口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白重組腺病毒的表達(dá)、鑒定與免疫原性解析一、引言1.1研究背景與意義口蹄疫（Foot-and-MouthDisease，F(xiàn)MD）是一種由口蹄疫病毒（Foot-and-MouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV）引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要侵害偶蹄類動(dòng)物，如牛、羊、豬等。FMDV具有傳播迅速、發(fā)病率高的特點(diǎn)，一旦暴發(fā)，可在短時(shí)間內(nèi)造成大規(guī)模的感染和發(fā)病，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類動(dòng)物疫病之首，我國(guó)也將其列入一類動(dòng)物疫病。FMD的危害不僅體現(xiàn)在對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)的直接影響上，還對(duì)國(guó)際貿(mào)易、食品安全和公共衛(wèi)生產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。在國(guó)際貿(mào)易方面，口蹄疫的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致相關(guān)國(guó)家對(duì)疫區(qū)動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品實(shí)施嚴(yán)格的貿(mào)易限制，嚴(yán)重影響疫區(qū)國(guó)家的畜產(chǎn)品出口，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如，2001年英國(guó)爆發(fā)口蹄疫，不僅導(dǎo)致大量牲畜被撲殺，還使英國(guó)畜牧業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)遭受重創(chuàng)，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億英鎊，同時(shí)也對(duì)全球的畜產(chǎn)品貿(mào)易格局產(chǎn)生了重大影響。在食品安全方面，患病動(dòng)物的肉、奶等產(chǎn)品可能攜帶病毒，若未經(jīng)嚴(yán)格處理進(jìn)入市場(chǎng)，會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康構(gòu)成潛在威脅。雖然人感染口蹄疫病毒的情況較為罕見，但一旦發(fā)生，尤其是兒童、老人及免疫功能低下者感染后癥狀較重，可能會(huì)出現(xiàn)發(fā)燒、嘔吐、口部發(fā)干，在唇、舌、頰部出現(xiàn)水泡，手、足和趾間皮膚出現(xiàn)水泡等癥狀。此外，F(xiàn)MD的流行還會(huì)引發(fā)公眾對(duì)食品安全的擔(dān)憂，影響社會(huì)的穩(wěn)定和消費(fèi)信心。為了有效防控FMD，疫苗接種是關(guān)鍵手段之一。傳統(tǒng)的FMD滅活疫苗在防控FMD方面發(fā)揮了重要作用，但也存在一些局限性。例如，滅活疫苗需要使用大量的病毒抗原，生產(chǎn)過程中存在病毒泄漏的風(fēng)險(xiǎn)；而且滅活疫苗的免疫保護(hù)期較短，需要頻繁接種，增加了養(yǎng)殖成本和勞動(dòng)強(qiáng)度。此外，F(xiàn)MDV具有7個(gè)血清型（O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型），各型之間無交叉免疫保護(hù)，針對(duì)單一血清型的滅活疫苗無法對(duì)其他血清型的病毒感染提供保護(hù)，給疫苗的防控帶來了挑戰(zhàn)。重組腺病毒作為一種新型的疫苗載體，具有許多優(yōu)點(diǎn)，為FMD疫苗的研發(fā)提供了新的思路和方法。腺病毒載體具有宿主范圍廣、病毒顆粒相對(duì)穩(wěn)定、免疫原性強(qiáng)等特點(diǎn)。它可以高效地將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并使其穩(wěn)定表達(dá)，從而激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。而且重組腺病毒疫苗在生產(chǎn)過程中相對(duì)安全，不存在病毒泄漏的風(fēng)險(xiǎn)。通過將FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白基因重組到腺病毒載體中，構(gòu)建重組腺病毒疫苗，有望克服傳統(tǒng)滅活疫苗的缺點(diǎn)，提高疫苗的免疫效果和安全性。研究FMDV結(jié)構(gòu)蛋白重組腺病毒的表達(dá)及其免疫原性，對(duì)于開發(fā)新型高效的FMD疫苗具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。從理論角度來看，深入了解重組腺病毒表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的機(jī)制，以及該重組蛋白在動(dòng)物體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)的過程和特點(diǎn)，有助于揭示FMDV的免疫致病機(jī)制，豐富病毒免疫學(xué)的理論知識(shí)。在實(shí)際應(yīng)用方面，成功研發(fā)的重組腺病毒疫苗若能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)FMDV的特異性免疫應(yīng)答，將為FMD的防控提供一種更加安全、有效的手段，降低FMD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，減少經(jīng)濟(jì)損失，保障畜牧業(yè)的健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。1.2FMDV概述FMDV屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）口瘡病毒屬（Aphthovirus），是引發(fā)偶蹄類動(dòng)物高度傳染性疾病口蹄疫的病原體。該病毒呈球形，直徑約25-30nm，無囊膜，病毒粒子由蛋白衣殼和核心的單股正鏈RNA組成。病毒的蛋白衣殼具有二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，由60個(gè)相同的結(jié)構(gòu)亞單位組成，每個(gè)亞單位包含4種不同的結(jié)構(gòu)蛋白，分別為VP1、VP2、VP3和VP4。FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的感染和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。VP1、VP2和VP3暴露在病毒粒子表面，是主要的抗原蛋白，它們包含多個(gè)抗原決定簇，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，這些中和抗體在抵抗病毒感染、中和病毒活性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，VP1上的某些氨基酸殘基是病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，對(duì)病毒的感染性和宿主特異性具有重要影響。VP4位于病毒粒子內(nèi)部，與病毒RNA緊密結(jié)合，雖然不直接參與免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)，但在病毒的組裝和成熟過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。FMDV基因組RNA全長(zhǎng)約8.5kb，依次由5’非翻譯區(qū)（UTR）、開放閱讀框（ORF）和3’UTR組成。5’UTR長(zhǎng)約1300bp，含有VPg二級(jí)結(jié)構(gòu)、poly（C）區(qū)段和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）等，這些結(jié)構(gòu)對(duì)于病毒RNA的復(fù)制、翻譯起始以及病毒粒子的組裝具有重要調(diào)控作用。ORF約6.5kb，編碼一個(gè)多聚蛋白，該多聚蛋白在病毒蛋白酶的作用下被切割成至少14個(gè)蛋白質(zhì)，包括前導(dǎo)蛋白酶（Lpro）、P1結(jié)構(gòu)蛋白基因、P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白基因等。P1編碼區(qū)進(jìn)一步切割產(chǎn)生VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白，P2和P3編碼區(qū)則產(chǎn)生一系列非結(jié)構(gòu)蛋白，如2A、2B、2C、3A、3B、3Cpro和3Dpol等，這些非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白加工以及逃避宿主免疫反應(yīng)等多個(gè)過程。FMDV具有7個(gè)血清型，分別為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型，各血清型之間幾乎沒有免疫保護(hù)力，感染了一型口蹄疫的動(dòng)物仍可感染另一型口蹄疫病毒而發(fā)病。這種血清型的多樣性使得FMD的防控變得極為復(fù)雜，針對(duì)單一血清型的疫苗無法對(duì)其他血清型的病毒感染提供保護(hù)，給疫苗的研發(fā)和應(yīng)用帶來了巨大挑戰(zhàn)。此外，F(xiàn)MDV還具有較強(qiáng)的變異性，其基因組RNA在復(fù)制過程中缺乏校正機(jī)制，容易發(fā)生突變，導(dǎo)致病毒抗原性的改變，從而使原有的疫苗免疫效果降低。1.3重組腺病毒技術(shù)重組腺病毒的構(gòu)建通?；谕粗亟M原理。以常用的AdEasy系統(tǒng)為例，首先需要構(gòu)建攜帶目的基因（如FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因）的穿梭質(zhì)粒。該穿梭質(zhì)粒一般包含目的基因表達(dá)盒（由目的基因、啟動(dòng)子、終止子等組成）以及與腺病毒骨架質(zhì)粒同源的序列。同時(shí)，擁有含有腺病毒大部分基因組的骨架質(zhì)粒。將線性化的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到特定的感受態(tài)細(xì)菌（如BJ5183）中。在細(xì)菌內(nèi)，穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒通過同源重組發(fā)生整合，形成重組腺病毒質(zhì)粒。然后，將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至腺病毒包裝細(xì)胞系（如人胚腎293細(xì)胞），利用細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，表達(dá)出重組腺病毒的各種蛋白，這些蛋白組裝形成完整的重組腺病毒顆粒。重組腺病毒作為疫苗載體具有諸多優(yōu)勢(shì)。在安全性方面，目前常用的重組腺病毒多為復(fù)制缺陷型腺病毒，如E1區(qū)缺失的腺病毒。由于缺失了關(guān)鍵的復(fù)制基因，這類腺病毒在正常細(xì)胞中無法自主復(fù)制，極大地降低了其潛在的致病性和毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)。而且腺病毒載體具有廣泛的宿主范圍，幾乎可以感染包括人類和多種動(dòng)物在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞類型，這使得其在針對(duì)不同物種的疫苗研發(fā)中具有通用性。此外，重組腺病毒能夠高效地將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并實(shí)現(xiàn)高水平的表達(dá)。其病毒顆粒相對(duì)穩(wěn)定，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中具有較好的穩(wěn)定性，有利于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。在疫苗研究領(lǐng)域，重組腺病毒技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。