大胡蜂細(xì)胞色素P450cDNA克隆及序列分析 論文（設(shè)計(jì)）題目大胡蜂細(xì)胞色素p450cDNA克隆及序列分析子課題題目摘要大胡蜂，Vespa(Magnifica)magnificaSmith，屬膜翅目之胡蜂科黃胡蜂屬的一種昆蟲。它是一種分布及其廣泛、種類多樣、行動(dòng)迅速的昆蟲。它會(huì)采用浸軟的像紙漿一樣的木漿筑巢，以植物性或動(dòng)物性的食物為食。在受到攻擊和感受到威脅時(shí)，雌蜂會(huì)使用身上的長(zhǎng)螫針來(lái)攻擊入侵者，有很大危害。但同時(shí)胡蜂蜂毒也有一定的食用和藥用價(jià)值，在民間常有人用胡蜂來(lái)泡酒以達(dá)到治療風(fēng)濕的效果，雖然可以看見療效，但尚還無(wú)法準(zhǔn)確地解釋，究竟是那種物質(zhì)在發(fā)揮作用。也正是因?yàn)楹浞涠镜慕M成成分尚不明確，現(xiàn)階段醫(yī)療上仍然缺乏治療胡蜂蟄傷的特效藥物，導(dǎo)致了目前醫(yī)學(xué)上對(duì)蜇傷的治療其效果不理想，對(duì)傳統(tǒng)中藥中胡蜂和其蜂毒的應(yīng)用及推廣也少了一個(gè)理論支撐。本課題通過(guò)對(duì)總RNA的提取、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、序列比對(duì)等方法對(duì)大胡蜂核細(xì)胞色素P450基因片段進(jìn)行分析，目的是通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到片段序列與已知同屬物種序列進(jìn)行相似性對(duì)比。結(jié)果表明該序列與胡蜂科馬蜂屬的造紙胡蜂（PolistesdominulaChrist）序列有較高的相似性，Identity為85%，表明該多肽為細(xì)胞色素P450的同源物。本實(shí)驗(yàn)為研究大胡蜂毒素的組成成分，并為大胡蜂的資源利用提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)，在生物防治以及衛(wèi)生藥理食品等方面具有一定的意義，便于人類可以更好地應(yīng)用蜂毒?？偟膩?lái)說(shuō)本實(shí)驗(yàn)探究胡蜂毒素的成份對(duì)藥用方面、食用方面都具有重要意義。關(guān)鍵詞：大胡蜂；毒素；細(xì)胞色素p450；序列分析AbstractThewasp,Vespa(Magnifica)magnificaSmith,belongstoHymenopteraofInsecta.Itisawidelydistributed,diverseandfastmovinginsect.Itusessoftpulplikewoodpulptobuildnestsandfeedonplantoranimalfood.Whenattackedandthreatened,femalebeesuselongstingingneedlestoattackinvaders,whichisveryharmful.Butatthesametime,waspvenomalsohascertainedibleandmedicinalvalue.Inthefolk,peopleoftenusewasptosoakwineinordertoachievetheeffectoftreatingrheumatism.Althoughthecurativeeffectcanbeseen,butitisstillunabletoaccuratelyexplainwhatkindofsubstanceisplayingarole.Itispreciselybecausethecompositionofwaspvenomisstillunclear,andthereisstillalackofeffectivemedicinetotreatwaspstingsinmedicaltreatmentatthisstage,whichleadstotheunsatisfactoryeffectonthetreatmentofstingsinmedicineatpresent,andalsolacksatheoreticalsupportfortheapplicationandpromotionofwaspvenomanditsvenomintraditionalChinesemedicine.ThepurposeofthisstudyistoextractthetotalRNA,constructcDNAlibrary,amplifyPCR,agarosegelelectrophoresis,andsequenceratiomethodtoanalyzethenuclearcytochromeP450genefragmentofbigwasp.TheresultsshowedthatthesequencewashighlysimilartothatofPolistesdominulaChrist.Identitywas85%,indicatingthatthepolypeptidewasahomologueofcytochromeP450.Thisexperimentistostudytheconstituentsofwasptoxinandprovidebasictheoreticaldatafortheutilizationofwaspresources.Ithascertainsignificanceinbiologicalcontrolandhygienicpharmacologicalfood.Itisconvenientforhumantousebeevenombetter.Generallyspeaking,thestudyofthecompositionofwasptoxinisofgreatsignificanceinbothmedicinalandedibleaspects.Keywords:Vespa(Magnifica)magnificaSmith;toxin;Cytochromep450;Sequenceanalysis目錄TOC\o"1-4"\h\z\u第一章前言 第一章前言1.1胡蜂的分類胡蜂又稱馬蜂或黃蜂，為膜翅目(Hymenoptera)的捕食性肉食昆蟲。胡蜂分布非常廣泛、種類繁多，可捕食多種昆蟲,筑巢群居,雌蜂有一毒囊會(huì)分泌蜂毒。截止目前，在全世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)胡蜂約6000余種，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的胡蜂多達(dá)200余種。早在《中國(guó)昆蟲名錄》中胡經(jīng)甫就記錄了國(guó)內(nèi)常見的胡蜂共7科，15屬，143種，其中38變種。此后，學(xué)者李鐵生又在四川省發(fā)現(xiàn)胡蜂共50種，云南省胡蜂共55種。在隨后報(bào)道中，張繼祖在福建省發(fā)現(xiàn)胡蜂包括蜾贏科30種，胡蜂科17種[1]，異腹胡蜂科(Polybiidae)3種，鈴腹胡蜂科(Ropalidia)4種和馬蜂科(Polistidae)17種。石達(dá)愷首次描述臺(tái)灣胡蜂共28種[2]，另外，董大志對(duì)胡蜂屬(VespaLinnaeus)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了深一步研究，并將胡蜂屬分為樹巢胡蜂和地巢胡蜂類群兩大類群[3]。1.2大胡蜂的形態(tài)和生物學(xué)特性1.2.1大胡蜂的形態(tài)大胡蜂的發(fā)育具有卵、幼蟲、蛹和成蟲4個(gè)階段，每個(gè)階段的形態(tài)特征各不相同。其卵為一個(gè)白色的光滑的橢圓形球體，卵外層具薄膜，其內(nèi)充滿液體，基部有一絲質(zhì)柄把卵固著懸吊在巢室上，因此人們通?？捎^察到大胡蜂幼蟲倒吊于巢室，卻不會(huì)落下來(lái)。成年大胡蜂的頭部由卵端部形成而來(lái)，卵的基部形成成蟲的腹部。