(19)國家知識產(chǎn)權局(12)發(fā)明專利(10)授權公告號CN114839367B(65)同一申請的已公布的文獻號片區(qū)1076號鄭雙慶李艷梅(74)專利代理機構北京金杉知識產(chǎn)權代理有限公司16291A61K39/385(2006.01)(54)發(fā)明名稱一種大麻素單克隆抗體的制備及其應用本發(fā)明公開了一種大麻素單克隆抗體的制備及其應用，屬于生物技術領域。大麻素單克隆抗體的制備具體步驟包括：(1)半抗原制備：將大麻素分子與4-氯苯甲酸甲酯反應即得半抗原；(2)完全抗原制備：將半抗原與血藍蛋白偶聯(lián)即得完全抗原。本發(fā)明通過制備出四氫大麻酚、大麻萜酚或大麻二酚的完全抗原，進一步制備對應的單克隆抗體，再將制得的單克隆抗體用于制備膠體金檢測試紙。制得的膠體金試紙?zhí)禺愋詮姡?1.一種式Ⅱ所示大麻素半抗原，2.一種式V所示大麻素完全抗原，3.一種制備權利要求2所述大麻素完全抗原的方法，其特征在于，包括如下步驟：20份DMF攪拌溶解，再加入2-3份4-氯苯甲酸甲酯升溫至65-80℃攪拌反應2-5h;反應后加15-20份水并使用乙酸乙酯進行萃取；收集有機相并濃縮干燥后加15-20份20%-30%的LiOH溶液，室溫下進行水解反應2-5h;之后使用乙酸乙酯萃取，收集有機相并調(diào)節(jié)pH至5-6,抽濾、干燥即得權利要求1所述的大麻素半抗原；(2)完全抗原制備：將半抗原與血藍蛋白偶聯(lián)即得權利要求2所述大麻素完全抗原；所述大麻素分子選自大麻二酚。4.權利要求1所述的半抗原在制備大麻素單克隆抗體中的用途。5.權利要求2所述的完全抗原在制備大麻素單克隆抗體中的用途。3一種大麻素單克隆抗體的制備及其應用技術領域[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種大麻素單克隆抗體的制備及其應用。背景技術[0002]大麻是一種古老的具有藥用開發(fā)價值的栽種植物，大麻素是從大麻植物中提取的氫大麻酚酸等。[0004]CBG是一種不具有精神活性的大麻素，研究表明CBG在保護大腦神經(jīng)細胞方面非常活躍。2015年西班牙馬德里康普頓斯大學生物化學與分子生物學系的研究人員發(fā)現(xiàn)CBG具有神經(jīng)保護特性。CBG可改善運動缺陷并保留神經(jīng)元，提高了抗氧化防御水平，對多發(fā)性硬化癥、亨廷頓舞蹈癥等神經(jīng)退行性疾病有著積極的影響。[0005]THC是大麻中的主要精神活性物質(zhì)，被列入第一類精神藥品品種目錄管制。由于THC會威脅人類健康。而CBG、CBD則具備有益的藥理作用，對大麻植物多種成分的快速檢測是區(qū)別優(yōu)質(zhì)工業(yè)大麻和毒品大麻的關鍵技術，對THC的快速檢測可以滿足毒品檢測的需要。[0006]檢測樣品中是否含有CBD、CBG或THC常用的初篩方法有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、膠體金免疫層析技術(GICA)等。確認方法主要用高壓液相色譜法(HPLC)、氣相色專業(yè)技術人員操作，費用昂貴。放射免疫分析法靈敏度和特異性高，但儀器昂貴，因而無法實現(xiàn)普及應用。酶聯(lián)免疫分析法在靈敏度和特異性方面保留有放射免疫分析法的優(yōu)點，但操作復雜、耗時，必需專業(yè)技術人員操作。