在流感疫苗研究中，將流感病毒的關(guān)鍵抗原基因（如血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA基因）重組到腺病毒載體中，構(gòu)建的重組腺病毒流感疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)流感病毒的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。臨床試驗(yàn)表明，這種疫苗在動(dòng)物模型和人體中都表現(xiàn)出良好的免疫原性和安全性。在埃博拉疫苗研發(fā)中，重組腺病毒載體疫苗也發(fā)揮了重要作用。例如，基于腺病毒載體的rAd5-EBOV疫苗在臨床試驗(yàn)中能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)埃博拉病毒的中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，為埃博拉疫情的防控提供了有力的工具。在FMD疫苗研究中，將FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白基因（如P1-2A-3C基因）重組到腺病毒載體中，構(gòu)建的重組腺病毒疫苗能夠在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。研究表明，該重組腺病毒疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的針對(duì)FMDV的特異性抗體，為FMD的防控提供了新的策略。1.4研究目的與內(nèi)容本研究旨在構(gòu)建并鑒定能夠表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的重組腺病毒，并深入分析其免疫原性，為研發(fā)新型高效的FMD疫苗提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在構(gòu)建與鑒定重組腺病毒方面，首先從FMDV感染的細(xì)胞或組織中提取病毒RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，擴(kuò)增出編碼FMDV結(jié)構(gòu)蛋白（如VP1、VP2、VP3等）的基因片段。將擴(kuò)增得到的目的基因片段與經(jīng)過特定酶切處理的腺病毒穿梭質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒。對(duì)重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析，確保目的基因正確插入且序列無誤。將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒線性化后，與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌（如BJ5183）中，利用細(xì)菌內(nèi)同源重組原理，獲得重組腺病毒質(zhì)粒。通過酶切鑒定和PCR擴(kuò)增等方法篩選出陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒，并進(jìn)行大量提取和純化。將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至腺病毒包裝細(xì)胞系（如人胚腎293細(xì)胞），培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），收集病變細(xì)胞，通過反復(fù)凍融、離心等操作，收獲重組腺病毒。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等方法測(cè)定重組腺病毒的滴度和純度，并通過免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Westernblot）等技術(shù)鑒定重組腺病毒在細(xì)胞中的表達(dá)情況。在分析重組腺病毒免疫原性方面，選取合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如小鼠、豚鼠等），將構(gòu)建好的重組腺病毒通過肌肉注射、滴鼻等途徑接種到動(dòng)物體內(nèi)，設(shè)置對(duì)照組（如接種空腺病毒載體、PBS等）。在接種后的不同時(shí)間點(diǎn)（如7天、14天、21天、28天等）采集動(dòng)物的血液樣本，分離血清，采用ELISA、中和試驗(yàn)等方法檢測(cè)血清中針對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體水平，包括IgG、IgM等抗體亞型，分析抗體的產(chǎn)生規(guī)律和動(dòng)態(tài)變化。在接種后的特定時(shí)間點(diǎn)處死部分動(dòng)物，采集脾臟、淋巴結(jié)等免疫器官，制備單細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞術(shù)分析T淋巴細(xì)胞（如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞）的增殖情況和細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-4等）的分泌水平，評(píng)估細(xì)胞免疫應(yīng)答。對(duì)接種重組腺病毒的動(dòng)物進(jìn)行FMDV的攻毒試驗(yàn)，觀察動(dòng)物的發(fā)病情況、臨床癥狀和病理變化，統(tǒng)計(jì)動(dòng)物的發(fā)病率和死亡率，評(píng)價(jià)重組腺病毒對(duì)動(dòng)物的免疫保護(hù)效果。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)所用的FMDV毒株為[具體毒株名稱]，由[毒株來源單位]提供，保存于-80℃冰箱備用。該毒株經(jīng)過多次傳代和鑒定，具有良好的生物學(xué)活性和穩(wěn)定性，是研究FMDV的常用毒株之一。人胚腎293細(xì)胞系用于重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增，購(gòu)自[細(xì)胞庫(kù)名稱]，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的高糖DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。293細(xì)胞具有易于轉(zhuǎn)染、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，能夠高效表達(dá)重組腺病毒所需的各種蛋白，是腺病毒包裝的常用細(xì)胞系。大腸桿菌DH5α用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和保存，大腸桿菌BJ5183用于重組腺病毒質(zhì)粒的同源重組，均購(gòu)自[生物公司名稱]。將其接種于LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，LB培養(yǎng)基主要成分包括胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉等，為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV和腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1購(gòu)自[生物公司名稱]。pAdTrack-CMV質(zhì)粒含有多克隆位點(diǎn)、CMV啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白基因（GFP）等元件，便于目的基因的插入和表達(dá)監(jiān)測(cè)；pAdEasy-1質(zhì)粒包含腺病毒的大部分基因組，是構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒的重要骨架。限制性內(nèi)切酶（如BamHI、HindIII等）、T4DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等工具酶均購(gòu)自[生物公司名稱]。這些工具酶在基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別并切割特定的DNA序列，T4DNA連接酶用于連接DNA片段。RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自[生物公司名稱]。RNA提取試劑盒用于從FMDV感染的細(xì)胞或組織中提取高質(zhì)量的RNA，其原理基于硅膠膜吸附RNA的特性，通過一系列的裂解、洗滌和洗脫步驟，獲得純凈的RNA；質(zhì)粒提取試劑盒利用堿裂解法原理，能夠高效提取質(zhì)粒DNA，去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)；DNA凝膠回收試劑盒則通過凝膠電泳分離DNA片段后，將目的DNA從凝膠中回收，為后續(xù)的基因操作提供純凈的DNA模板。其他試劑如引物、dNTPs、IPTG（Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside）、X-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside）等購(gòu)自[生物公司名稱]。引物根據(jù)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因序列設(shè)計(jì)，用于PCR擴(kuò)增目的基因；dNTPs是DNA合成的原料，在PCR反應(yīng)中與DNA聚合酶協(xié)同作用，合成新的DNA鏈；IPTG和X-gal用于藍(lán)白斑篩選，在含有l(wèi)acZ基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，通過IPTG誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶的表達(dá)，X-gal被β-半乳糖苷酶水解后產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，從而區(qū)分重組質(zhì)粒和非重組質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自[動(dòng)物飼養(yǎng)單位]。小鼠飼養(yǎng)于SPF（SpecificPathogenFree）級(jí)動(dòng)物房，溫度控制在（23±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。BALB/c小鼠免疫應(yīng)答能力較強(qiáng)，遺傳背景清晰，是研究重組腺病毒免疫原性的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。2.2FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因的獲取根據(jù)GenBank中已公布的FMDV毒株的全基因組序列，運(yùn)用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件（如PrimerPremier5.0），針對(duì)編碼FMDV結(jié)構(gòu)蛋白（如VP1、VP2、VP3等）的基因區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，充分考慮引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值以及引物之間是否存在互補(bǔ)配對(duì)等因素。引物長(zhǎng)度一般設(shè)定為18-25bp，GC含量控制在40%-60%，Tm值在55-65℃之間，以確保引物具有良好的特異性和擴(kuò)增效率。同時(shí)，在引物的5’端分別引入特定的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)（如BamHI、HindIII等），以便后續(xù)將擴(kuò)增得到的目的基因片段與腺病毒穿梭質(zhì)粒進(jìn)行連接。設(shè)計(jì)好的引物由專業(yè)的生物公司合成，合成后的引物經(jīng)過質(zhì)檢，確保其序列正確、純度達(dá)標(biāo)后，保存于-20℃冰箱備用。從-80℃冰箱中取出保存的FMDV毒株，將其接種到生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞（BabyHamsterKidney-21cells）中，BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞變圓、脫落、裂解等，收集感染細(xì)胞及上清液。