幼蟲：體粗胖，兩端略尖，梭形、白色，無(wú)足，幼蟲消化道不與排泄孔相通，而于中腸部由圍食膜形成一封閉的囊，排泄物被貯存在這囊中化蛹后此囊干硬變黑,隨蛻掉的皮一起脫出;蛹為黃白色，隨老熟程度逐漸加深，頭、胸、腹分明，主要器官均明顯可見，蛹不食，在蜂室內(nèi)羽化成蜂后，以上顎咬破室口鉆出。大胡蜂觸角、翅和跗節(jié)呈橘黃色，身體烏黑發(fā)亮，有黃條紋和成對(duì)的斑點(diǎn)（如圖1.1）。雌蜂體型較大，頭部完全呈棕色，觸角柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)2/3處褐黃色，其余完全為褐色。端齒黑色。胸部棕黑色，有時(shí)中胸背板中央兩側(cè)各具1短棕色縱帶。翅呈棕色，僅前緣和基部色略深。所有足基節(jié)、股節(jié)黑色，脛節(jié)、跗節(jié)淡棕色。第1~5腹節(jié)背板深棕色，端緣各具1窄棕色橫帶，第6腹節(jié)背板完全呈棕色，第1~5節(jié)腹板深棕色，僅端緣色稍淡，第6腹板完全呈棕色[4]。圖1.1大胡蜂形態(tài)頭部：橫寬、光滑、毛稀，較胸部翅基片處窄，兩觸角窩之間呈三角形隆起，額溝明顯。單眼區(qū)凹入，單眼呈三角形排。唇基隆起，端緣中央凹入，兩側(cè)呈齒狀突出。具粗刻點(diǎn)和稀短毛。觸角絲狀，向端部均勻收縮，上顎粗壯下部具3個(gè)端齒，中部刃狀，上部具1粗齒。

胸部：前胸背板向基部?jī)A斜，兩肩角突出呈脊?fàn)?，光滑，具?xì)淺刻點(diǎn)和短毛。中胸背板稍凸起，中央具淺縱溝，兩側(cè)至翅基片處各具1短縱溝，刻點(diǎn)細(xì)密，覆中等密短毛。小盾片凸起，方形，中央具1淺縱溝，光滑，具細(xì)淺刻點(diǎn)和短毛。后小盾片垂直向下，具細(xì)密刻點(diǎn)和絨毛。并胸腹節(jié)向后傾斜，基部中央凹陷，縱溝明顯，具細(xì)密刻點(diǎn)和密長(zhǎng)毛。后胸側(cè)板平滑，具細(xì)密刻點(diǎn)和短毛。翅透明，第3肘室方形，第2肘室與第3肘室寬度近相等。足粗壯，股節(jié)、脛節(jié)膨脹，后足第1跗節(jié)是第2跗節(jié)長(zhǎng)的2.8倍[4]。

腹部：圓筒形，第1腹節(jié)基部截形，長(zhǎng)是寬的4.8倍，第2腹節(jié)較第1腹節(jié)稍長(zhǎng)，長(zhǎng)是寬的1/2，具細(xì)密刻點(diǎn)和密短毛。體長(zhǎng):25~45mm，最長(zhǎng)可達(dá)50mm[4]。雄蜂的體稍小，腹部7節(jié)，除外生殖器外，其余描述與雌蜂相同。大胡蜂雌蜂尾端有長(zhǎng)而粗的螫針（如圖1.2）與毒腺相通，螫人后將毒液射入皮膚內(nèi)，但螫針并不留在皮內(nèi)。黃蜂的口器為嚼吸式，觸角具12或13節(jié)。通常有翅，胸腹之間以纖細(xì)的腰相連。雌體具可怕的螫刺。成蟲主要以花蜜為食，但幼蟲以母體提供的昆蟲為食[5]。圖1.2帶蟄針大胡蜂1.2.2大胡蜂的生物學(xué)特性勞動(dòng)分工，是胡蜂種群真社會(huì)結(jié)構(gòu)的重要標(biāo)志之一，而合理的任務(wù)分配是影響其生態(tài)成功的一個(gè)重要因素。蜂王負(fù)責(zé)生育和產(chǎn)卵，雄峰的功能是與皇后蜂交配繁殖，工蜂無(wú)繁殖能力，主要負(fù)責(zé)收集花粉、花蜜，幼蟲和蜂王的飼養(yǎng)，以及筑巢，清理蜂巢和防止捕食者入侵等。不同年齡的工蜂個(gè)體會(huì)合理地分配任務(wù)以提高效率。通常年輕的工蜂會(huì)承擔(dān)清潔巢穴等在巢穴附近稍微輕松一點(diǎn)的工作；而年老的工蜂則需要擔(dān)起較多的責(zé)任，如外出覓食、取材筑巢、探索、守衛(wèi)等。飛行節(jié)律。胡蜂的晝夜外出飛行的生物生理活動(dòng)節(jié)律是與季節(jié)變換和晝夜更替相適應(yīng)的。胡蜂工蜂與生態(tài)系統(tǒng)間能量轉(zhuǎn)換的重要方式是外出活動(dòng)。胡蜂主要通過(guò)工蜂出外采集食物、建材、信息等活動(dòng)形式和群體內(nèi)個(gè)體的死亡來(lái)完成與外界的能量的交換。自身的因素和周圍的環(huán)境會(huì)影響胡蜂的飛行能力，會(huì)增強(qiáng)或者抑制胡蜂某些行為，其中來(lái)自生態(tài)因子的影響對(duì)胡蜂外出飛行能力的干擾尤為重大。制約胡蜂飛行能力的主要因素是溫度，極端的溫度（高溫和低溫）會(huì)使胡蜂外出飛行減少或是消失。除此之外，降雨量也限制著胡蜂的飛行能力，強(qiáng)降雨會(huì)減少胡蜂的外出時(shí)間。光線的適用性和強(qiáng)度也影響著胡蜂飛行時(shí)的視覺(jué)并產(chǎn)生一定的干擾，在光線適宜的時(shí)候胡蜂的外出時(shí)間會(huì)提高很多。生物因素也在潛移默化中影響著胡蜂，食物和蜂巢釋放出的生物信息會(huì)對(duì)胡蜂的判斷產(chǎn)生影響，影響其飛行中對(duì)位置的判斷，從而增加不必要的能耗。捕食行為。由于胡蜂是雜食性動(dòng)物其捕食存在機(jī)會(huì)性，食物種類繁多但多為節(jié)肢動(dòng)物、花蜜等甜性物質(zhì)和一些腐質(zhì)食物等。胡蜂為對(duì)某一食物資源達(dá)到最大化利用會(huì)共享信息信號(hào)資源。胡蜂在捕食過(guò)程中會(huì)呈現(xiàn)區(qū)域性聚集現(xiàn)象，如同巢工蜂常會(huì)隨機(jī)聚集在某一特定的食物資源區(qū)域。這種現(xiàn)象可能是由目標(biāo)線索引起，而非外出活動(dòng)中彼此間信息信號(hào)傳遞和記憶能力[7]。筑巢。維持種群社會(huì)性特征的基本要素就是蜂巢，同時(shí)蜂巢也是其維持種群生命活動(dòng)的最基本場(chǎng)所。胡蜂會(huì)使用類似于紙漿的木漿來(lái)建造巢穴。影響胡蜂營(yíng)巢成功與否的關(guān)鍵因素在于生物和人為，人類或者胡蜂的天敵的破壞會(huì)直接或間接導(dǎo)致營(yíng)巢失敗。越冬習(xí)性。越冬是胡蜂一生中最重要的時(shí)候。溫帶地區(qū)的胡蜂以成蟲的形態(tài)越冬。越冬的巢穴大部分是距離原來(lái)的蜂巢較近的區(qū)域。在越冬時(shí)，蜂王會(huì)以與蛹相似的形態(tài)，使身體器官蜷縮成團(tuán)，靜止越冬。也就是說(shuō)越冬蜂王可能會(huì)通過(guò)減少飛行距離和蜷縮等的方式來(lái)避免能量的流失，以便克服越冬期間的不利因素。胡蜂之所以會(huì)有越冬行為主要是因?yàn)闅夂虻挠绊?，在熱帶和亞熱帶地區(qū)胡蜂就不會(huì)有越冬現(xiàn)象。1.3大胡蜂的生活習(xí)性胡蜂有社會(huì)性行為一生營(yíng)巢而居。蜂群中有蜂后、工蜂和雄蜂。蜂后在前一年與雄蜂交配受精，并把精子貯存在貯精囊中，到交配時(shí)分次使用。而雄蜂則在交配之后一段時(shí)間死去。氣溫開始下降時(shí)，已經(jīng)受精的雌蜂會(huì)離開巢穴外出尋找避風(fēng)越冬的地方。等到下一年的春天，幸存下來(lái)的雌蜂會(huì)尋找合適的地方繁殖后代，受精卵形成雌蜂，未受精卵形成雄蜂。隨著工蜂數(shù)量的增多蜂巢也會(huì)隨之?dāng)U大，工蜂會(huì)負(fù)責(zé)筑巢并養(yǎng)育后代。秋后是一年中雄蜂最多的時(shí)期，巢中的雄蜂約占總數(shù)的1/3。一般氣溫在12~13℃時(shí)，胡蜂出蟄活動(dòng)，16~18℃時(shí)開始筑巢，秋后氣溫降至6~10℃時(shí)越冬?；顒?dòng)較勤的時(shí)候是春季的中午那是氣溫比較高，等到夏季較為炎熱或下雨時(shí)則會(huì)停止活動(dòng)。大胡蜂喜光，晚間歸巢之后便不再活動(dòng)。偏愛(ài)甜性食物。在500米范圍內(nèi)胡蜂可以正確的判斷方向返回巢穴，超出這個(gè)范圍就可能會(huì)迷失方向。