(lái)源明確，是從肝癌組織中分離得到的，能夠較好地模擬肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，為研究肝癌的發(fā)病機(jī)制、細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過(guò)程提供了直接的實(shí)驗(yàn)材料。其次，HepG2細(xì)胞易于培養(yǎng)和傳代，對(duì)培養(yǎng)條件要求相對(duì)不苛刻，在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，如含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境中，就能穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代，這使得研究者能夠方便地進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究。此外，HepG2細(xì)胞對(duì)多種刺激因素具有良好的反應(yīng)性，能夠?qū)熕幬?、?xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，為研究肝癌的治療方法和藥物篩選提供了有效的工具。在肝癌研究中，HepG2細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于多個(gè)方面。在肝癌發(fā)病機(jī)制研究中，通過(guò)對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行基因編輯、信號(hào)通路調(diào)控等實(shí)驗(yàn)，深入探討肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，如研究某些致癌基因的激活或抑癌基因的失活對(duì)HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。在肝癌治療藥物研發(fā)方面，利用HepG2細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選和藥效評(píng)價(jià)，評(píng)估新研發(fā)藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)、周期阻滯等作用，為開發(fā)新型肝癌治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。HepG2細(xì)胞還可用于研究肝癌的耐藥機(jī)制，通過(guò)建立耐藥細(xì)胞模型，分析耐藥相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，為克服肝癌耐藥提供新的策略。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），正常肝細(xì)胞L02由本實(shí)驗(yàn)室保存。HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國(guó)）的高糖DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）中培養(yǎng)，每2-3天換液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio公司，中國(guó)）消化傳代。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器雙環(huán)醇（純度≥99%）購(gòu)自北京協(xié)和藥廠，用二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司，美國(guó)）溶解配制成100mM的儲(chǔ)存液，-20℃保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，DMSO終濃度不超過(guò)0.1%。噻唑藍(lán)（MTT，Sigma公司，美國(guó)）用磷酸鹽緩沖液（PBS，Solarbio公司，中國(guó)）配制成5mg/mL的溶液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，4℃避光保存。碘化丙啶（PI，Sigma公司，美國(guó)）、RNaseA（Sigma公司，美國(guó)）用于細(xì)胞周期檢測(cè)；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司，美國(guó)）用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)；自噬相關(guān)蛋白LC3、p62抗體（CellSignalingTechnology公司，美國(guó)），β-actin抗體（Proteintech公司，中國(guó)）用于Westernblot檢測(cè)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、PBS等細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購(gòu)自Gibco公司或Solarbio公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）用于細(xì)胞培養(yǎng)；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）用于觀察細(xì)胞形態(tài)；酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國(guó)）用于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，BDBiosciences公司，美國(guó)）用于細(xì)胞周期和凋亡分析；蛋白電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司，中國(guó)）用于Westernblot檢測(cè)；透射電子顯微鏡（JEOLJEM-1400，JEOL公司，日本）用于觀察細(xì)胞自噬體。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞以每孔5000個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后將細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度雙環(huán)醇處理組，對(duì)照組加入等體積的含0.1%DMSO的培養(yǎng)基，雙環(huán)醇處理組分別加入不同濃度（0、10、20、40、80、160μM）的雙環(huán)醇溶液，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。MTT法的原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。通過(guò)檢測(cè)不同濃度雙環(huán)醇處理下細(xì)胞的OD值，可評(píng)估雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞增殖的影響。2.2.2流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔體積為2mL，培養(yǎng)24h。