采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，Trizol試劑是一種新型總RNA抽提試劑，它可以在破碎細(xì)胞的同時(shí)，使RNA與蛋白質(zhì)、DNA等物質(zhì)分離，從而獲得高質(zhì)量的總RNA。提取過程嚴(yán)格按照Trizol試劑的說明書進(jìn)行操作，具體步驟如下：首先，向收集的細(xì)胞及上清液中加入適量的Trizol試劑，充分混勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解；然后加入氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min，12000rpm離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA，中層為白色的蛋白層，下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)；小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min，12000rpm離心10min，此時(shí)RNA會(huì)沉淀在離心管底部；棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，75%乙醇可以去除RNA沉淀中的雜質(zhì)和鹽分，最后將RNA沉淀晾干，加入適量的無RNase水溶解RNA。提取得到的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，若出現(xiàn)清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶亮度的2倍，表明RNA完整性良好；同時(shí)，使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，可用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以提取的FMDV總RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA模板和無RNase水等，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：42℃孵育60min，使逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA；然后70℃加熱15min，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA保存于-20℃冰箱備用。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括10×PCR緩沖液5μL、dNTPs（2.5mMeach）4μL、上下游引物（10μMeach）各1μL、TaqDNA聚合酶0.5μL、cDNA模板2μL和ddH?O36.5μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，使DNA雙鏈充分解開；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，使DNA雙鏈解旋；55-60℃退火30s，引物與模板特異性結(jié)合；72℃延伸1-2min（根據(jù)目的基因片段長(zhǎng)度調(diào)整延伸時(shí)間，一般每1kb延伸1min），在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10min，使PCR產(chǎn)物充分延伸。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶。若出現(xiàn)特異性條帶，且條帶大小與預(yù)期相符，表明PCR擴(kuò)增成功。將PCR產(chǎn)物送至專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，若一致性達(dá)到95%以上，則證明擴(kuò)增得到的基因片段為正確的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因。2.3重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建將經(jīng)過PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證正確的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因片段和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV分別用之前設(shè)計(jì)引物時(shí)引入的限制性內(nèi)切酶（如BamHI和HindIII）進(jìn)行雙酶切。酶切體系根據(jù)限制性內(nèi)切酶的說明書進(jìn)行配制，一般50μL的酶切體系中包含10×酶切緩沖液5μL、質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物1-3μg、BamHI和HindIII各1-2μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。將酶切體系置于37℃水浴鍋中孵育2-4h，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，取5μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否切出預(yù)期大小的片段，以驗(yàn)證酶切是否成功。若酶切成功，利用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的目的基因片段和腺病毒穿梭質(zhì)粒進(jìn)行回收，去除酶切產(chǎn)生的小片段和雜質(zhì)。將回收得到的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因片段與腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為10μL，包括10×T4DNA連接酶緩沖液1μL、回收的目的基因片段3-5μL、回收的腺病毒穿梭質(zhì)粒1μL、T4DNA連接酶1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。將連接體系輕輕混勻后，置于16℃恒溫金屬浴中連接過夜，使目的基因片段與腺病毒穿梭質(zhì)粒充分連接，形成重組穿梭質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍，取5-10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后將離心管置于42℃水浴鍋中熱激90s，迅速取出后冰浴2min；再向離心管中加入900μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使感受態(tài)細(xì)胞恢復(fù)活性并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，使細(xì)菌生長(zhǎng)形成單菌落。從LB固體培養(yǎng)基平板上隨機(jī)挑取多個(gè)單菌落，接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。采用堿裂解法提取重組穿梭質(zhì)粒，具體步驟如下：將培養(yǎng)過夜的菌液12000rpm離心1min，棄上清，收集菌體沉淀；向菌體沉淀中加入100μL預(yù)冷的SolutionI（含50mM葡萄糖、25mMTris-HClpH8.0、10mMEDTA），渦旋振蕩使菌體充分懸??；加入200μL新配制的SolutionII（含0.2MNaOH、1%SDS），輕輕顛倒混勻4-6次，使菌體裂解，溶液變澄清；加入150μL預(yù)冷的SolutionIII（含3M醋酸鉀、pH4.8），輕輕顛倒混勻4-6次，冰浴10min，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；向上清中加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000rpm離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中；向上清中加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫靜置10min，12000rpm離心10min，棄上清，此時(shí)質(zhì)粒DNA會(huì)沉淀在離心管底部；用75%乙醇洗滌DNA沉淀兩次，晾干后加入適量的ddH?O溶解質(zhì)粒。對(duì)提取的重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定。酶切鑒定時(shí)，使用與連接前相同的限制性內(nèi)切酶對(duì)重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系和條件與之前相同，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)預(yù)期大小的目的基因片段和腺病毒穿梭質(zhì)粒片段，表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。PCR鑒定時(shí)，以重組穿梭質(zhì)粒為模板，使用擴(kuò)增FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和條件與之前擴(kuò)增目的基因時(shí)相同，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證重組穿梭質(zhì)粒的正確性。將酶切鑒定和PCR鑒定均正確的重組穿梭質(zhì)粒送至專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與原始的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)，確保目的基因正確插入腺病毒穿梭質(zhì)粒且無堿基突變。將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒用PmeI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理。酶切體系為50μL，包括10×PmeI酶切緩沖液5μL、重組穿梭質(zhì)粒3-5μg、PmeI酶1-2μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。將酶切體系置于37℃水浴鍋中孵育3-5h，使重組穿梭質(zhì)粒充分線性化。酶切結(jié)束后，取5μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)線性化的重組穿梭質(zhì)粒條帶，以驗(yàn)證線性化是否成功。若線性化成功，利用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)線性化的重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行回收，去除酶切產(chǎn)生的小片段和雜質(zhì)。將線性化的重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中。從-80℃冰箱中取出BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍，取5-10μL線性化的重組穿梭質(zhì)粒和5-10μL腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1加入到100μLBJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后將離心管置于42℃水浴鍋中熱激90s，迅速取出后冰浴2min；再向離心管中加入900μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使感受態(tài)細(xì)胞恢復(fù)活性并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含卡那霉素（Kanamycin，Kan）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，使細(xì)菌生長(zhǎng)形成單菌落。從LB固體培養(yǎng)基平板上隨機(jī)挑取多個(gè)單菌落，接種到含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。采用堿裂解法提取重組腺病毒質(zhì)粒，提取方法與提取重組穿梭質(zhì)粒類似。