1.4大胡蜂的地理分布在國(guó)內(nèi)主要分布于云南、吉林、江蘇、浙江、湖南、四川、福建、廣西、湖北；慶陽(yáng)（鎮(zhèn)原、正寧）、隴南（康縣）等地[8]。國(guó)外分布于朝鮮、日本（北海道一九州）及歐洲（法國(guó)）[9]。1.5大胡蜂的價(jià)值1.5.1營(yíng)養(yǎng)價(jià)值中國(guó)有很多食用昆蟲，大胡蜂就是其中一種。作為食用昆蟲胡蜂的種類很多而且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。大胡蜂幼蟲蛋白質(zhì)含量較高其必需氨基酸與非必需氨基酸(EAA/NEAA)的比值均超過(guò)FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)的推薦值[10]，且因?yàn)槌饰栋被?DAA)谷氨酸(Glu)等比例較高，口味比較鮮美。幼蟲、初化蛹、老熟蛹和成蟲礦質(zhì)元素含量豐富，其中鐵(Fe)和硒(Se)含量較高，具有補(bǔ)鐵預(yù)防貧血和延緩衰老等作用[11]。在云南等地胡蜂幼蟲和蜂蛹是一種常見的食物，在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、公路邊常有人販賣連帶著蜂巢的胡蜂幼蟲和蜂蛹，人們將其添加到日常食物中與其他食物配合提供人體所需的營(yíng)養(yǎng)，具有很好的食用價(jià)值。1.5.2藥用價(jià)值大胡蜂作為藥用昆蟲應(yīng)用在疾病治療中在我國(guó)古今醫(yī)書上均有記載。如《神農(nóng)本草經(jīng)》、《千金翼方》、《本草綱目》、《唐新修本草》、《本草綱目拾遺》、《中國(guó)藥用動(dòng)物原色圖鑒》、《常見藥用動(dòng)物》、《中國(guó)民族藥志要》、《傣藥》，總結(jié)這些典籍我們綜合了大胡蜂的藥用范圍多是:大風(fēng)癘疾須眉?jí)櫬?，皮肉已爛成瘡者;消腫解毒;用治癰腫瘡毒、蜘蛛和蜈蚣咬傷，蝎子蟄傷等;治癰腫，丹毒，風(fēng)疹;治風(fēng)頭，祛風(fēng)，解毒，除蠱毒;輕身益氣，補(bǔ)虛羸傷中，久服令人光澤好顏色不老;祛風(fēng)除濕，治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[12]。景頗族傳統(tǒng)的藥酒便是以鮮活的胡蜂為原料泡制而成，有祛風(fēng)除濕的功效，常用于治療風(fēng)濕及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13];胡蜂的毒素能抑制細(xì)胞分裂、殺傷和治療腫瘤細(xì)胞[14]；蜂毒素中的十四肽陽(yáng)離子(MastoparanB)可作為降壓藥物并用于研究MP－B引起心血管阻塞機(jī)制[15-16]。胡蜂富含亞麻酸、亞油酸等人體必需脂肪酸(EFA)，能降低血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫能力、健腦益智、改善視力等[17]。1.5.3生物防治價(jià)值大胡蜂可以應(yīng)用到生物防治技術(shù)中達(dá)到防治病蟲害的作用。由于大胡蜂是雜食性的昆蟲也會(huì)食肉，使得其處于昆蟲世界的食物鏈頂端，是很多病害蟲的天敵。農(nóng)林業(yè)害蟲主要是鱗翅目幼蟲，大胡蜂可以高效的獵殺這些害蟲。在我國(guó)各地利用胡蜂來(lái)進(jìn)行生物防治的案例不在少數(shù)，例如在河南、湖北、湖南、浙江和安徽等地都曾利用胡蜂對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲進(jìn)行生物防治，其開展面積達(dá)666.67hm2以上并取得了顯著效果[18]，并為農(nóng)林業(yè)節(jié)省了大量開支，由此可知利用胡蜂的確能防治農(nóng)林害蟲并具良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。除了除害效果顯著以外，利用大胡蜂進(jìn)行生物防治還可以減少農(nóng)藥的使用，對(duì)食品安全及減少生態(tài)環(huán)境破壞也有一定的益處。1.6大胡蜂人工養(yǎng)殖方法及面對(duì)的困難近年來(lái)隨著大胡蜂食用，醫(yī)用，生物防治等的價(jià)值逐漸被開發(fā)出來(lái)，人們對(duì)于大胡蜂也更加地了解也就有了一定的需求。但是大胡蜂卻不容易獲得，除去其致命的蜂毒對(duì)采蜂人造成一定的生命威脅的原因，其本身數(shù)量也有限且蜂巢并不易被發(fā)現(xiàn)，就算發(fā)現(xiàn)，捕抓的環(huán)境也比較惡劣。為解決供不因求的問(wèn)題，就有人開始人工飼養(yǎng)胡蜂。人工養(yǎng)殖可以供應(yīng)消費(fèi)者較大的需求，但卻面對(duì)著不少問(wèn)題，比如蜂源的獲得、喂食、飼養(yǎng)環(huán)境，蜂箱設(shè)計(jì)、還有捕食人工飼養(yǎng)的蜜蜂等。為了解決這些問(wèn)題，郭云膠等人人就如何更好地養(yǎng)殖胡蜂進(jìn)行了一系列的探索，并解決了阻礙胡蜂可持續(xù)發(fā)展的難題。比如優(yōu)質(zhì)蜂王種源尋找困難的問(wèn)題，他們通過(guò)人工培育的技術(shù)挑選出了優(yōu)質(zhì)的蜂王，使人們不必再為了蜂王而漫山遍野地尋找，保證胡蜂資源的可持續(xù)發(fā)展。關(guān)于捕食蜜蜂的問(wèn)題，通過(guò)土蜂、葫蘆蜂、蜜蜂混合養(yǎng)殖的技術(shù)也得到解決;養(yǎng)殖過(guò)程中異窩土蜂的職蜂在漿糖和取食區(qū)域相遇時(shí)，相互攻擊造成的蜂群數(shù)量減少和損失的問(wèn)題，可通過(guò)數(shù)窩土蜂合并養(yǎng)殖技術(shù)一舉解決[12];如果遇到連續(xù)的陰雨天導(dǎo)致工蜂無(wú)法外出捕食而導(dǎo)致幼蟲餓死，則可以通過(guò)結(jié)合人工喂食的方法來(lái)解決。黃國(guó)忠通過(guò)多年的研究，成功馴養(yǎng)了野生的胡蜂，創(chuàng)造出了胡蜂的大棚高產(chǎn)養(yǎng)殖法，使得養(yǎng)殖胡蜂的農(nóng)民增加了不少收入。1.7大胡蜂的危害及防治方法1.7.1大胡蜂的危害大胡蜂的危害主要在于會(huì)攻擊人類及其他動(dòng)物，它們的蜂毒可以作為藥物，但同時(shí)也會(huì)對(duì)動(dòng)物體造成危害。在受到攻擊和感受到威脅時(shí)，雌蜂會(huì)使用身上的長(zhǎng)螫針來(lái)攻擊入侵者，被螫后受傷部位很快會(huì)出現(xiàn)紅腫、疼痛，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)瘀點(diǎn)和皮膚壞死，并伴隨有頭暈、頭痛、嘔吐、腹痛、腹瀉、煩躁不安、血壓升高等癥狀，這些癥狀一般會(huì)在幾小時(shí)內(nèi)慢慢消失，但也有比較嚴(yán)重的情況，如嗜睡、少尿、全身水腫昏迷、溶血、心肌炎、肝炎、急性腎功能衰竭和休克。還有一些對(duì)蜂毒過(guò)敏的人會(huì)出現(xiàn)蕁麻疹、過(guò)敏性休克等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。我國(guó)每年都有人因?yàn)楹浞涠局聜滤溃F(xiàn)階段還很缺乏治療胡蜂蜇傷的特效藥。其中的一個(gè)原因便是對(duì)于大胡蜂毒素成分及機(jī)理還不是非常明確。早期國(guó)外科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)胡蜂的毒素主要由胺、多肽、酶及其他蛋白組成[19]，但隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)科技術(shù)的發(fā)展日益成熟，人們對(duì)于胡蜂毒素的了解已經(jīng)不僅僅是大分子階段了。