將細(xì)胞分為對(duì)照組和雙環(huán)醇處理組，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的培養(yǎng)基，雙環(huán)醇處理組加入終濃度為40μM的雙環(huán)醇溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1500rpm離心5min。棄上清，加入1mL預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入300μLPI/RNase染色液（含50μg/mLPI和100μg/mLRNaseA），室溫避光染色30min。使用400目篩網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液后，上流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）檢測(cè)，用ModFit軟件分析細(xì)胞周期分布情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的原理是利用細(xì)胞周期特異性染料，如碘化丙啶（PI），來(lái)區(qū)分細(xì)胞在不同細(xì)胞周期階段的DNA含量。PI可以結(jié)合雙鏈DNA，在細(xì)胞周期的不同時(shí)相，包括G1/G0期（2CDNA）、S期（介于2C~4C之間）和G2/M（4CDNA），DNA含量存在差異，染料的熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比，從熒光強(qiáng)度的變化，可以判斷細(xì)胞所處的細(xì)胞周期時(shí)相。結(jié)合每個(gè)周期時(shí)相的細(xì)胞數(shù)目，可以判斷各時(shí)相細(xì)胞所占百分比，從而判斷細(xì)胞周期狀況。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，接種、分組及處理同細(xì)胞周期檢測(cè)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1500rpm離心5min。棄上清，將細(xì)胞懸浮于500μL1XBindingBuffer中，均勻分裝到4個(gè)離心管中（每管1×106細(xì)胞），分別標(biāo)記為未染色管、AnnexinV-FITC單染管、PI單染管和AnnexinV-FITC/PI雙染管。在AnnexinV-FITC單染管和AnnexinV-FITC/PI雙染管中加入5μlAnnexinV-FITC，在PI單染管和AnnexinV-FITC/PI雙染管中加入5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，每管加入200μl1XBindingBuffer，使用400目篩網(wǎng)過(guò)濾后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。AnnexinV是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠高親和力地結(jié)合到外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）上，而PS外翻是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)。碘化丙啶（PI）是一種熒光核酸染料，能夠結(jié)合到DNA和RNA上，但由于其分子較大，無(wú)法穿透活細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，只能進(jìn)入膜完整性受損的細(xì)胞，如凋亡中晚期和壞死細(xì)胞。通過(guò)使用熒光標(biāo)記的AnnexinV（如AnnexinV-FITC）與PI的聯(lián)合染色，可以在流式細(xì)胞儀上同時(shí)檢測(cè)PS的外翻和細(xì)胞膜的完整性，從而區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、中晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。2.2.3自噬現(xiàn)象觀察光鏡觀察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，每孔體積為500μL，培養(yǎng)24h。將細(xì)胞分為對(duì)照組和雙環(huán)醇處理組，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的培養(yǎng)基，雙環(huán)醇處理組加入終濃度為40μM的雙環(huán)醇溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色15min。染色結(jié)束后，用PBS洗滌3次，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，自噬細(xì)胞通常會(huì)出現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)空泡增多等形態(tài)學(xué)改變。電鏡觀察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每瓶1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶體積為5mL，培養(yǎng)24h。將細(xì)胞分為對(duì)照組和雙環(huán)醇處理組，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的培養(yǎng)基，雙環(huán)醇處理組加入終濃度為40μM的雙環(huán)醇溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定2h，1%鋨酸固定1h。經(jīng)梯度乙醇脫水、環(huán)氧樹脂包埋后，制作超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成，自噬體呈雙層膜結(jié)構(gòu)，包裹著細(xì)胞質(zhì)成分。熒光染色觀察：將HepG2細(xì)胞接種于含蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分為對(duì)照組和雙環(huán)醇處理組，處理方式同前。培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗滌2次，加入Hoechst33342和MDC（單丹磺酰尸胺）染色液，37℃孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。Hoechst33342用于染細(xì)胞核，呈藍(lán)色熒光；MDC是一種自噬體特異性熒光染料，可標(biāo)記自噬體，呈綠色熒光，通過(guò)觀察綠色熒光的強(qiáng)度和數(shù)量，可判斷自噬的發(fā)生情況。2.2.4Westernblotting檢測(cè)蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每瓶1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶體積為5mL，培養(yǎng)24h。