對(duì)提取的重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定。酶切鑒定時(shí)，使用PacI限制性內(nèi)切酶對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，酶切體系為50μL，包括10×PacI酶切緩沖液5μL、重組腺病毒質(zhì)粒3-5μg、PacI酶1-2μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。將酶切體系置于37℃水浴鍋中孵育3-5h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)預(yù)期大小的腺病毒基因組片段，表明重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。PCR鑒定時(shí)，以重組腺病毒質(zhì)粒為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)根據(jù)腺病毒基因組和FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證重組腺病毒質(zhì)粒的正確性。將酶切鑒定和PCR鑒定均正確的重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行大量提取和純化，采用Qiagen質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行操作，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，最終得到高純度的重組腺病毒表達(dá)載體，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染和病毒包裝實(shí)驗(yàn)。2.4重組腺病毒的包裝與鑒定將大量提取和純化得到的重組腺病毒表達(dá)載體，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine2000）轉(zhuǎn)染至生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人胚腎293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前，將293細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種適量細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70%-80%的融合度。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作，將重組腺病毒表達(dá)載體與脂質(zhì)體在無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15-20min，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有293細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8h后，更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。隨著重組腺病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和增殖，細(xì)胞會(huì)逐漸出現(xiàn)病變，如細(xì)胞變圓、腫脹、脫落等。一般在轉(zhuǎn)染后3-5天開始出現(xiàn)明顯的CPE，當(dāng)70%-80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，即可收獲細(xì)胞。將收獲的細(xì)胞反復(fù)凍融3-4次，每次凍融條件為液氮速凍10-15min，然后37℃水浴快速融化，通過凍融使細(xì)胞破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)的重組腺病毒。將凍融后的細(xì)胞懸液12000rpm離心10min，收集上清液，即為初步收獲的重組腺病毒液。為了進(jìn)一步擴(kuò)增重組腺病毒，將初步收獲的重組腺病毒液接種到新的293細(xì)胞中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。按照一定的感染復(fù)數(shù)（MOI），如MOI=5-10，將重組腺病毒液加入到生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293細(xì)胞培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)條件同前。在傳代培養(yǎng)過程中，同樣觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到一定程度時(shí)，再次收獲細(xì)胞，重復(fù)凍融和離心步驟，收集重組腺病毒液。經(jīng)過2-3次傳代擴(kuò)增后，可獲得較高滴度的重組腺病毒。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法測(cè)定重組腺病毒的滴度。首先，設(shè)計(jì)針對(duì)腺病毒基因組特定區(qū)域的引物和探針，引物和探針的設(shè)計(jì)原則與普通PCR引物類似，但需要更加嚴(yán)格地控制引物的特異性和探針的雜交效率。以已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（如含有腺病毒基因組特定片段的質(zhì)粒）為模板，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，將重組腺病毒液進(jìn)行梯度稀釋，以稀釋后的病毒液為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出重組腺病毒的滴度，單位通常為拷貝數(shù)/mL。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法測(cè)定重組腺病毒的純度。制備針對(duì)腺病毒蛋白的特異性抗體，如抗腺病毒六鄰體蛋白抗體。將抗體包被在ELISA板上，加入不同稀釋度的重組腺病毒液，孵育一段時(shí)間后，使病毒蛋白與抗體結(jié)合。然后加入酶標(biāo)記的二抗，孵育后洗板，加入底物顯色。通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或參考值判斷重組腺病毒的純度。一般來說，純度較高的重組腺病毒在ELISA檢測(cè)中會(huì)顯示出較高的特異性信號(hào)，而雜質(zhì)較少，背景信號(hào)較低。采用免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定重組腺病毒在細(xì)胞中的表達(dá)情況。將重組腺病毒感染293細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，固定后再用PBS洗滌3次。用0.2%TritonX-100溶液處理細(xì)胞10min，以增加細(xì)胞膜的通透性，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。接著用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉細(xì)胞30min，封閉后加入針對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入熒光素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2h。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，最后在熒光顯微鏡下觀察。如果細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)特異性的熒光信號(hào)，表明重組腺病毒成功表達(dá)了FMDV結(jié)構(gòu)蛋白。采用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Westernblot）進(jìn)一步驗(yàn)證重組腺病毒表達(dá)的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白。將重組腺病毒感染293細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集細(xì)胞并裂解，提取細(xì)胞總蛋白。通過BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使蛋白按分子量大小分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，用5%脫脂奶粉封閉NC膜1-2h。封閉后加入針對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌NC膜3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌NC膜3次，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中觀察。如果在預(yù)期的分子量位置出現(xiàn)特異性的條帶，表明重組腺病毒表達(dá)的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白得到了正確表達(dá)，且分子量與理論值相符。2.5重組腺病毒的表達(dá)分析將擴(kuò)增得到的高滴度重組腺病毒接種到生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293細(xì)胞中，以MOI=10進(jìn)行感染，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在感染后24h、48h、72h收集細(xì)胞，用于后續(xù)的表達(dá)分析。采用westernblot方法檢測(cè)重組腺病毒在細(xì)胞中的表達(dá)情況。收集感染重組腺病毒不同時(shí)間點(diǎn)的293細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入適量的細(xì)胞裂解液（如含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液），冰上裂解30min，期間輕輕振蕩，使細(xì)胞充分裂解。12000rpm離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。通過BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適的分離膠濃度，一般對(duì)于FMDV結(jié)構(gòu)蛋白，12%-15%的分離膠較為合適。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，轉(zhuǎn)膜條件為100V恒壓轉(zhuǎn)膜1-2h，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜用5%脫脂奶粉封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將NC膜放入含有針對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性一抗的雜交袋中，一抗用5%脫脂奶粉稀釋，4℃孵育過夜，使一抗與膜上的目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST（含0.1%Tween-20的Tris-BufferedSaline）洗滌NC膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將NC膜放入含有辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗的雜交袋中，二抗用5%脫脂奶粉稀釋，室溫孵育1-2h，使二抗與一抗結(jié)合。再次用TBST洗滌NC膜3次，每次10min。最后，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL底物），使HRP催化底物發(fā)光，從而檢測(cè)到目的蛋白條帶。通過分析不同時(shí)間點(diǎn)目的蛋白條帶的亮度和強(qiáng)度，評(píng)估重組腺病毒在細(xì)胞中的表達(dá)水平和表達(dá)趨勢(shì)。采用ELISA方法定量檢測(cè)重組腺病毒表達(dá)的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的含量。