*

抗體工程制藥

*抗體工程制藥概述單克隆抗體及其制備基因工程抗體多功能抗體噬菌體抗體工程抗體診斷試劑抗體治療藥物*概述*概述抗體的產(chǎn)生IgG的結(jié)構(gòu)抗原抗體反應(yīng)抗體的應(yīng)用抗體制藥的發(fā)展歷史抗體制藥的現(xiàn)狀*德國貝爾；日本北里柴三郎第一屆諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎得主發(fā)現(xiàn)白喉桿菌抗毒素治療白喉抗體治療的理念最早源于中國貝爾曾經(jīng)發(fā)自肺腑感嘆：“中國人遠在2000年前就知曉以毒攻毒醫(yī)理，它是合乎現(xiàn)代科學(xué)的一句古訓(xùn)！”*****抗體：能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白免疫球蛋白：具有抗體活性、化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白Ig：化學(xué)結(jié)構(gòu)；抗體：生物學(xué)功能所有抗體均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗體活性*（1）抗體的產(chǎn)生MMMMDMDGMDA成熟B細胞祖B細胞前B細胞（胞漿出現(xiàn)

IgM重鏈）不成熟B細胞MatureBcellsImmatureBcellsPre-BcellsPro-BcellsB細胞的發(fā)育過程第一節(jié)、概述*（2）IgG結(jié)構(gòu)*****（3）抗原抗體反應(yīng)*****（5）抗體制藥發(fā)展歷史

1890年發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立了血清療法，開抗體制藥之先河(馬血清多克隆抗體）。1937年用電泳法將血清分為白蛋白、甲種、乙種、丙種球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。1975年首次利用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出McAb.在臨床上主要用于診斷和治療。1986年第一個治療用單抗OKT3上市*McAb

在免疫導(dǎo)向療法中存在的問題：A、McAb均是鼠源性抗體，可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)的半衰期只有5-6h，難以維持有效藥物作用靶組織時間；B、完整的抗體分子的相對分子質(zhì)量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。需要解決的問題：A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相對分子質(zhì)量。*解決問題的方法或途徑—基因工程技術(shù)

1984年報道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/80-1/3。***

小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等幾種。小分子抗體有很多優(yōu)點:

可以用細菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低;

分子小，穿透力強;

不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應(yīng);

在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;

易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。

小分子抗體*FvScFv單區(qū)抗體最小識別單位Fab*

由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。

把Fab與細菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab*

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽*基因工程包括以下內(nèi)容基因克隆技術(shù)將全套抗體Ｈ鏈和Ｌ鏈Ｖ區(qū)基因克隆出來，進行原核表達，篩選特異性的基因噬菌體抗體庫技術(shù)含人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠*治療用抗體發(fā)展的三個階段單克隆抗體基因工程抗體多克隆抗血清第一代抗體第二代抗體第三代抗體*整體水平抗體生成技術(shù)細胞工程抗體生成技術(shù)

基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù)

Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達技術(shù)*（6）抗體制藥的現(xiàn)狀1986年，美FDA批準(zhǔn)上市了第一個用于治療移植物抗宿主病（GVHD）抗體藥物

OrthocloneOKT3，翻開了生物醫(yī)藥歷史嶄新的一頁8年后，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第二個抗體藥物上市。21世紀(jì)后，抗體藥物研發(fā)上市速度加快，目前共有150余個抗體藥物正在臨床評估中，其中20多個已經(jīng)上市，超過500種處于臨床前研究階段。1996年開始進入快速發(fā)展的軌道。