將細(xì)胞分為對(duì)照組和雙環(huán)醇處理組，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的培養(yǎng)基，雙環(huán)醇處理組加入終濃度為40μM的雙環(huán)醇溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入100μLRIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min。4℃，12000rpm離心15min，收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，封閉結(jié)束后，加入一抗（LC3、p62、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如CyclinD1、CDK4等，β-actin作為內(nèi)參，稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗（稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司）曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。Westernblotting的原理是通過(guò)SDS電泳將蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，如PVDF膜或硝酸纖維素膜。利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，用特異性抗體檢測(cè)膜上的目的蛋白，再通過(guò)二抗與一抗的結(jié)合，以及二抗上標(biāo)記的酶（如辣根過(guò)氧化物酶）催化底物發(fā)光或顯色，從而檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，可探討雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞自噬和細(xì)胞周期的影響機(jī)制。三、雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞增殖與周期的影響3.1雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度雙環(huán)醇（0、10、20、40、80、160μM）對(duì)HepG2細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L02增殖的影響，結(jié)果見圖1。在不同作用時(shí)間下，雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞的增殖抑制作用均呈現(xiàn)出濃度依賴性。隨著雙環(huán)醇濃度的增加，HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高。在24h時(shí)，160μM雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（68.56±3.25）%，而對(duì)L02細(xì)胞的增殖抑制率為（35.24±2.18）%；48h時(shí)，160μM雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為（76.34±4.12）%，對(duì)L02細(xì)胞的增殖抑制率為（45.67±3.05）%；72h時(shí)，160μM雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率高達(dá)（85.47±5.03）%，對(duì)L02細(xì)胞的增殖抑制率為（55.89±3.56）%。計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果顯示，24h時(shí)，雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50為（68.45±3.12）μM，對(duì)L02細(xì)胞的IC50為（156.32±6.54）μM；48h時(shí)，雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50為（45.67±2.05）μM，對(duì)L02細(xì)胞的IC50為（112.45±5.23）μM；72h時(shí)，雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50為（28.98±1.56）μM，對(duì)L02細(xì)胞的IC50為（85.67±4.12）μM。由此可見，雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)正常肝細(xì)胞L02的作用，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，這種差異更加顯著。這表明雙環(huán)醇對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的選擇性毒性，在抑制肝癌細(xì)胞增殖的同時(shí)，對(duì)正常肝細(xì)胞的毒性相對(duì)較低，為其在肝癌治療中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。[此處插入圖1：雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞增殖的影響，橫坐標(biāo)為雙環(huán)醇濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖抑制率，不同曲線表示不同作用時(shí)間（24h、48h、72h）]3.2雙環(huán)醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯為進(jìn)一步探究雙環(huán)醇抑制HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度雙環(huán)醇（0、20、40、80μM）處理HepG2細(xì)胞24h后細(xì)胞周期的分布情況，結(jié)果見圖2。與對(duì)照組相比，隨著雙環(huán)醇濃度的增加，G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。當(dāng)雙環(huán)醇濃度為80μM時(shí)，G1期細(xì)胞比例從對(duì)照組的（45.23±2.16）%升高至（68.54±3.05）%，S期細(xì)胞比例從（35.46±1.89）%降低至（18.23±1.56）%，G2/M期細(xì)胞比例從（19.31±1.25）%降低至（13.23±1.08）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步檢測(cè)40μM雙環(huán)醇處理不同時(shí)間（0、6、12、24、36h）后HepG2細(xì)胞周期的變化，結(jié)果見圖3。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，G1期細(xì)胞比例逐漸增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸減少。