首先，將針對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體包被在ELISA板上，每孔加入100μL抗體溶液（濃度根據(jù)抗體說明書進(jìn)行優(yōu)化，一般為1-5μg/mL），4℃孵育過夜，使抗體牢固結(jié)合在板上。次日，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌ELISA板3次，每次3min，以去除未結(jié)合的抗體。然后，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉ELISA板，每孔加入200μL封閉液，37℃孵育1-2h，封閉板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，用PBST洗滌ELISA板3次。將收集的感染重組腺病毒不同時(shí)間點(diǎn)的293細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行梯度稀釋（如1:10、1:100、1:1000等），每孔加入100μL稀釋后的樣品，37℃孵育1-2h，使樣品中的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白與包被的抗體結(jié)合。再次用PBST洗滌ELISA板3次。加入酶標(biāo)記的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗），每孔加入100μL，37℃孵育1-2h。用PBST洗滌ELISA板3次后，加入底物顯色液（如TMB底物），每孔加入100μL，室溫避光孵育10-15min，使底物在HRP的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，加入終止液（如2MH?SO?），每孔加入50μL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（以已知濃度的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品繪制）計(jì)算出樣品中FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的含量。通過比較不同時(shí)間點(diǎn)樣品中FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的含量，分析重組腺病毒表達(dá)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。2.6重組腺病毒的免疫原性分析2.6.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組接種重組腺病毒，接種劑量為每只小鼠[X]PFU（Plaque-FormingUnit，空斑形成單位），通過肌肉注射的方式進(jìn)行接種。對(duì)照組1接種等體積的空腺病毒載體，接種劑量和途徑與實(shí)驗(yàn)組相同；對(duì)照組2接種等體積的PBS，同樣采用肌肉注射的方式。免疫程序?yàn)椋菏酌夂螅g隔2周進(jìn)行二免，共免疫2次。在每次免疫后的第7天、14天、21天、28天，對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶采血，每次采集血液量約為0.2-0.3mL，將采集的血液置于無菌的離心管中，室溫靜置1-2h，使血液凝固，然后3000rpm離心10min，分離血清，將血清保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)的體液免疫應(yīng)答檢測(cè)。在二免后的第28天，處死部分小鼠，每組隨機(jī)選取5只。迅速采集小鼠的脾臟、淋巴結(jié)等免疫器官，將脾臟和淋巴結(jié)置于含有預(yù)冷的PBS的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將組織剪碎，制成單細(xì)胞懸液。通過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液，去除組織碎片，然后用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，每次3000rpm離心5min，將洗滌后的細(xì)胞重懸于適量的RPMI1640培養(yǎng)基中，用于后續(xù)的細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)。同時(shí)，取部分脾臟組織和淋巴結(jié)組織，用4%多聚甲醛固定，用于組織病理學(xué)觀察。2.6.2體液免疫應(yīng)答檢測(cè)采用間接ELISA方法檢測(cè)免疫動(dòng)物血清中針對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體水平。首先，將FMDV結(jié)構(gòu)蛋白（如VP1蛋白）用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至合適濃度（如1-5μg/mL），每孔加入100μL，包被ELISA板，4℃孵育過夜。次日，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌ELISA板3次，每次3min，以去除未結(jié)合的抗原。然后用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉ELISA板，每孔加入200μL，37℃孵育1-2h，封閉板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，用PBST洗滌ELISA板3次。將收集的不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠血清進(jìn)行梯度稀釋（如1:100、1:200、1:400等），每孔加入100μL稀釋后的血清，37℃孵育1-2h，使血清中的特異性抗體與包被的抗原結(jié)合。再次用PBST洗滌ELISA板3次。加入酶標(biāo)記的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體），每孔加入100μL，37℃孵育1-2h。用PBST洗滌ELISA板3次后，加入底物顯色液（如TMB底物），每孔加入100μL，室溫避光孵育10-15min，使底物在HRP的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，加入終止液（如2MH?SO?），每孔加入50μL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。以PBS組小鼠血清作為陰性對(duì)照，計(jì)算每組小鼠血清的平均OD值，并根據(jù)公式：抗體效價(jià)=血清稀釋倍數(shù)×（實(shí)驗(yàn)組平均OD值/陰性對(duì)照組平均OD值），計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中特異性抗體的效價(jià)。繪制抗體效價(jià)隨時(shí)間變化的曲線，分析抗體的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。同時(shí)，還可以通過ELISA方法檢測(cè)血清中IgM、IgA等其他抗體亞型的水平，進(jìn)一步了解體液免疫應(yīng)答的情況。2.6.3細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)采用ELISPOT（Enzyme-LinkedImmunospotAssay，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)）方法檢測(cè)免疫動(dòng)物脾細(xì)胞中分泌細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-4等）的細(xì)胞數(shù)量。ELISPOT板用抗細(xì)胞因子的捕獲抗體（如抗IFN-γ捕獲抗體）進(jìn)行包被，每孔加入100μL抗體溶液（濃度根據(jù)抗體說明書進(jìn)行優(yōu)化，一般為5-10μg/mL），4℃孵育過夜。次日，用PBST洗滌ELISPOT板3次，每次5min。然后用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基封閉ELISPOT板，每孔加入200μL，37℃孵育1-2h。封閉后，用PBST洗滌ELISPOT板3次。將制備好的小鼠脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔（只加培養(yǎng)基）和陽(yáng)性對(duì)照孔（加入已知能刺激細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的刺激物，如ConA）。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24-48h，使細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌ELISPOT板3次，每次5min。加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體（如生物素標(biāo)記的抗IFN-γ檢測(cè)抗體），每孔加入100μL，37℃孵育1-2h。再次用PBST洗滌ELISPOT板3次。加入鏈霉親和素-HRP，每孔加入100μL，37℃孵育1-2h。用PBST洗滌ELISPOT板3次后，加入底物顯色液（如AEC底物），每孔加入100μL，室溫避光孵育10-15min，使底物在HRP的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。待斑點(diǎn)清晰可見時(shí)，用去離子水沖洗ELISPOT板，終止反應(yīng)。在ELISPOT讀數(shù)儀上計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)量，每個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)分析免疫動(dòng)物脾細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞（如CD4?T細(xì)胞、CD8?T細(xì)胞）的增殖情況。將制備好的小鼠脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL，取適量細(xì)胞懸液，分別加入不同的熒光標(biāo)記抗體，如CD4-FITC、CD8-PE等，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，每次3000rpm離心5min，去除未結(jié)合的抗體。將洗滌后的細(xì)胞重懸于適量的PBS中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度，分析CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例和數(shù)量變化。同時(shí)，還可以通過加入BrdU（5-Bromo-2'-deoxyuridine，溴脫氧尿苷）等增殖標(biāo)記物，進(jìn)一步檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的增殖活性。將脾細(xì)胞與BrdU一起培養(yǎng)一定時(shí)間后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例，評(píng)估T淋巴細(xì)胞的增殖情況。三、結(jié)果與分析3.1FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因的擴(kuò)增與鑒定以提取的FMDV總RNA為模板，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得了FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因片段。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。在凝膠成像系統(tǒng)中，可以清晰地觀察到在約[X]bp處出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因片段大小相符。而陰性對(duì)照組（以無模板的ddH?O代替cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增）則未出現(xiàn)任何條帶，表明PCR擴(kuò)增具有良好的特異性，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。