其中胺類小分子物質(zhì)主要是去甲腎上腺素、多巴胺、組胺、5－羥色胺等[20];多肽類的有緩激肽、蜂毒明肽(apamin)、肥大細(xì)胞脫粒肽、蜂毒肽(melittin)、抗菌肽等。胡蜂毒素成分的蛋白電泳顯示，其蛋白濃度在23、34和43kD處較高，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)這3種主要成分分別為抗原－5蛋白(antigen－5protein)，透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)和磷脂酶A1(phospholipaseA1)，它們是胡蜂毒素中的3種主要蛋白成分，也是胡蜂毒素導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的主要過(guò)敏原。對(duì)于胡蜂蜂毒成分的研究可以幫助醫(yī)務(wù)人員更好地醫(yī)治胡蜂蜇傷，還可以使胡蜂蜂毒得到更好的應(yīng)用，更加具有說(shuō)服力。1.7.2大胡蜂的防治方法在正常情況下大胡蜂并不會(huì)主動(dòng)地攻擊人畜[21]，但胡蜂蜂毒的毒性是普通蜜蜂的幾倍，對(duì)于人類來(lái)說(shuō)也是一個(gè)安全隱患。若是在居住的地方發(fā)現(xiàn)胡蜂蜂巢應(yīng)當(dāng)及時(shí)地向農(nóng)業(yè)部門或消防部門尋求專業(yè)幫助，讓專業(yè)的技術(shù)人員取下蜂巢以消除隱患。除此之外，如果偶遇胡蜂，胡蜂因?yàn)橐曈X(jué)系統(tǒng)的不發(fā)達(dá)對(duì)色彩識(shí)別度較低僅僅只對(duì)白色或者是運(yùn)動(dòng)中的物體比較敏感，可以用衣物等護(hù)住頭部，蹲下或是趴下等待胡蜂離開。養(yǎng)蜂人總結(jié)了很多關(guān)于胡蜂防治的方法，主要就是物理防治、化學(xué)防治和生物防治。物理防治包括人工摘除蜂巢、拍打、網(wǎng)捕、引誘捕殺、巢穴薰殺、攜藥毒殺和更換巢門(蜂箱)等?；瘜W(xué)防治主要是使用敵敵畏等農(nóng)藥進(jìn)行毀巢。生物防治主要是以寄生性昆蟲、細(xì)菌、真菌和病毒等對(duì)胡蜂進(jìn)行防治[22].1.8大胡蜂的研究進(jìn)展胡蜂具有種類繁多、營(yíng)養(yǎng)成分豐富和富含藥用保健價(jià)值等特點(diǎn)，但以其為食以及防治也存在諸多問(wèn)題，這些問(wèn)題將是以后研究的熱點(diǎn)。目前，在國(guó)外，對(duì)于胡蜂毒素的基因研究主要集中在過(guò)敏原性大分子量蛋白[23]，胡蜂的活性成分及藥理作用的研究表明，以胡蜂為原料藥制備的涂膜劑具有腦缺血再灌注損傷的預(yù)防保護(hù)作用[24]，耐缺氧和抗心肌缺血作用和鎮(zhèn)痛、抗凝、抗血栓形成作用[25]。但現(xiàn)今學(xué)術(shù)研究中，胡蜂蜂毒藥理應(yīng)用機(jī)制的研究和結(jié)論依舊很匱乏，民間常用的古方偏方也極度缺乏可靠的科學(xué)依據(jù)，僅靠世世代代口口相傳和相互之間的經(jīng)驗(yàn)分享。因此展開胡蜂對(duì)于抗炎、抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等作用的實(shí)驗(yàn)，探索胡蜂多種藥理活性的作用機(jī)制，以得出活性作用物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為胡蜂資源的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)的工作迫在眉睫。研究大胡蜂的毒素成分，并為大胡蜂的資源利用提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)，在生物防治以及衛(wèi)生藥理等方面具有重要的意義。

第二章材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1材料（大胡蜂）的收集我國(guó)大胡蜂主要分布于湖北、湖南、江蘇、浙江、四川、廣西、云南、江西、福建、貴州等地。本材料取自云南省祿豐縣大胡峰成體。2.1.2試劑組織總RNA提取試劑盒OligotexmRNAMiniKit試劑盒SMARTPCRcDNASynthesisKit試劑盒引物合成DNA測(cè)序TaqDNA聚合酶pDONR222載體大腸桿菌E.ColiBL21感受態(tài)細(xì)胞氯仿，異丙醇，乙醇等其它生化試劑天根生化科技（北京）有限公司；美國(guó)Qiagen公司；美國(guó)Clontech公司；北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司；北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司；寶生物工程（大連）有限公司；Invitrogen公司；天根生化科技（北京）有限公司；國(guó)產(chǎn)分析純。2.1.3儀器PCR儀冷凍離心機(jī)Centrifuge5417RSMART常溫離心機(jī)Centrifuge5418結(jié)晶生物安全柜AirstreamAC2-4S1DNA電子天平TB-215D恒溫?fù)u床移液槍美國(guó)Bio-Rad公司；德國(guó)Eppendorf公司；德國(guó)Eppendorf公司；美國(guó)ESCO公司；美國(guó)DENVER儀器有限公司；上海一恒科學(xué)儀器有限公司；大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司。2.1.4常用的溶液及培養(yǎng)基瓊脂糖凝膠電泳試劑溴化乙錠(EB-DNA染色劑，10mg/ml)：EB為強(qiáng)誘變劑并具有中度毒性，使用時(shí)需要帶上手套。溴酚藍(lán)指示劑(6×)：0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖。TAE儲(chǔ)存液(50×)：242gTris堿，57.1ml冰乙酸，100ml0.5MEDTA(pH8.0)，補(bǔ)加水至1L。電泳緩沖液TAE(Tris-乙醇)：0.04MTris-乙醇，1mMEDTA。培養(yǎng)基（1）LB培養(yǎng)基：10gNaCl，10g蛋白胨，5g酵母提取液，雙蒸水補(bǔ)加至1L。（2）固體培養(yǎng)基：加瓊脂粉15g/L，20分鐘滅菌處理后在超凈工作臺(tái)倒平板備用。（3）LB培養(yǎng)基：臨用前加卡那霉素100mg/L。2.2操作方法2.2.1總組織RNA提取取50-100mg大胡峰毒腺，用液氮研磨的方法充分磨碎，用液氮研磨的方法充分磨碎，加入到1ml的裂解液RL中，皮膚組織體積不能超過(guò)RL體積的10％。將上述樣品漩渦震蕩混勻，在室溫條件下靜置2-3分鐘以使核酸蛋白體完全解離。每1mlRL加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩使樣品變?yōu)槿榘咨?，室溫放?-3分鐘。12000rpm，4℃離心10分鐘，樣品分為三層：RNA保存在于上層水相中。將上清轉(zhuǎn)移至新管，進(jìn)行下一步操作。加入1/2倍體積無(wú)水乙醇，顛倒搖晃混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）。將得到的溶液和可能出現(xiàn)的沉淀一并轉(zhuǎn)入吸附柱RB(吸附柱套在收集管內(nèi)）。12000rpm，4℃離心1分鐘，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管。加500μL去蛋白液RP，12000rpm，4℃離心30-60秒，棄掉廢液。加入600μL漂洗液RW（先檢查是否加入無(wú)水乙醇）12000rpm，4℃離心30-60秒，棄掉廢液。加入600μL漂洗液RW，12000rpm，4℃離心30-60秒，棄掉廢液。