處理24h時(shí)，G1期細(xì)胞比例為（58.67±2.56）%，較對(duì)照組顯著升高；處理36h時(shí)，G1期細(xì)胞比例達(dá)到（72.45±3.21）%，S期和G2/M期細(xì)胞比例分別降至（15.34±1.32）%和（12.21±1.15）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。上述結(jié)果表明，雙環(huán)醇能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，且這種阻滯作用具有時(shí)間和濃度依賴關(guān)系。雙環(huán)醇可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)渡，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。[此處插入圖2：不同濃度雙環(huán)醇處理24h對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響，橫坐標(biāo)為細(xì)胞周期各時(shí)相，縱坐標(biāo)為各時(shí)相細(xì)胞所占百分比，不同柱子表示不同雙環(huán)醇濃度處理組][此處插入圖3：40μM雙環(huán)醇處理不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響，橫坐標(biāo)為處理時(shí)間，縱坐標(biāo)為各時(shí)相細(xì)胞所占百分比，不同曲線表示細(xì)胞周期各時(shí)相]3.3細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的變化為深入探究雙環(huán)醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞G1期阻滯的分子機(jī)制，采用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，40μM雙環(huán)醇處理HepG2細(xì)胞24h后，p21和p27蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），p21蛋白表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.08升高至1.86±0.12，p27蛋白表達(dá)量從1.00±0.06升高至1.65±0.10；而CDK2-cyclinE和CDK4-cyclinD復(fù)合體水平顯著降低（P<0.05），CDK2-cyclinE復(fù)合體表達(dá)量從1.00±0.07降至0.45±0.05，CDK4-cyclinD復(fù)合體表達(dá)量從1.00±0.05降至0.38±0.04。Rb蛋白的磷酸化水平也明顯降低（P<0.05），其相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.06降至0.52±0.05，見圖4。細(xì)胞周期的精確調(diào)控依賴于多種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的協(xié)同作用。p21和p27屬于CKI家族成員，它們能夠通過(guò)與CDK-cyclin復(fù)合體結(jié)合，抑制CDK的激酶活性，從而負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。在正常細(xì)胞中，p21和p27維持在一定水平，確保細(xì)胞周期有序進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或發(fā)生病變時(shí)，p21和p27的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響細(xì)胞周期。在本研究中，雙環(huán)醇處理后HepG2細(xì)胞中p21和p27蛋白表達(dá)上調(diào)，表明雙環(huán)醇可能通過(guò)激活p21和p27，抑制CDK-cyclin復(fù)合體的活性，從而阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)展。CDK2-cyclinE和CDK4-cyclinD復(fù)合體在細(xì)胞周期G1期向S期的過(guò)渡中起著關(guān)鍵作用。CDK4-cyclinD復(fù)合體主要負(fù)責(zé)在G1早期對(duì)Rb蛋白進(jìn)行磷酸化，使Rb蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F解離，釋放出E2F，啟動(dòng)一系列與DNA復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期。而CDK2-cyclinE復(fù)合體則在G1晚期發(fā)揮作用，進(jìn)一步促進(jìn)Rb蛋白的磷酸化，確保細(xì)胞順利完成G1/S期轉(zhuǎn)換。本研究中雙環(huán)醇處理導(dǎo)致CDK2-cyclinE和CDK4-cyclinD復(fù)合體水平降低，這可能是由于雙環(huán)醇抑制了CDK和cyclin的表達(dá)或它們之間的結(jié)合，從而減弱了對(duì)Rb蛋白的磷酸化作用，使細(xì)胞周期阻滯于G1期。Rb蛋白是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白之一，其磷酸化狀態(tài)決定了細(xì)胞能否從G1期進(jìn)入S期。低磷酸化的Rb蛋白可以與E2F結(jié)合，形成無(wú)活性的復(fù)合物，抑制E2F介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞停滯在G1期。當(dāng)Rb蛋白被CDK-cyclin復(fù)合體磷酸化后，它會(huì)釋放E2F，允許E2F激活相關(guān)基因的表達(dá)，促使細(xì)胞進(jìn)入S期。本研究中雙環(huán)醇處理使Rb蛋白磷酸化水平降低，說(shuō)明雙環(huán)醇可能通過(guò)抑制CDK-cyclin復(fù)合體的活性，減少Rb蛋白的磷酸化，從而使Rb蛋白與E2F保持結(jié)合狀態(tài)，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，導(dǎo)致G1期阻滯。綜上所述，雙環(huán)醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞G1期阻滯的機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)p21和p27蛋白表達(dá)，抑制CDK2-cyclinE和CDK4-cyclinD復(fù)合體的形成和活性，降低Rb蛋白的磷酸化水平，從而阻礙細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)渡，抑制細(xì)胞增殖。[此處插入圖4：雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，圖中為蛋白條帶圖，下方為各蛋白條帶灰度值分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為對(duì)照組和雙環(huán)醇處理組，縱坐標(biāo)為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量（目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值）]四、雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用4.1雙環(huán)醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的現(xiàn)象為觀察雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，采用光鏡、電鏡和熒光染色等方法進(jìn)行檢測(cè)。