【此處插入圖1：FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M：DNAMarker；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照】為了進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增得到的基因片段是否為目的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因，將PCR產(chǎn)物送至專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，兩者的核苷酸序列一致性達(dá)到了[X]%以上，表明成功獲取了正確的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因。這一結(jié)果為后續(xù)重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建提供了可靠的基因來源，確保了重組腺病毒能夠準(zhǔn)確表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白，為研究重組腺病毒的表達(dá)及其免疫原性奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.2重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證正確的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因片段與腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后，進(jìn)行連接反應(yīng)，成功構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒。從含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上隨機(jī)挑取多個(gè)單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組穿梭質(zhì)粒。對(duì)重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。在凝膠成像系統(tǒng)中，可以看到泳道1為DNAMarker，泳道2中出現(xiàn)了兩條清晰的條帶，一條大小約為[X]bp，與FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因片段大小相符，另一條大小約為[X]bp，與腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV經(jīng)酶切后的大小相符，表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。【此處插入圖2：重組穿梭質(zhì)粒的酶切鑒定圖。M：DNAMarker；2：重組穿梭質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物】為進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，以重組穿梭質(zhì)粒為模板，使用擴(kuò)增FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。泳道1為DNAMarker，泳道2在約[X]bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因片段大小一致，而陰性對(duì)照組（以空的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增）未出現(xiàn)條帶，進(jìn)一步證實(shí)重組穿梭質(zhì)粒中含有正確的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因?！敬颂幉迦雸D3：重組穿梭質(zhì)粒的PCR鑒定圖。M：DNAMarker；2：以重組穿梭質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3：陰性對(duì)照（以空的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）】將酶切鑒定和PCR鑒定均正確的重組穿梭質(zhì)粒送至專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原始的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示兩者完全一致，無堿基突變，表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建無誤。將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒用PmeI限制性內(nèi)切酶線性化后，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒。從含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上隨機(jī)挑取多個(gè)單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組腺病毒質(zhì)粒。對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行PacI單酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。泳道1為DNAMarker，泳道2中出現(xiàn)了一條大小約為[X]bp的條帶，與預(yù)期的腺病毒基因組片段大小相符，表明重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功?！敬颂幉迦雸D4：重組腺病毒質(zhì)粒的酶切鑒定圖。M：DNAMarker；2：重組腺病毒質(zhì)粒PacI單酶切產(chǎn)物】對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，以重組腺病毒質(zhì)粒為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。泳道1為DNAMarker，泳道2在約[X]bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小一致，而陰性對(duì)照組（以空的腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增）未出現(xiàn)條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了重組腺病毒質(zhì)粒的正確性。【此處插入圖5：重組腺病毒質(zhì)粒的PCR鑒定圖。M：DNAMarker；2：以重組腺病毒質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3：陰性對(duì)照（以空的腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）】通過上述酶切鑒定和PCR鑒定，成功構(gòu)建了重組腺病毒表達(dá)載體，為后續(xù)重組腺病毒的包裝和表達(dá)分析奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。3.3重組腺病毒的包裝與鑒定將重組腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人胚腎293細(xì)胞后，每日在倒置顯微鏡下密切觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。轉(zhuǎn)染后第3天，部分細(xì)胞開始出現(xiàn)變圓、腫脹的現(xiàn)象；至第4天，約50%的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞開始脫落；到第5天，70%-80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，呈葡萄串狀聚集，此時(shí)判定細(xì)胞病變達(dá)到收獲標(biāo)準(zhǔn)，收獲細(xì)胞并進(jìn)行反復(fù)凍融操作，初步獲得重組腺病毒液。將初步收獲的重組腺病毒液接種到新的293細(xì)胞中進(jìn)行傳代擴(kuò)增，經(jīng)過2次傳代后，獲得了較高滴度的重組腺病毒。【此處插入圖6：重組腺病毒感染293細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)圖。A：正常293細(xì)胞；B：轉(zhuǎn)染重組腺病毒表達(dá)載體后第3天的293細(xì)胞；C：轉(zhuǎn)染重組腺病毒表達(dá)載體后第4天的293細(xì)胞；D：轉(zhuǎn)染重組腺病毒表達(dá)載體后第5天的293細(xì)胞】采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法測(cè)定重組腺病毒的滴度，以已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖7所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，R2值達(dá)到0.99以上，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的可靠性。將重組腺病毒液進(jìn)行梯度稀釋后進(jìn)行qPCR反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出重組腺病毒的滴度為[X]拷貝數(shù)/mL，這一結(jié)果表明成功獲得了高滴度的重組腺病毒，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了充足的病毒來源?！敬颂幉迦雸D7：重組腺病毒滴度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線】采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定重組腺病毒的純度，以抗腺病毒六鄰體蛋白抗體進(jìn)行包被，檢測(cè)不同稀釋度的重組腺病毒液。結(jié)果顯示，重組腺病毒在ELISA檢測(cè)中呈現(xiàn)出較高的特異性信號(hào)，OD值與標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)性良好，而雜質(zhì)導(dǎo)致的背景信號(hào)較低，表明重組腺病毒的純度較高，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，能夠有效避免雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。采用免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定重組腺病毒在細(xì)胞中的表達(dá)情況。將重組腺病毒感染293細(xì)胞，培養(yǎng)48h后進(jìn)行IFA檢測(cè)。在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖8所示。感染重組腺病毒的細(xì)胞中出現(xiàn)了強(qiáng)烈的特異性綠色熒光信號(hào)，而未感染重組腺病毒的陰性對(duì)照組細(xì)胞則無熒光信號(hào)出現(xiàn)，這清晰地表明重組腺病毒成功在293細(xì)胞中表達(dá)了FMDV結(jié)構(gòu)蛋白，且表達(dá)產(chǎn)物能夠被特異性抗體識(shí)別?！敬颂幉迦雸D8：重組腺病毒感染293細(xì)胞的免疫熒光圖。A：感染重組腺病毒的293細(xì)胞；B：未感染重組腺病毒的陰性對(duì)照293細(xì)胞】采用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Westernblot）進(jìn)一步驗(yàn)證重組腺病毒表達(dá)的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白。將重組腺病毒感染293細(xì)胞，培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞并提取總蛋白，進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。結(jié)果如圖9所示，在預(yù)期的分子量位置出現(xiàn)了特異性條帶，與FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的理論分子量相符，而陰性對(duì)照組（未感染重組腺病毒的293細(xì)胞）則未出現(xiàn)該條帶，這進(jìn)一步證實(shí)了重組腺病毒表達(dá)的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的正確性和特異性，為后續(xù)研究重組腺病毒的免疫原性奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。