將吸附柱RB放回收集管中，12000rpm離心1-2分鐘，除盡漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。將吸附柱RB放入一個(gè)新的Rnasefree離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-100μLRNasefreeH2O(在65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好)，室溫放置2分鐘，12000rpm，4℃離心1分鐘洗脫。洗脫體積越大，洗脫效率越高，但是濃度會(huì)降低，如果想要提高濃度，則可以減少洗脫體積，但是洗脫體積不要低于30μL，洗脫體積過(guò)小將會(huì)降低RNA產(chǎn)量。2.2.2RNA的檢測(cè)采取吸光值檢測(cè)。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度（OD260/280>1.8）和得率（1OD260=40μg/mlRMA）。用OligotexmRNAMiniKit試劑盒（Qiagen，美國(guó)）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明書純化mRNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和得率。此外，還可用凝膠電泳檢測(cè)RNA純度。2.2.3cDNA合成和基因文庫(kù)的構(gòu)建用SMARTPCRcDNASynthesisKit試劑盒（Clontech，美國(guó)）合成cDNA，并根據(jù)本試劑盒含有從mRNA反轉(zhuǎn)錄到cDNA以及擴(kuò)增cDNA所必須的全部試劑以及操作說(shuō)明進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈，聚合酶催化合成cDNA第二鏈。兩端引物名稱及序列分別為：5'測(cè)序引物序列：5'CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG3'；3'測(cè)序引物序列：5'AGCGGATAACAATTTCACACAGG3'。PCR進(jìn)行如下：先94℃使雙鏈徹底變性，循環(huán)條件為92℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循環(huán)30次，最后72℃保持7min以合成不完全的雙鏈末端。PCR產(chǎn)物與pDONR222載體連接PCR產(chǎn)物連接到PET-28a載體，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌E.coliBL21中（如圖2.1）。具體方法如下：取一個(gè)滅菌的0.2ml微量離心管，加入：4μLPCR產(chǎn)物混合液，1μLPET-28a載體，0.5μLT4DNA連接酶，1μL連接酶緩沖液，3.5μLddH2O，總量10μL體系。輕輕震蕩混合后液體，再進(jìn)行短暫離心，將其置于16℃水中保溫過(guò)夜。將連接后的產(chǎn)物用來(lái)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或者置4℃冰箱備用。圖2.1pDONR222載體示意圖質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化熱激法轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟：制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250μLLB固體培養(yǎng)基中（冷卻至55℃以下）加入Kana至終濃度50μg/ml，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；將制備好的感受態(tài)細(xì)胞放于冰上融化；將44μL感受態(tài)細(xì)胞加入約1μL質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；熱激：將離心管放置42℃水浴，熱激90秒，應(yīng)注意切勿搖動(dòng)離心管；冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置2-5分鐘；復(fù)蘇：每管加400μLLB培養(yǎng)基，在37℃搖床溫和搖動(dòng)溫育45-60分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇；布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有、抗生素（Kana）的LB平板；培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)即可觀察到白色的菌落，即為轉(zhuǎn)化子。一個(gè)大胡蜂毒腺cDNA文庫(kù)就此構(gòu)建成功。2.2.4ZEO抗性菌的獲取挑取單克隆菌取之前保存的ZEO+抗性甘油菌，取5μL稀釋直20μL后涂于之前準(zhǔn)備好的加有ZEO+的固體培養(yǎng)基上，并用玻璃棒涂勻（此過(guò)程需在無(wú)菌操作臺(tái)操作）。最后用封口膜封好后倒扣在烘箱中過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)后的菌中用牙簽挑選單克隆菌于事先制備好體系的EP管中。體系各溶液如下所示：試劑2×TaqPCRMasterMix引物M13F引物M13R無(wú)菌水DNA模板總體系加入量5μL0.5μL0.5μL4μLZEO+單克隆菌10uLPCR擴(kuò)增程序打開PCR儀，將事先制備好體系的EP管放入其中，嚴(yán)格設(shè)置PCR儀參數(shù)，調(diào)節(jié)各反應(yīng)條件以達(dá)到最適反應(yīng)條件。PCR條件如下所示：預(yù)變性95℃2min 變性95℃30s退火55℃30s30循環(huán)延伸72℃1min最后72℃10minPCR完畢后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。2.2.5瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)配膠稱取0.9g的瓊脂糖，將其加到錐形瓶中，使用量筒取100ml的1×TAE緩沖液加入錐形瓶中，搖勻，放入微波爐中加熱至溶液無(wú)氣泡、清晰明亮完全溶解時(shí)用是抹布取出。待其冷卻（不燙手為宜），然后使用移液槍加入10μLEB，搖勻并將其倒入插好梳子的膠板中，待其冷卻，成凝膠后備用。點(diǎn)樣將配好的膠緩慢放入電泳槽中（避免弄壞凝膠），并向電泳槽中倒入一定量的緩沖液（1×TAE）直至剛好將淹沒(méi)凝膠。使用10μL移液槍先加5μL將已經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)的樣品順次加入到槽孔中，最后加入5μLDNAMarker。電泳保證點(diǎn)樣正確后，蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽，然后設(shè)置電泳過(guò)程中所需要的數(shù)據(jù)：電壓：120V，時(shí)間：25min。確認(rèn)各項(xiàng)數(shù)值完全正確之后，按開始鍵開始電泳。紫外光觀察25分鐘后關(guān)閉電源，將凝膠從電泳槽中取出，將凝膠放入紫外透射儀下，利用電腦掃描圖像并且保存圖像，同時(shí)用手機(jī)拍下圖片便于后期使用。