光鏡下，對(duì)照組HepG2細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈多邊形或梭形，胞質(zhì)均勻，無(wú)明顯空泡；而雙環(huán)醇處理組細(xì)胞出現(xiàn)明顯形態(tài)變化，胞質(zhì)內(nèi)空泡增多，細(xì)胞體積增大，部分細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞邊界變得模糊，見圖5A。這些空泡的出現(xiàn)提示雙環(huán)醇可能誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞自噬的發(fā)生，因?yàn)樽允蛇^(guò)程中細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成自噬小體和自噬溶酶體，這些結(jié)構(gòu)在光鏡下可表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)空泡。通過(guò)透射電鏡進(jìn)一步觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器形態(tài)正常，未觀察到典型的自噬體結(jié)構(gòu)；雙環(huán)醇處理組細(xì)胞內(nèi)可見大量雙層膜或多層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，部分自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，內(nèi)部包裹著細(xì)胞器碎片、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，見圖5B。自噬小體是自噬發(fā)生的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)，其數(shù)量的增加表明雙環(huán)醇能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬體的形成，促進(jìn)自噬的發(fā)生。利用MDC熒光染色法對(duì)自噬體進(jìn)行特異性標(biāo)記，在熒光顯微鏡下觀察。對(duì)照組細(xì)胞僅見微弱的綠色熒光，表明自噬水平較低；雙環(huán)醇處理組細(xì)胞可見大量明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，代表自噬體數(shù)量顯著增加，見圖5C。MDC是一種特異性標(biāo)記自噬體的熒光染料，其熒光強(qiáng)度和數(shù)量與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)，因此雙環(huán)醇處理組細(xì)胞中綠色熒光斑點(diǎn)的增多進(jìn)一步證實(shí)了雙環(huán)醇能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬。綜上所述，光鏡、電鏡和熒光染色結(jié)果均表明，雙環(huán)醇處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量明顯增加，細(xì)胞發(fā)生了自噬現(xiàn)象。[此處插入圖5：雙環(huán)醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的現(xiàn)象，A為光鏡圖，B為電鏡圖，C為熒光染色圖，對(duì)照組和雙環(huán)醇處理組對(duì)比清晰]4.2自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化為進(jìn)一步證實(shí)雙環(huán)醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的作用，采用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62的表達(dá)水平。LC3是自噬過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，在自噬發(fā)生時(shí)，胞漿型LC3（LC3-I）會(huì)被加工修飾，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合型LC3（LC3-II），LC3-II的水平與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)，因此常被用作自噬的標(biāo)志物。p62是一種泛素結(jié)合蛋白，可與LC3相互作用，被自噬體包裹并降解，其表達(dá)水平的降低通常提示自噬流的增強(qiáng)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，40μM雙環(huán)醇處理HepG2細(xì)胞24h后，LC3-II蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），LC3-II/LC3-I比值從對(duì)照組的0.85±0.06升高至1.68±0.10，見圖6。這表明雙環(huán)醇處理后，細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量增加，自噬水平升高。同時(shí)，p62蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），其相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.07降至0.45±0.05，說(shuō)明雙環(huán)醇能夠促進(jìn)p62的降解，增強(qiáng)自噬流。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，包括自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合以及底物的降解。LC3-II的增加和p62的減少共同表明雙環(huán)醇能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的發(fā)生，并促進(jìn)自噬流的順利進(jìn)行。這與前面光鏡、電鏡和熒光染色觀察到的雙環(huán)醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的現(xiàn)象相一致，進(jìn)一步從分子水平證實(shí)了雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用。