膠體金免疫層析法由于其具有簡便快捷、結果明確、無需復雜操作技巧和特殊設備、靈敏度和特異性較高等優(yōu)點，非常適合對大批量樣品進行現(xiàn)場篩查工作，已成為臨床診斷領域發(fā)展的一個新方向。[0007]本領域迫切需要研發(fā)一種簡便快速、準確可靠、靈敏、價格便宜適用于農(nóng)業(yè)種植檢測、工業(yè)大麻產(chǎn)品檢測和大麻毒品檢測檢驗方法。中國專利CN101580544A公開了一種膠體金標記大麻、四氫大麻酚單抗免疫檢測板，其優(yōu)點在于能夠快速、簡易、靈敏地檢測四氫大麻酚，但該專利未對其他大麻素分子做進一步研究和試驗。發(fā)明內(nèi)容[0008]本發(fā)明的第一個目的在于提供一種大麻素完全抗原及其制備方法，為達到該發(fā)明[0009]一種式I或式Ⅱ或式Ⅲ所示大麻素半抗原，4[0011]一種式IV或式V或式VI所示大麻素完全抗原，[0013]一種上述大麻素完全抗原的方法，其特征在于，包[0014](1)半抗原制備：將大麻素分子與4-氯苯甲酸甲酯反[0015](2)完全抗原制備：將半抗原與血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)即得完全抗原。[0016]大麻素分子的免疫原性較弱，將大麻素分子與載體蛋白偶聯(lián)后能夠形成較免疫原需要在偶聯(lián)載體蛋白之前進行衍生化處理制成半抗原，引入活性羧基。[0018]將大麻素分子、催化劑加入DMF攪拌溶解，再加入4-氯苯甲酸甲酯升溫攪拌反應；反應后加LiOH溶液進行水解反應；之后使用乙酸乙酯萃取，收集有機相抽濾、干燥即得半抗原。[0019]更優(yōu)選地，大麻素分子選自四氫大麻酚(THC)、大麻萜酚(CBG)或大麻二酚(CBD)。[0022]更優(yōu)選地，4-氯苯甲酸甲酯與大麻素分子的重量比為2-3:4-8。5[0023]更優(yōu)選地，4-氯苯甲酸甲酯與大麻素分子的反應溫度為65-80℃。[0024]更優(yōu)選地，4-氯苯甲酸甲酯與大麻素分子的反應時間為2-5h。[0025]更優(yōu)選地，LiOH的濃度為20-30wt%。[0026]更優(yōu)選地，水解反應的時間為2-5h。[0027]更優(yōu)選地，水解反應溫度為室溫。[0028]更進一步優(yōu)選地，步驟(1)半抗原的具體操作步驟包括：[0029]按重量份計，將4-8份大麻素分子、5-10份三乙胺、6-8份DMAP和1-2份NAOH加入15-20份DMF攪拌溶解，再加入2-3份4-氯苯甲酸甲酯升溫至65-80℃攪拌反應2-5h;反應后加15-20份水并使用乙酸乙酯進行萃取；收集有機相并濃縮干燥后加15-20份20%-30%的LiOH溶液，室溫下進行水解反應2-5h;之后使用乙酸乙酯萃取，收集有機相并調(diào)節(jié)pH至5-6,抽濾、干燥即得半抗原。[0030]優(yōu)選地，步驟(2)完全抗原制備的具體操作步驟包括：[0031]將血藍蛋白溶于緩沖液中制得血藍蛋白溶液；將半抗原溶于DMF中，并加入EDC和NHS;將半抗原溶液逐滴加入血藍蛋白溶液，滴加完畢后攪拌反應；反應后透析即得完全抗[0032]更優(yōu)選地，緩沖液為CBS緩沖液，pH9.5-9.8,濃度0.05-0.1M。[0033]更優(yōu)選地，血藍蛋白與緩沖液的重量比為2-8:15-30。[0034]更優(yōu)選地，血藍蛋白與半抗原的重量比為2-8:1-2。