PCR檢測(cè)挑選插入片段長(zhǎng)度<1000bp條帶以及相對(duì)應(yīng)的一次性LB培養(yǎng)基上的克隆菌在無(wú)菌工作臺(tái)上挑取放1.5mlEP管中，EP管中事先加入500μL的LB液體培養(yǎng)基(此液體培養(yǎng)基應(yīng)加入坑生素，防止長(zhǎng)出雜菌）一式兩份（一份送去測(cè)序，一份放在4℃冰箱中保存），測(cè)序用AppliedBiosystemsDNA測(cè)序儀(ABI3730XL,USA)測(cè)序（北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司）。2.2.6序列比對(duì)將篩選所得并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的質(zhì)粒菌液樣品送至測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果使用BLAST軟件在GenBank非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)(/BLAST)進(jìn)行核苷酸序列的比對(duì)和AMP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pumc.edw/AP/main.php)進(jìn)行相似物和同源物的檢索。通過(guò)序列比對(duì)判斷所篩選的基因是否系新基因。第三章結(jié)果3.1大胡蜂毒腺總RNA的紫外鑒定和電泳結(jié)果將提取的大胡蜂毒腺總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明：其28S和18SrRNA條帶清晰、尖銳。28S條帶明顯寬于18S條帶（如圖3.1）。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)mRNA純度和完整性，結(jié)果表明：紫外測(cè)定OD260/OD280比值為2.01，說(shuō)明提取的大胡蜂毒腺組織總RNA完整性好，無(wú)降解。綜合瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果表明：提取的總RNA質(zhì)量較好，符合cDNA建庫(kù)要求，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟。圖3.1大胡蜂毒腺總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖3.2單克隆抗性菌結(jié)果ZEO+抗性甘油菌在抗ZEO+固體培養(yǎng)基中，放置于恒溫培養(yǎng)箱，確保在無(wú)菌環(huán)境中過(guò)夜培養(yǎng)，有效避免雜菌污染后，可明顯觀察到有單克隆ZEO+抗性甘油菌落生長(zhǎng)（如圖3.2），且長(zhǎng)勢(shì)良好，ZEO+抗性甘油菌的生物學(xué)特征明顯，為獨(dú)立的抗克隆菌落，無(wú)相互污染，完全達(dá)到挑取單克隆菌的要求。圖3.2過(guò)夜培養(yǎng)后的ZEO+甘油菌菌落3.3PCR擴(kuò)增結(jié)果選取長(zhǎng)勢(shì)良好，遠(yuǎn)離其它菌株的單克隆，用上述引物進(jìn)行PCR。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如下圖所示（如圖3.3）。如圖可見清晰、無(wú)拖尾、無(wú)雜質(zhì)的DNA條帶，符合送樣標(biāo)準(zhǔn)，即可將該P(yáng)CR產(chǎn)物送樣測(cè)序。圖3.3單克隆菌PCR電泳圖（1-3均為PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，選取2號(hào)PCR結(jié)果進(jìn)行測(cè)序）3.4大胡蜂細(xì)胞色素P450序列分析通過(guò)挑單克隆，挑選插入片段長(zhǎng)度<1000bp條帶，送去北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序用AppliedBiosystemsDNA測(cè)序儀(ABI3730XL,USA)。獲得了編碼大胡蜂細(xì)胞色素P450的cDNA序列。該cDNA的全長(zhǎng)序列如下：TGGGCGGAATGACAATAATGATATTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAGTGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGTTGGACTGACATTCAAGAGAAAGTAATCCAAGAACTTGATGAGATCTTTGGAGATAGCGATAGACCTGCCACTTTCCAGGACACTTTGCAAATGAAATATCTTGAACGTTGTCTCATGGAAACTTTACGCATGTATCCGCCAGTACCGATCATTGCTCGTGACGTCAAGACAGATATAAAACTTGTTTCTGATAATTACACTATACCAAGAGGATGTACTGTCATCATTGGTACAATAAAGACCCACCGATTAGAATCGATTTATCCAAATCCAAATGTCTTCGATCCGGACAACTTCCTTCCGGAAAGGACAGCCAACAGACATTATTATGCATTTATACCATTCTCCGCTGGACCTCGTTCTTGCGTTGGCCGAAAATATGCCATGCTCAAACTAAAGATTCTACTTTCAACGATTCTAAGAAACTTCCGTGTAAAATCGGAAGTCAAAGAGGATGATTTTAGGCTACAAGCTGATATTATTCTCAAGCGTGCCGAAGGATTCCCTGTCAGATTGGAACCGAGGAAACGTGTTAGCGTTCAGGCTTAATTAATAATTAATACATTTAATCTTCTTTTTATCTTATTAAGATTTGGATATGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA大胡蜂細(xì)胞色素P450cDNA由730個(gè)堿基組成，包含一個(gè)459個(gè)堿基的開放閱讀框(ORF)，編碼了一個(gè)含有152個(gè)氨基酸殘基的多肽。該序列的ORF（開放閱讀框）序列為：ATGAAATATCTTGAACGTTGTCTCATGGAAACTTTACGCATGTATCCGCCAGTACCGATCATTGCTCGTGACGTCAAGACAGATATAAAACTTGTTTCTGATAATTACACTATACCAAGAGGATGTACTGTCATCATTGGTACAATAAAGACCCACCGATTAGAATCGATTTATCCAAATCCAAATGTCTTCGATCCGGACAACTTCCTTCCGGAAAGGACAGCCAACAGACATTATTATGCATTTATACCATTCTCCGCTGGACCTCGTTCTTGCGTTGGCCGAAAATATGCCATGCTCAAACTAAAGATTCTACTTTCAACGATTCTAAGAAACTTCCGTGTAAAATCGGAAGTCAAAGAGGATGATTTTAGGCTACAAGCTGATATTATTCTCAAGCGTGCCGAAGGATTCCCTGTCAGATTGGAACCGAGGAAACGTGTTAGCGTTCAGGCTTAA上述開放閱讀框編碼一個(gè)含有152個(gè)氨基酸殘基的多肽，該多肽經(jīng)過(guò)NCBI序列的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明：該序列與胡蜂科馬蜂屬的造紙胡蜂（PolistesdominulaChrist）序列有較高的相似性，Identity為85%，表明該多肽為細(xì)胞色素P450的同源物。