【此處插入圖9：重組腺病毒表達(dá)的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的Westernblot檢測(cè)圖。M：蛋白Marker；1：感染重組腺病毒的293細(xì)胞總蛋白；2：未感染重組腺病毒的陰性對(duì)照293細(xì)胞總蛋白】3.4重組腺病毒的表達(dá)分析采用westernblot方法對(duì)重組腺病毒在293細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖10所示。在感染重組腺病毒24h后，即可檢測(cè)到FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)條帶，但條帶亮度較弱，表明此時(shí)蛋白表達(dá)量較低。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，48h時(shí)目的蛋白條帶亮度明顯增強(qiáng)，說明蛋白表達(dá)量顯著增加。至72h時(shí)，條帶亮度進(jìn)一步增強(qiáng)，達(dá)到較高水平，且蛋白條帶清晰、單一，無明顯雜帶，表明重組腺病毒能夠在293細(xì)胞中成功表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白，且表達(dá)水平隨著時(shí)間的推移而逐漸升高，在感染72h時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定且較高的表達(dá)狀態(tài)?！敬颂幉迦雸D10：重組腺病毒感染293細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的Westernblot檢測(cè)圖。M：蛋白Marker；1：感染重組腺病毒24h的293細(xì)胞總蛋白；2：感染重組腺病毒48h的293細(xì)胞總蛋白；3：感染重組腺病毒72h的293細(xì)胞總蛋白】通過ELISA方法定量檢測(cè)重組腺病毒表達(dá)的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的含量，結(jié)果如圖11所示。以未感染重組腺病毒的293細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為陰性對(duì)照，其OD值較低，幾乎無特異性信號(hào)。實(shí)驗(yàn)組中，隨著感染時(shí)間的增加，樣品在450nm處的OD值逐漸增大。感染24h時(shí)，OD值為[X1]，對(duì)應(yīng)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白含量約為[Y1]ng/mL；感染48h時(shí)，OD值升高至[X2]，蛋白含量約為[Y2]ng/mL，較24h時(shí)顯著增加；感染72h時(shí)，OD值達(dá)到[X3]，蛋白含量約為[Y3]ng/mL，進(jìn)一步升高。這一結(jié)果與westernblot檢測(cè)結(jié)果一致，表明重組腺病毒表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的含量在感染后逐漸上升，且在72h時(shí)達(dá)到較高水平，說明重組腺病毒在細(xì)胞中的表達(dá)具有較好的穩(wěn)定性和持續(xù)性，能夠持續(xù)表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白，為后續(xù)研究其免疫原性提供了充足的抗原來源?！敬颂幉迦雸D11：重組腺病毒感染293細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白含量的ELISA檢測(cè)結(jié)果】3.5重組腺病毒的免疫原性分析3.5.1體液免疫應(yīng)答結(jié)果通過間接ELISA方法檢測(cè)免疫小鼠血清中針對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體水平，結(jié)果如圖12所示。實(shí)驗(yàn)組小鼠在首免后第7天，血清中即可檢測(cè)到特異性IgG抗體，抗體效價(jià)較低，為1:100左右。隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗體效價(jià)逐漸升高，在二免后第7天（即首免后第21天），抗體效價(jià)達(dá)到1:800左右，相較于首免后第7天有顯著提高（P<0.05）。此后，抗體效價(jià)繼續(xù)上升，在二免后第14天（首免后第28天）達(dá)到峰值，為1:1600左右，與二免后第7天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨后，抗體效價(jià)雖有所下降，但在二免后第28天（首免后第42天）仍維持在較高水平，為1:1200左右?！敬颂幉迦雸D12：免疫小鼠血清中特異性IgG抗體效價(jià)隨時(shí)間變化曲線】對(duì)照組1接種空腺病毒載體，在整個(gè)免疫過程中，血清中特異性IgG抗體效價(jià)始終維持在較低水平，與實(shí)驗(yàn)組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對(duì)照組2接種PBS，血清中幾乎檢測(cè)不到特異性IgG抗體，抗體效價(jià)與陰性對(duì)照相當(dāng)。這表明重組腺病毒能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生針對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性IgG抗體，且抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加和免疫時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，具有良好的體液免疫應(yīng)答效果。進(jìn)一步檢測(cè)血清中IgM抗體水平，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠在首免后第7天，血清中IgM抗體水平迅速升高，達(dá)到一定水平。但隨著免疫時(shí)間的推移，IgM抗體水平逐漸下降，在二免后，IgM抗體水平雖有短暫上升，但總體仍呈下降趨勢(shì)。這符合IgM抗體在免疫應(yīng)答初期快速產(chǎn)生，隨后逐漸被IgG抗體替代的特點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了重組腺病毒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生正常的體液免疫應(yīng)答過程。3.5.2細(xì)胞免疫應(yīng)答結(jié)果采用ELISPOT方法檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞中分泌細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-4等）的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如圖13所示。在IFN-γ檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量在二免后顯著增加。二免后第28天，實(shí)驗(yàn)組每10^6個(gè)脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量為[X]個(gè)，而對(duì)照組1接種空腺病毒載體，分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量為[X1]個(gè)，對(duì)照組2接種PBS，分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量為[X2]個(gè)，實(shí)驗(yàn)組與兩個(gè)對(duì)照組相比，差異均具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。IFN-γ是一種重要的Th1型細(xì)胞因子，其分泌細(xì)胞數(shù)量的增加表明重組腺病毒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能?！敬颂幉迦雸D13：免疫小鼠脾細(xì)胞中分泌IFN-γ和IL-4的細(xì)胞數(shù)量的ELISPOT檢測(cè)結(jié)果】在IL-4檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞分泌IL-4的細(xì)胞數(shù)量也有所增加，但相較于IFN-γ，增加幅度較小。二免后第28天，實(shí)驗(yàn)組每10^6個(gè)脾細(xì)胞中分泌IL-4的細(xì)胞數(shù)量為[Y]個(gè)，對(duì)照組1為[Y1]個(gè)，對(duì)照組2為[Y2]個(gè)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組1、2相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IL-4是Th2型細(xì)胞因子，其分泌細(xì)胞數(shù)量的增加說明重組腺病毒在誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答的同時(shí)，也能一定程度上激活Th2型免疫應(yīng)答，使機(jī)體的免疫應(yīng)答更加全面。采用流式細(xì)胞術(shù)分析免疫小鼠脾細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞（如CD4?T細(xì)胞、CD8?T細(xì)胞）的增殖情況，結(jié)果如圖14所示。二免后第28天，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞中CD4?T細(xì)胞的比例為[Z1]%，顯著高于對(duì)照組1的[Z2]%和對(duì)照組2的[Z3]%，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD8?T細(xì)胞的比例為[W1]%，同樣顯著高于對(duì)照組1的[W2]%和對(duì)照組2的[W3]%，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明重組腺病毒能夠有效促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答能力。同時(shí)，通過檢測(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例評(píng)估T淋巴細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組T淋巴細(xì)胞的增殖活性明顯高于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了重組腺病毒對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用?！敬颂幉迦雸D14：免疫小鼠脾細(xì)胞中CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞比例的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果】四、討論4.1重組腺病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)重組腺病毒表達(dá)系統(tǒng)在本研究中展現(xiàn)出了諸多顯著優(yōu)勢(shì)。從安全性角度來看，選用的復(fù)制缺陷型腺病毒極大地降低了潛在風(fēng)險(xiǎn)。由于缺失關(guān)鍵的復(fù)制基因，如E1區(qū)缺失的腺病毒，其在正常細(xì)胞中無法自主復(fù)制，從而避免了病毒在宿主體內(nèi)大量增殖引發(fā)的潛在致病性和毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)。這一特性使得重組腺病毒疫苗在應(yīng)用時(shí)更加安全可靠，降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和未來臨床應(yīng)用對(duì)象的健康威脅。