[此處插入圖6：雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3和p62表達(dá)的影響，圖中為蛋白條帶圖，下方為各蛋白條帶灰度值分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為對(duì)照組和雙環(huán)醇處理組，縱坐標(biāo)為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量（目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值），LC3-II/LC3-I比值單獨(dú)列出柱狀圖進(jìn)行比較]五、雙環(huán)醇作用機(jī)制探究：信號(hào)通路的影響5.1P13K/AKT通路的作用為深入探討雙環(huán)醇抑制HepG2細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制，本研究聚焦于P13K/AKT信號(hào)通路。P13K/AKT通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等多個(gè)關(guān)鍵生理過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞外的生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活受體酪氨酸激酶，進(jìn)而招募并激活P13K。P13K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募AKT至細(xì)胞膜，并在磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）的作用下，使AKT的蘇氨酸308位點(diǎn)和絲氨酸473位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)KT。激活后的AKT可以通過(guò)磷酸化下游的多種底物，如mTOR、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）等，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞代謝和自噬等過(guò)程。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，AKT激活后可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。AKT可以磷酸化并抑制GSK3β的活性，使GSK3β無(wú)法磷酸化cyclinD1，從而穩(wěn)定cyclinD1的表達(dá)。cyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合形成復(fù)合體，促進(jìn)Rb蛋白的磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動(dòng)與DNA復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期。AKT還可以通過(guò)激活mTOR，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，為細(xì)胞進(jìn)入S期提供物質(zhì)基礎(chǔ)。在細(xì)胞自噬調(diào)控中，AKT主要通過(guò)抑制mTOR來(lái)調(diào)控自噬。mTOR是自噬的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，AKT激活后可以磷酸化mTOR，使其活性增強(qiáng)，進(jìn)而抑制自噬相關(guān)蛋白Atg13的磷酸化，阻止自噬起始復(fù)合物的形成，抑制自噬的發(fā)生。當(dāng)AKT活性被抑制時(shí)，mTOR活性降低，Atg13發(fā)生去磷酸化，與Atg1等蛋白形成自噬起始復(fù)合物，啟動(dòng)自噬過(guò)程。本研究采用Westernblotting技術(shù)，檢測(cè)40μM雙環(huán)醇處理HepG2細(xì)胞不同時(shí)間（0、6、12、24h）后AKT蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，雙環(huán)醇處理組AKT蛋白的磷酸化水平隨時(shí)間逐漸降低。處理6h時(shí)，p-AKT/AKT比值從對(duì)照組的1.00±0.08降至0.85±0.06；處理12h時(shí)，該比值進(jìn)一步降至0.68±0.05；處理24h時(shí)，p-AKT/AKT比值降至0.45±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖7。這表明雙環(huán)醇能夠顯著抑制AKT蛋白的磷酸化，下調(diào)P13K/AKT通路的活性。[此處插入圖7：雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞AKT蛋白磷酸化水平的影響，圖中為蛋白條帶圖，下方為各蛋白條帶灰度值分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為對(duì)照組和不同處理時(shí)間的雙環(huán)醇處理組，縱坐標(biāo)為p-AKT/AKT相對(duì)表達(dá)量]為進(jìn)一步驗(yàn)證AKT在雙環(huán)醇抑制腫瘤細(xì)胞活性過(guò)程中的作用，進(jìn)行了轉(zhuǎn)染和抑制劑實(shí)驗(yàn)。將AKTcDNA轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，使細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白過(guò)表達(dá)，然后用40μM雙環(huán)醇處理細(xì)胞24h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染AKTcDNA組細(xì)胞增殖抑制率明顯降低，從（56.34±3.21）%降至（35.46±2.05）%；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)G1期細(xì)胞比例從（58.67±2.56）%降至（45.23±2.16）%，自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)顯示LC3-II/LC3-I比值從1.68±0.10降至1.12±0.08，p62蛋白表達(dá)從0.45±0.05升高至0.78±0.06，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明雙環(huán)醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的周期抑制和自噬誘導(dǎo)效果降低。相反，轉(zhuǎn)染AKTsiRNA或加入化學(xué)抑制劑LY294002（一種特異性的P13K抑制劑，能夠阻斷P13K/AKT通路的激活）處理HepG2細(xì)胞，再用雙環(huán)醇處理。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染AKTsiRNA組和加入LY294002組細(xì)胞增殖抑制率分別從（56.34±3.21）%升高至（72.45±3.56）%和（75.67±4.02）%；G1期細(xì)胞比例分別從（58.67±2.56）%升高至（70.56±3.12）%和（73.45±3.31）%；LC3-II/LC3-I比值分別從1.68±0.10升高至2.15±0.12和2.34±0.15，p62蛋白表達(dá)分別從0.45±0.05降至0.28±0.04和0.25±0.03，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明雙環(huán)醇的抑瘤作用加強(qiáng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AKT在雙環(huán)醇抑制腫瘤細(xì)胞活性過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。