其多肽序列為：MKYLERCLMETLRMYPPVPIIARDVKTDIKLVSDNYTIPRGCTVIIGTIKTHRLESIYPNPNVFDPDNFLPERTANRHYYAFIPFSAGPRSCVGRKYAMLKLKILLSTILRNFRVKSEVKEDDFRLQADIILKRAEGFPVRLEPRKRVSVQA將構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)進(jìn)行挑單克隆送往北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測(cè)序。代表性區(qū)域測(cè)序結(jié)果下圖所示（如圖3.4）。該峰圖以4種顏色代表A、T、G、C四種堿基序列，峰的高低說(shuō)明信號(hào)的強(qiáng)弱，峰的寬窄則表示分離效果，由該代表性區(qū)域測(cè)序結(jié)果峰型圖可以明顯看到峰型對(duì)稱、尖銳，波峰與波谷清晰，峰與峰之間的距離均勻，峰型整齊清晰，無(wú)雙峰、套峰、底峰等不良峰型，讀長(zhǎng)達(dá)800bp，有效堿基起始序列精準(zhǔn)，無(wú)干擾峰、重疊峰、降解峰等，可信度強(qiáng)，序列模板未見特殊結(jié)構(gòu)，例如Poly結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，無(wú)衰減和中斷，走勢(shì)平緩下降。由此可分析，該測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相同，并且達(dá)到明顯的理想效果。結(jié)果表明本次成功的構(gòu)建了具有較高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)。圖3.4代表性區(qū)域測(cè)序結(jié)果峰型圖第四章分析討論大胡蜂Vespa(Magnifica)magnificaSmith隸屬于膜翅目(Hymenoptera)胡蜂科(Vespoidea)黃胡蜂屬(Vespa)，是廣泛分布于各地、飛行速度極快的一種昆蟲。其身體烏黑發(fā)亮，有黃條紋和成對(duì)的斑點(diǎn)，體長(zhǎng)大約16毫米。通過(guò)早期研究我們已知胡蜂的毒素主要由胺、多肽、酶及其他蛋白組成，但隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)科技術(shù)的發(fā)展日益成熟，人們對(duì)于胡蜂毒素的了解已經(jīng)不僅僅是大分子階段了。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)胺類小分子物質(zhì)主要是去甲腎上腺素、多巴胺、組胺、5－羥色胺等;多肽類物質(zhì)有緩激肽、蜂毒明肽(apamin)、肥大細(xì)胞脫粒肽、蜂毒肽(melittin)、抗菌肽等。胡蜂毒素成分中的抗原－5蛋白(antigen－5protein)，透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)和磷脂酶A1(phospholipaseA1)，是胡蜂毒素中的3種主要蛋白成分，也是胡蜂毒素導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的主要過(guò)敏原。大胡蜂毒素對(duì)生物具有危害的同時(shí)也有很好的藥用價(jià)值。在前期對(duì)大胡蜂毒素的研究中雖然取得了一定的成果，但是距離完全了解其成分及結(jié)構(gòu)組成尚有很長(zhǎng)的一段路要走。有的成分由于含量低、難提取、難保存，分理工作仍存在一定難度，從基因?qū)用孢M(jìn)行研究可以更加有效，準(zhǔn)確。大胡蜂在國(guó)內(nèi)主要分布在云南各地（數(shù)量稀少）、四川、西藏、臺(tái)灣、等地，國(guó)外在有印度，緬甸，印度尼西亞分布。本論文實(shí)驗(yàn)材料是從云南省祿豐縣采集而來(lái)，首先對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，使其組織不被破壞，帶回實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室流程是從大胡蜂毒腺組織中提取出總RNA，通過(guò)mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法合成了大胡蜂毒腺基因，并將其克隆到pDONR222載體上。從PCR檢測(cè)的各項(xiàng)指標(biāo)來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的大胡蜂毒腺基因cDNA文庫(kù)達(dá)到了較為優(yōu)質(zhì)的文庫(kù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。并且進(jìn)行文庫(kù)篩選測(cè)序，得出與預(yù)知序列相同的序列。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA中推導(dǎo)出氨基酸序列，使用NCBI的BasicLocalAlignmentSearchTool軟件與蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。序列比對(duì)結(jié)果表明：克隆出來(lái)的cDNA序列與已知的胡蜂科馬蜂屬的造紙胡蜂（Polistesdominula）序列有較高的相似性。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量完全可以進(jìn)行功能基因的cDNA克隆。本實(shí)驗(yàn)將為深入研究此種胡蜂毒素的成分、基因及其功能提供一個(gè)依據(jù)，為繼續(xù)尋找新的活性組分和后續(xù)的研究提供一個(gè)參考。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)范。在提取RNA時(shí)，所有的儀器試管器皿（使用錫紙包裹）都要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌，因?yàn)镽NA極易被降解，而微量的RNA酶就可使RNA失活。為防止實(shí)驗(yàn)失敗，一定要避免RNA酶污染，不使用可能被污染的手套、試管等，皮膚或者空氣中攜帶的細(xì)菌、霉菌都肯會(huì)成為RNA酶的來(lái)源，配置溶液時(shí)要使用RNaseFree的水，操作過(guò)程中應(yīng)當(dāng)佩戴口罩，口水中的一些酶類也會(huì)造成RNA失活。一份均一完整的mRNA是成功構(gòu)建cDNA文庫(kù)的關(guān)鍵。構(gòu)建cDNA文庫(kù)我們是用SMART試劑盒，它利用帽子結(jié)構(gòu)特征，充分利用末端轉(zhuǎn)移酶的活性和限制性內(nèi)切酶的特性，該方法的優(yōu)點(diǎn)是在于不存在對(duì)mRNA進(jìn)行處理的酶促反應(yīng)，不僅操作簡(jiǎn)單，而且一定程度上提供了全長(zhǎng)cDNA合成的可能性。當(dāng)然也存在不足，文庫(kù)中會(huì)有一定數(shù)量的非全長(zhǎng)克隆，不利于以后的分析研究；末端轉(zhuǎn)移酶的活性低，加dC量少，從而導(dǎo)致在CapSwitch這一步中，寡核苷酸作為模板的效率不高，導(dǎo)致克隆丟失。在建庫(kù)時(shí)我們可根據(jù)不同的研究目的選擇合適的反轉(zhuǎn)錄酶和方法，雙鏈cDNA克隆前應(yīng)注意進(jìn)行末端修飾和分級(jí)分離，在克隆時(shí)應(yīng)注重掌控cDNA和載體的比例。現(xiàn)階段構(gòu)建cDNA文庫(kù)的載體主要是質(zhì)粒、噬菌體和噬菌粒，本次實(shí)驗(yàn)使用的的質(zhì)粒載體為pDONR222，其具有快速簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)單，重組效率高，可直接進(jìn)行功能表達(dá)篩選的優(yōu)點(diǎn)。