2002年治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的完全人源化單抗humira批準(zhǔn)上市，這是抗體藥物發(fā)展具有里程碑意義大事。*至06年底，全世界共有21個治療用抗體藥物批準(zhǔn)上市，其中美國18個(包括9個被歐盟批準(zhǔn)的），中國2個，日本1個。2004年，約占全球藥物市場份額的2％2006年，單抗藥物的聯(lián)合銷售額為200億美元。2006-2012年間的年銷售額增長率將為14%。而同一時期，小分子藥物增長率預(yù)計僅為0.6%。單克隆抗體藥成為增長最快的藥物*現(xiàn)在有5大單抗藥物占據(jù)了80%的市場份額，其中Roche和Geneteck聯(lián)合開發(fā)上市的單抗藥物：Avastin、Herceptin和Rituxan；另外還有雅培公司的Humira和強生公司的Remicade?？贵w藥物的價格昂貴，治療乳腺癌的Herceptin，250mg／支(15000元／支，一個療程8支)，治療淋巴瘤的Rituxan，400mg／支(21000元／支，一個療程４支)。*全世界正在研制的生物技術(shù)藥品，25%為各類單克隆抗體?？贵w市場快速增長的主要推動：一、銷售持續(xù)攀升；二、新品種不斷上市；三、研發(fā)方面的重金投入。大型醫(yī)藥公司還會通過收購來獲得對抗體新藥的控制權(quán)。如最近美國強生公司收購了抗體藥物研發(fā)的領(lǐng)頭羊Centocor公司。**產(chǎn)品研究者適應(yīng)癥目標(biāo)抗原批準(zhǔn)年份抗體類型

Panorex

Centocor

腫瘤17-1A1995鼠源抗體

OthocloneOrtho異體移植CD31986鼠源抗體

Reopro

Centocor

心血管疾病IIIαIIIβ1994嵌合抗體

RituxanIDEC淋巴癌CD201997嵌合抗體

Remicade

Centocor

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎TNF-α1999嵌合抗體

SimulectNovartis腎臟移植CD251998嵌合抗體

Enbrel

Immunex

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎TNF-α1998抗體融合蛋白

Synagis

Medimmune

呼吸道感染Fprotein1998人源化抗體

ZenapaxPDL腎臟移植CD251997人源化抗體

HerceptinGenentech乳腺癌HER2/neu1998人源化抗體

Mylotarg

Celltech

白血病CD332000人源化抗體

CampathMillennium淋巴癌CD522001人源化抗體

ZevalinIDEC淋巴癌CD20-Y902002鼠源抗體

HumiraAbbott類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎TNF-α2002人源化抗體

XolairGenentech哮喘IgE2003人源化抗體

Alefacept

Biogen

銀屑病CD22003抗體融合蛋白*抗體藥物銷售趨勢圖*（6）抗體制藥－國內(nèi)市場1.利妥昔單抗銷售額領(lǐng)先

國內(nèi)市場上主要有的利妥昔和抗Tac單抗（2001)、鼠抗人T淋巴細胞CD3單抗(2002)、群司珠和巴利昔單抗(2003)。2.廣州地區(qū)銷量最大

廣州是最大的抗體藥物市場，占有總市場份額的30％，其次是北京和上海。**3.羅氏產(chǎn)品占絕對優(yōu)勢上海羅氏制藥操控著整個國內(nèi)抗體藥物市場。巴利昔單抗是北京諾華的獨家產(chǎn)品鼠抗人CD3單抗是唯一國產(chǎn)品種，國內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)的該產(chǎn)品在整個抗體藥物市場所占的份額不足1％?？笴D3單抗企業(yè)份額：武漢生物制品所54.6％、北京費森尤斯醫(yī)藥公司44.9％、武漢生化制藥廠0.5％。*（6）抗體制藥－國內(nèi)生產(chǎn)研究現(xiàn)狀SFDA到目前為止共批準(zhǔn)了11個抗體藥物上市，5個是進口產(chǎn)品，6個是在我國研發(fā)的，其中4個是國家生物制品I類新藥，均為抗癌藥物。此外，還有一些仿制產(chǎn)品處于3期臨床階段。已批準(zhǔn)的診斷性單抗有31個國內(nèi)形成了三個抗體藥物的中試及產(chǎn)業(yè)化基地。北京基地以百泰生物藥業(yè)為主；上?；匾陨虾Ｖ行艊∷帢I(yè)為主；西安基地由第四軍醫(yī)大學(xué)和成都華神集團合作形成。