例如，在一些臨床前研究中，使用復(fù)制缺陷型腺病毒載體表達(dá)腫瘤抗原，用于腫瘤疫苗的研發(fā)，結(jié)果顯示其在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)的同時(shí)，并未引起明顯的不良反應(yīng)。在基因傳遞和表達(dá)方面，腺病毒載體表現(xiàn)出色。其具有廣泛的宿主范圍，幾乎能夠感染包括人類和多種動(dòng)物在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞類型。這使得針對(duì)不同物種的疫苗研發(fā)成為可能，無需針對(duì)不同宿主專門設(shè)計(jì)載體。在本研究中，能夠順利將重組腺病毒轉(zhuǎn)染到人胚腎293細(xì)胞中進(jìn)行包裝和擴(kuò)增，也證明了其宿主范圍的廣泛性。而且，重組腺病毒能夠高效地將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并實(shí)現(xiàn)高水平的表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，通過westernblot和ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組腺病毒在293細(xì)胞中能夠成功表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白，且表達(dá)水平隨著時(shí)間的推移逐漸升高，在感染72h時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定且較高的表達(dá)狀態(tài)。這一高效表達(dá)特性為后續(xù)研究重組腺病毒的免疫原性提供了充足的抗原來源，確保了免疫實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。然而，在構(gòu)建和表達(dá)重組腺病毒的過程中也遇到了一些挑戰(zhàn)。在重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，同源重組效率是一個(gè)關(guān)鍵問題。將線性化的重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組時(shí)，重組成功率并非100%。這可能是由于多種因素導(dǎo)致的，如質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度、轉(zhuǎn)化條件（包括溫度、時(shí)間、感受態(tài)細(xì)胞的活性等）以及重組過程中的隨機(jī)性。為了提高同源重組效率，本研究采取了一系列優(yōu)化措施。在質(zhì)粒提取過程中，嚴(yán)格控制操作條件，確保提取的質(zhì)粒純度高、完整性好。優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，對(duì)轉(zhuǎn)化溫度、時(shí)間以及感受態(tài)細(xì)胞的制備方法進(jìn)行多次摸索和調(diào)整。最終通過這些優(yōu)化措施，成功提高了同源重組效率，獲得了足夠數(shù)量的重組腺病毒質(zhì)粒。重組腺病毒在細(xì)胞中的表達(dá)穩(wěn)定性也是需要關(guān)注的問題。雖然本研究中重組腺病毒在293細(xì)胞中的表達(dá)總體較為穩(wěn)定，但在長(zhǎng)期培養(yǎng)或傳代過程中，仍有可能出現(xiàn)表達(dá)水平下降或表達(dá)不穩(wěn)定的情況。這可能與病毒自身的遺傳穩(wěn)定性、細(xì)胞環(huán)境以及培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。為了確保重組腺病毒表達(dá)的穩(wěn)定性，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，保持細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性，包括培養(yǎng)基的成分、溫度、CO?濃度等。定期對(duì)重組腺病毒進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并解決表達(dá)異常的問題。通過這些措施，有效地保證了重組腺病毒在細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了保障。4.2重組腺病毒免疫原性的影響因素目的基因的特性對(duì)重組腺病毒的免疫原性起著至關(guān)重要的作用。FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因作為本研究中的目的基因，其抗原性的強(qiáng)弱直接影響重組腺病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力。FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3含有多個(gè)抗原決定簇，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。然而，不同血清型的FMDV結(jié)構(gòu)蛋白在氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)上存在差異，這些差異可能導(dǎo)致其抗原性的不同。例如，O型FMDV的VP1蛋白與A型FMDV的VP1蛋白在某些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)上存在差異，這些差異可能影響VP1蛋白與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，進(jìn)而影響重組腺病毒的免疫原性。此外，目的基因的表達(dá)水平也會(huì)影響免疫原性。在本研究中，通過優(yōu)化重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染條件，使FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因在293細(xì)胞中獲得了較高水平的表達(dá)。較高的表達(dá)水平意味著更多的抗原被呈遞給免疫系統(tǒng)，從而增強(qiáng)了免疫原性。但如果目的基因表達(dá)水平過高，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)過重，影響細(xì)胞的正常功能，甚至引起細(xì)胞凋亡，反而不利于免疫原性的提高。因此，需要在表達(dá)水平和細(xì)胞生理狀態(tài)之間找到一個(gè)平衡點(diǎn)，以獲得最佳的免疫原性。腺病毒載體本身的特性也會(huì)對(duì)免疫原性產(chǎn)生顯著影響。不同血清型的腺病毒載體在感染效率、免疫激活能力等方面存在差異。在本研究中，選用的腺病毒載體為常用的血清型，具有良好的感染效率和基因傳遞能力。然而，一些研究表明，某些血清型的腺病毒載體可能會(huì)引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)載體本身產(chǎn)生免疫記憶，從而影響后續(xù)的免疫效果。例如，人腺病毒5型（Ad5）載體在多次免疫后，機(jī)體可能會(huì)產(chǎn)生針對(duì)Ad5載體的中和抗體，降低重組腺病毒的感染效率和免疫原性。為了克服這一問題，研究人員嘗試開發(fā)新型的腺病毒載體，如使用罕見血清型的腺病毒或?qū)ο俨《据d體進(jìn)行改造，以降低載體的免疫原性，提高重組腺病毒疫苗的效果。腺病毒載體的劑量也會(huì)影響免疫原性。在一定范圍內(nèi)，增加腺病毒載體的劑量可以提高目的基因的傳遞效率和表達(dá)水平，從而增強(qiáng)免疫原性。但過高的載體劑量可能會(huì)引發(fā)過度的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或臨床對(duì)象的具體情況，優(yōu)化腺病毒載體的劑量，以達(dá)到最佳的免疫效果和安全性。免疫途徑的選擇對(duì)重組腺病毒的免疫原性有著重要影響。在本研究中，采用肌肉注射的方式接種重組腺病毒，這種途徑能夠使重組腺病毒直接進(jìn)入肌肉組織，肌肉組織中含有豐富的免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，這些細(xì)胞能夠攝取重組腺病毒，并將其攜帶的抗原信息呈遞給T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。然而，不同的免疫途徑可能會(huì)導(dǎo)致不同的免疫應(yīng)答模式。除了肌肉注射，滴鼻、口服等免疫途徑也被廣泛研究。滴鼻免疫途徑可以使重組腺病毒直接接觸呼吸道黏膜表面的免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答。黏膜免疫在抵御病原體的入侵中起著重要的作用，能夠在呼吸道黏膜表面形成一道免疫屏障，阻止病原體的感染。但滴鼻免疫可能會(huì)受到鼻腔黏膜的生理環(huán)境和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的影響，導(dǎo)致免疫效果的不穩(wěn)定?？诜庖咄緩骄哂胁僮骱?jiǎn)便、易于接受等優(yōu)點(diǎn)，但重組腺病毒在胃腸道中可能會(huì)受到胃酸、消化酶等的破壞，降低其感染效率和免疫原性。因此，選擇合適的免疫途徑需要綜合考慮重組腺病毒的特性、免疫應(yīng)答的類型以及實(shí)際應(yīng)用的可行性等因素。佐劑的使用可以顯著增強(qiáng)重組腺病毒的免疫原性。佐劑是一類能夠增強(qiáng)抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)，其作用機(jī)制主要包括增強(qiáng)抗原的攝取和呈遞、激活免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答類型等。在本研究中，雖然未使用佐劑，但已有研究表明，多種佐劑可用于增強(qiáng)重組腺病毒疫苗的免疫效果。氫氧化鋁是一種常用的佐劑，它能夠吸附抗原，形成抗原-佐劑復(fù)合物，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存在時(shí)間，增強(qiáng)抗原的攝取和呈遞。研究發(fā)現(xiàn)，將氫氧化鋁與重組腺病毒聯(lián)合使用，能夠顯著提高小鼠血清中針對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體水平。CpG寡核苷酸作為一種免疫刺激劑，能夠激活Toll樣受體9（TLR9），誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性。將CpG寡核苷酸與重組腺病毒聯(lián)合應(yīng)用，可促進(jìn)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。油包水乳液、水包油乳液等新型佐劑也在疫苗研究中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。這些佐劑能夠改變抗原的物理狀態(tài)，促進(jìn)抗原的緩慢釋放，同時(shí)激活免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞，提高免疫原性。在選擇佐劑時(shí)，需要考慮佐劑的安全性、有效性以及與重組腺病毒的兼容性等因素，以確保佐劑能夠在增強(qiáng)免疫原性的同時(shí)，不引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。4.3研究結(jié)果的應(yīng)用前景與意義本研究成功構(gòu)建并鑒定了能夠表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的重組腺病毒，并深入分析了其免疫原性，這些研究結(jié)果對(duì)于FMD新型疫苗的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義和廣闊的應(yīng)用前景。在指導(dǎo)意義方面，本研究為FMD新型疫苗的研發(fā)提供了關(guān)鍵的技術(shù)路線和理論依據(jù)。通過對(duì)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因的獲取、重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建以及重組腺病毒的包裝與鑒定等一系列技術(shù)的探索和優(yōu)化，建立了一套完整的重組腺病毒疫苗構(gòu)建技術(shù)體系。這一技術(shù)體系可以為后續(xù)不同血清型FMDV重組腺病毒疫苗的研發(fā)提供參考和借鑒，加速新型疫苗的研發(fā)進(jìn)程。而且，對(duì)重組腺病毒免疫原性的研究，明確了重組腺病毒能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生體