質(zhì)粒文庫(kù)對(duì)載體與cDNA的連接效率、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率有著非常高的要求，連接效率高低決定著cDNA文庫(kù)構(gòu)建是否成功，除此之外文庫(kù)連接與一般的片段克隆的連接是否一致也是該文庫(kù)構(gòu)建是否成功的重要指標(biāo)。在克隆構(gòu)建好的文庫(kù)時(shí)，要注意ZEO抗性菌種的稀釋，否則會(huì)出現(xiàn)菌落過(guò)度密集或者菌落很少的情況。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們使用不同的倍數(shù)來(lái)作為對(duì)照，試圖找出適宜的稀釋倍數(shù)，但也會(huì)出現(xiàn)反常現(xiàn)象，比如稀釋倍數(shù)越低菌落反而越少。通過(guò)分析，可能是由于菌種長(zhǎng)時(shí)間保存在冰箱里面，菌體都沉底，在吸取菌種時(shí)沒(méi)有混合均勻造成。在后來(lái)的實(shí)驗(yàn)中我們通常會(huì)將菌種稀釋10倍再進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)出來(lái)的單克隆菌落密度隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)呈由高到低的變化趨勢(shì)，所以在實(shí)際的操作過(guò)程中也應(yīng)該適當(dāng)調(diào)整稀釋的倍數(shù)保證培養(yǎng)出來(lái)的單克隆菌落密度合理。除了倍數(shù)稀釋的問(wèn)題之外，培養(yǎng)時(shí)間也應(yīng)嚴(yán)格把控，培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)菌落長(zhǎng)得太大容易造成連片的現(xiàn)象，時(shí)間太短則菌落太小數(shù)量也不多對(duì)后續(xù)的挑取工作造成困難，影響PCR擴(kuò)增的成功與否。為了達(dá)到提高cDNA拷貝數(shù)，本文采用了PCR技術(shù)接到cDNA文庫(kù)。使用PCR技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，產(chǎn)物的生成量以指數(shù)方式增加。2.簡(jiǎn)便快速。3.對(duì)標(biāo)本的要求低。但PCR技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)，阻礙了其自身發(fā)展。1.使用PCR技術(shù)合成的基因片段比較短小，要擴(kuò)增全長(zhǎng)大片段基因有一些難度；2.擴(kuò)增過(guò)程中易出現(xiàn)錯(cuò)誤摻入，且摻入率較高；3.由于PCR技術(shù)對(duì)長(zhǎng)片段的擴(kuò)增率較低，而對(duì)短片段較高，因此很難在文庫(kù)中體現(xiàn)出原始豐度。在實(shí)驗(yàn)中我們使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)電泳結(jié)果來(lái)看常會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題。1.不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。可能是在PCR環(huán)節(jié)中出現(xiàn)問(wèn)題，如：模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量，PCR循環(huán)條件。2.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶。其原因往往是酶量過(guò)多或酶質(zhì)量差。除此之外我們還需要注意，在挑取菌落時(shí)要挑取單個(gè)菌落保證得到單克隆，注意不要碰到周圍菌落否則會(huì)使電泳結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤。在電泳過(guò)程中，要確保EB加入到加熱的瓊脂中，要不然結(jié)果不會(huì)出現(xiàn)條帶，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要盡量避免DNA的核酸酶污染。該多肽經(jīng)過(guò)NCBI序列的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明：該序列與胡蜂科馬蜂屬的造紙胡蜂（PolistesdominulaChrist）序列有較高的相似性，Identity為85%，表明該多肽為細(xì)胞色素P450的同源物。細(xì)胞色素P450主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，作為一種末端加氧酶，參與了生物體內(nèi)的甾醇類激素合成等過(guò)程。最新研究表明細(xì)胞色素P450作為藥物代謝中的關(guān)鍵酶，對(duì)細(xì)胞因子和體溫調(diào)節(jié)都有重要影響。而關(guān)于大胡蜂毒素成分我們還有很多未知。但近年來(lái)胡蜂的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，藥用價(jià)值，生物防治價(jià)值越來(lái)越為人們所知，尤其是其醫(yī)用價(jià)值，曾有研究表明，以胡蜂為原料藥制備的涂膜劑具有腦缺血再灌注損傷的預(yù)防保護(hù)作用，耐缺氧和抗心肌缺血作用和鎮(zhèn)痛、抗凝、抗血栓形成作用。除此之外胡蜂毒素還有很大的開發(fā)余地，還需要展開胡蜂在抗炎、抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等方面作用的實(shí)驗(yàn)研究，以更清楚地了解大胡蜂的毒素成分及作用機(jī)制，為開發(fā)新藥造福人類打下一個(gè)基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)李鐵生.中國(guó)經(jīng)濟(jì)昆蟲志第30冊(cè)膜翅目胡蜂總科[M].北京:科學(xué)出版社,1985.張繼祖.福建省胡蜂資源名錄[J].福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1989,18(4):571-578.石達(dá)愷.臺(tái)灣社會(huì)性昆蟲[M].臺(tái)中:國(guó)立自然科學(xué)博物館,1991.董大志,王云珍.云南胡蜂志膜翅目胡蜂總科[M].河南科學(xué)出版社,2017.李建康.胡蜂防控技術(shù)[M].陜西林業(yè)出版社,2007.楊維來(lái),李位三.墨胸胡蜂生物學(xué)特性的觀察[J].昆蟲知識(shí),1997,34(11):28-30.池成林,李強(qiáng),馬麗.胡蜂亞科昆蟲生物學(xué)特性及控害效果研究進(jìn)展[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2018,49(06):1139-1146.董大志,王云珍.云南胡蜂垂直分布及其區(qū)系分析[J].動(dòng)物學(xué)研究,1992,13(4):343-352.章士美,趙泳祥.中國(guó)農(nóng)林昆蟲地理分布[M]中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1996.FAO/WHOAdHocExpertCommittee.Energyandproteinrequirements［R］.FAONutritionMeetingReportSeries724,1973.張佑祥,易浪波,李艷麗,等.金環(huán)胡蜂食用蟲態(tài)礦質(zhì)