*泰欣生(尼妥珠單抗,Nimotuzumab，百泰藥業(yè))：重組人源化抗人表皮因子受體(EGFR)單克隆抗體注射液，2008年6月上市，人源化程度95%，是世界上第三個用于治療實體瘤的單克隆抗體。目前定價:50mg/10ml（3680元）泰欣生上市不僅代表我國在單抗藥物人源化技術(shù)領(lǐng)域取得了重大突破,更重要的意義在于突破了哺乳動物細胞規(guī)模化培養(yǎng)這一生物技術(shù)瓶頸

**碘［131I］美妥昔單抗注射液（西安基地）［131I］人鼠嵌合型腫瘤細胞核單抗注射液（上?；兀┳⑸溆弥亟M人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白”（商品名為“益賽普”）（上海基地）*抗體制藥的國內(nèi)狀態(tài)目前國內(nèi)正在進行臨床前研究的抗體藥物有：抗CEA嵌合抗體；抗破傷風(fēng)抗體；抗乙型腦炎單抗；抗FabC1027，用于治療肝癌。瓶頸：大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)工藝，而此類工藝屬于歐美嚴(yán)禁出口的技術(shù)，長期以來對我國實行封鎖。

*（1）概念抗原決定族

（Epitope,Antigenicdeterminant）●一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定基●

每個抗原決定族至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性質(zhì)抗原決定基含有六個以上氨基酸第二節(jié)、單克隆抗體及其制備*（1）概念抗原決定族

（Epitope,Antigenicdeterminant）●一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定基●

每個抗原決定族至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性質(zhì)抗原決定基含有六個以上氨基酸第二節(jié)、單克隆抗體及其制備*（2）多克隆抗體

(Polyclonalantibody)（2－1）概念給動物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細胞增殖分化所產(chǎn)生的,稱為多克隆抗體.*（2－2

）實驗室制備多克隆抗體研究、診斷用所用動物：1Balb/c小鼠，6－8周齡；雄性

2大鼠3兔子生后約12周?？乖?純化的抗原（線性抗原或構(gòu)型抗原）

2非純化抗原技術(shù)關(guān)鍵：抗原制備應(yīng)用：免疫學(xué)檢測

*類毒素毒素馬血清抗毒素超敏反應(yīng)抗體抗原*馬血清抗毒素的兩重性：(1)特異性抗體----中和毒素(2)異種抗原，可刺激機體產(chǎn)生抗馬血清抗體馬血清具有立即提供保護的優(yōu)勢，但異種gamma-球蛋白只是短期有效，常常導(dǎo)致病理合并癥（血清?。┖瓦^敏反應(yīng)。*人源多克隆抗體－血液制品

人的gamma-球蛋白是最理想的(同源性免疫球蛋白)，但具有傳播肝炎和愛滋病的風(fēng)險。獻血員免疫（白喉毒素、狂犬病疫苗等）少量采血測效價大量采血制備抗體是*（3）單克隆抗體

(Monoclonalantibody,McAb)（3－1）概念:通過B細胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.特點:單一特異;可重復(fù);大量供應(yīng)不需純抗原;靈敏度高

**HAT:次黃嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)HGPRT：次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶*

(3-2)、抗原與動物免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原不需純化化學(xué)合成或者提純微生物或細胞可直接作為抗原*免疫動物：BALB/c小鼠和Lou大鼠

Balb/c小鼠，8-12周齡；雄性動物與骨髓瘤同品系P183頁佐劑:弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑*免疫方法：體內(nèi)免疫:免疫原性強,抗原量多.皮下注射,腹腔注射免疫體外免疫:不能用體內(nèi)免疫的雜交瘤細胞株不穩(wěn)定

*初步免疫和加強免疫測定抗體效價處死小鼠,去脾細胞**基本方法：取適量脾細胞（1*108）與骨髓瘤細胞（2*107-3*107）進行混合，在PEG作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時間控制在2min以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。其他融合方法:電融合等細胞：骨髓瘤細胞（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷型）應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交率高。（3－3）免疫及細胞融合*飼養(yǎng)細胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細胞不易生長繁殖，若加入其他活細胞則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的細胞稱飼養(yǎng)細胞。常用的有小鼠腹腔巨噬細胞、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。用于細胞融和的骨髓瘤細胞應(yīng)具備融和率高，自