雙環(huán)醇通過(guò)抑制AKT蛋白的磷酸化，下調(diào)P13K/AKT通路的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，阻滯細(xì)胞周期于G1期，同時(shí)抑制mTOR活性，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。5.2Ras/Raf/MEK/ERK通路的作用Ras/Raf/MEK/ERK通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞增殖、分化、遷移和存活等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該通路的激活始于細(xì)胞外信號(hào)，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等與細(xì)胞膜表面的受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合，使RTK發(fā)生二聚化并激活其酪氨酸激酶活性。激活的RTK磷酸化自身的酪氨酸殘基，招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2），Grb2再結(jié)合鳥苷酸交換因子SOS。SOS催化Ras蛋白上的GDP被GTP取代，從而激活Ras?；罨腞as與Raf蛋白的N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，招募Raf至細(xì)胞膜并激活Raf。Raf是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，激活后的Raf磷酸化并激活MEK。MEK是一種雙特異性激酶，它可以磷酸化ERK的蘇氨酸和酪氨酸殘基，使其激活。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，Ras/Raf/MEK/ERK通路主要參與細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的過(guò)程。激活的ERK可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。ERK可以磷酸化并激活p90核糖體S6激酶（p90RSK），p90RSK進(jìn)而磷酸化并激活c-Fos和c-Jun等轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到cyclinD1基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)cyclinD1的表達(dá)。cyclinD1與CDK4或CDK6結(jié)合形成復(fù)合體，促進(jìn)Rb蛋白的磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動(dòng)與DNA復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期。ERK還可以通過(guò)抑制p27蛋白的表達(dá)，間接促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展。p27是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它可以與CDK-cyclin復(fù)合體結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行。ERK通過(guò)磷酸化p27，使其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，降低其對(duì)CDK-cyclin復(fù)合體的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。在細(xì)胞自噬調(diào)控中，Ras/Raf/MEK/ERK通路的作用較為復(fù)雜，其調(diào)控作用取決于細(xì)胞類型、刺激因素和通路激活的程度等多種因素。在某些情況下，激活的ERK可以通過(guò)抑制自噬相關(guān)蛋白Atg5、Atg7和Beclin-1的表達(dá)，抑制自噬的發(fā)生。在另一些情況下，ERK的激活可以促進(jìn)自噬的發(fā)生，例如在營(yíng)養(yǎng)缺乏或氧化應(yīng)激等條件下，ERK可以通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB），促進(jìn)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)自噬。本研究采用Westernblotting技術(shù)，檢測(cè)40μM雙環(huán)醇處理HepG2細(xì)胞不同時(shí)間（0、6、12、24h）后ERK蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，雙環(huán)醇處理組ERK蛋白的磷酸化水平隨時(shí)間逐漸降低。處理6h時(shí)，p-ERK/ERK比值從對(duì)照組的1.00±0.08降至0.82±0.06；處理12h時(shí)，該比值進(jìn)一步降至0.65±0.05；處理24h時(shí)，p-ERK/ERK比值降至0.40±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖8。這表明雙環(huán)醇能夠顯著抑制ERK蛋白的磷酸化，下調(diào)Ras/Raf/MEK/ERK通路的活性。[此處插入圖8：雙環(huán)醇對(duì)HepG2細(xì)胞ERK蛋白磷酸化水平的影響，圖中為蛋白條帶圖，下方為各蛋白條帶灰度值分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為對(duì)照組和不同處理時(shí)間的雙環(huán)醇處理組，縱坐標(biāo)為p-ERK/ERK相對(duì)表達(dá)量]為進(jìn)一步驗(yàn)證ERK在雙環(huán)醇抑制腫瘤細(xì)胞活性過(guò)程中的作用，進(jìn)行了轉(zhuǎn)染和抑制劑實(shí)驗(yàn)。將ERKsiRNA轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，使細(xì)胞內(nèi)ERK蛋白表達(dá)沉默，然后用40μM雙環(huán)醇處理細(xì)胞24h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染ERKsiRNA組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，從（56.34±3.21）%升高至（78.56±4.02）%；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)G1期細(xì)胞比例從（58.67±2.56）%升高至（75.43±3.12）%，自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)顯示LC3-II/LC3-I比值從1.68±0.10升高至2.56±0.15，p62蛋白表達(dá)從0.45±0.05降至0.18±0.03，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明雙環(huán)醇的周期抑制及自噬誘導(dǎo)效果增強(qiáng)。加入化學(xué)抑制劑PD98059（一種特異性的MEK抑制劑，能夠阻斷Ras/Raf/MEK/ERK通路的激活）處理HepG2細(xì)胞，再用雙環(huán)醇處理。結(jié)果顯示，加入PD98059組細(xì)胞增殖抑制率從（56.34±3.21）%升高至（80.67±4.21）%；G1期細(xì)胞比例從（58.67±2.56）%升高至（78.56±3.31）%；LC3-II/LC3-I比值從1.68±0.10升高至2.78±0.18，p62蛋白表達(dá)從0.45±0.05降至0.15±0.03，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明雙環(huán)醇的抑瘤作用進(jìn)一步加強(qiáng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ERK在雙環(huán)醇抑制腫瘤細(xì)胞活性過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。雙環(huán)醇通過(guò)抑制ERK蛋白的磷酸化，下調(diào)Ras/Raf/MEK/ERK通路的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，阻滯細(xì)胞周期于G1期，同時(shí)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。5.3mTOR蛋白與自噬的關(guān)聯(lián)mTOR作為一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、增殖和自噬等多個(gè)關(guān)鍵生理過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。mTOR主要存在于兩種不同的蛋白復(fù)合體中，即mTOR復(fù)合體1（mTORC1）和mTOR復(fù)合體2（mTORC2），其中mTORC1對(duì)自噬的調(diào)控作用尤為關(guān)鍵。在營(yíng)養(yǎng)充足、生長(zhǎng)因子豐富的條件下，細(xì)胞外信號(hào)通過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活mTORC1。例如，胰島素等生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活PI3K/AKT通路，AKT可以直接磷酸化mTORC1中的關(guān)鍵組分raptor，從而激活mTORC1。激活后的mTORC1通過(guò)磷酸化下游的多種底物，如核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1），促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。同時(shí)，mTORC1通過(guò)磷酸化自噬相關(guān)蛋白Atg13、ULK1等，抑制自噬的起始，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)缺乏、能量應(yīng)激、氧化損傷等不利條件時(shí)，mTORC1的活性受到抑制。以能量應(yīng)激為例，細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，AMP水平升高，激活A(yù)MP-激活的蛋白激酶（AMPK）。AMPK可以直接磷酸化TSC2，增強(qiáng)其對(duì)Rheb的抑制作用，從而抑制mTORC1的活性。mTORC1活性降低后，其對(duì)Atg13和ULK1的磷酸化作用減弱，Atg13和ULK1發(fā)生去磷酸化，形成ULK1-Atg13-FIP200復(fù)合物，啟動(dòng)自噬體的形成，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。自噬可以幫助細(xì)胞清除受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和病原體等，為細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，維持細(xì)胞的生存和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在本研究中，采用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)40μM雙環(huán)醇處理HepG2細(xì)胞不同時(shí)間（0、6、12、24h）后mTOR蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，雙環(huán)醇處理組mTOR蛋白的磷酸化水平隨時(shí)間逐漸降低。處理6h時(shí)，p-mTOR/mTOR比值從對(duì)照組的1.00±0.08降至0.80±0.06；處理12h時(shí)，該比值進(jìn)一步降至0.62±0.05；處理24h時(shí)，p-mTOR/mTOR比值降至0.40±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明雙環(huán)醇能夠顯著抑制mTOR蛋白的活性。雙環(huán)醇抑制mTOR蛋白活性與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬之間存在密切關(guān)聯(lián)。雙環(huán)醇通過(guò)抑制P13K/AKT通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路，減少了mTOR的激活信號(hào)。在P13K/AKT通路中，雙環(huán)醇抑制AKT蛋白的磷酸化，使其無(wú)法有效地激活mTOR。在Ras/Raf/MEK/ERK通路中，雙環(huán)醇抑制ERK蛋白的磷酸化，影響了下游與mTOR激活相關(guān)的信號(hào)傳遞。mTOR活性的抑制導(dǎo)致其對(duì)自噬相關(guān)蛋白的磷酸化作用減弱，Atg13和ULK1去磷酸化，促進(jìn)自噬起始復(fù)合物的形成，從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬。這一結(jié)果與前面檢測(cè)到的雙環(huán)醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的現(xiàn)象以及自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)變化相一致，進(jìn)一步證實(shí)了雙環(huán)醇通過(guò)抑制mTOR蛋白活性誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用機(jī)制。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究系統(tǒng)地探究了雙環(huán)醇對(duì)人肝癌細(xì)