[0036]更優(yōu)選地，反應溫度為室溫。[0037]更優(yōu)選地，反應時間為10-15h。[0038]更優(yōu)選地，透析體系為PBS緩沖液，pH9-10,濃度0.1-0.5M。[0039]更進一步優(yōu)選地，步驟(2)完全抗原制備的具體操作步驟包括：[0040]按重量份計，將2-8份血藍蛋白溶于20-30份CBS緩沖液(pH9.5-9.8,濃度0.05-0.1M)中；將1-2份半抗原溶于80-100份DMF中，并加入2-3份EDC和1-2份NHS;將半抗原溶液逐滴加入血藍蛋白溶液，滴加完畢后室溫攪拌反應10-15h;反應后使用PBS緩沖液(pH9-10,濃度0.1-0.5M)透析即得完全抗原。[0041]上述制備完全抗原的方法僅為優(yōu)選制備方法，本發(fā)明完全抗原的制備中，可使用任何本領域已知的現(xiàn)有技術進行連接。[0042]優(yōu)選地，一種大麻素單克隆抗體的制備方法，制備步驟還包括：[0043]血清效價檢測及篩選；雜交瘤細胞制備；雜交瘤細胞篩選；動物體內(nèi)誘生；抗體純[0044]本發(fā)明還公開了上述制備方法制得的大麻素單克隆抗體。[0045]本發(fā)明的第二個目的在于提供一種膠體金試紙，能夠準確、快速、靈敏地檢測樣品[0046]一種膠體金試紙，含有大麻素單克隆抗體。[0047]優(yōu)選地，大麻素包括THC、CBD或CBG?，F(xiàn)有技術中的膠體金試紙大多用于檢測THC,本發(fā)明制備的膠體金試紙能夠同時檢測THC、CBD或CBG中的一種或幾種，檢測范圍更廣，有利于提高檢測的準確度。6[0049](1)納米金標記抗體：將納米金溶液與抗體混合振蕩，加入封閉液封閉后離心，重懸后即得抗體懸液；[0050](2)檢測線制備：將抗體懸液涂布于硝酸纖維膜靠近樣品墊的一端，即得檢測線；[0051](3)質(zhì)控線制備：將羊抗鼠抗體涂布于硝酸纖維膜靠近吸水墊的一端，即得質(zhì)控[0052](4)試紙組裝：將樣品墊、吸水墊貼、底板、將硝酸纖維膜組裝完成即得膠體金試[0053]更優(yōu)選地，(4)試紙組裝包括：將樣品墊和吸水墊貼在底板兩端，將硝酸纖維膜貼在底板中間并與樣品墊和吸水墊有重疊，組裝完成即得膠體金試紙。[0054]更優(yōu)選地，抗體溶液中抗體濃度為0.2-0.5mg/mL。時檢測2種或3種時，可以增加檢測的準確性。[0057]將納米金溶液、抗體、雙甘肽和乙醇胺鹽酸鹽混合振蕩，加入封閉液封閉后離心，重懸后即得抗體懸液。[0058]雙甘肽和乙醇胺鹽酸鹽的加入不會對試紙的檢測功能造成負面影響，反之，還能夠增加膠體金和抗體的穩(wěn)定性，使其能夠耐受更高的溫度。有利于避免因高溫導致試紙失[0059]優(yōu)選地，雙甘肽與乙醇胺鹽酸鹽的重量比為1-3:0.3-0.8。[0060]本發(fā)明還公開了上述完全抗原在制備大麻素單克隆抗體中的用途。[0061]本發(fā)明還公開了上述雙甘肽和乙醇胺鹽酸鹽在膠體金試紙耐高溫中的用途。[0062]本發(fā)明還公開了上述膠體金試紙在檢測樣品中是否含有大麻素分子中的用途。[0063]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：抗體，再將制得的單克隆抗體用于制備膠體金檢測試紙，制得的膠體金試紙?zhí)禺愋詮?，能?0ng/mL;并且，本發(fā)明膠體金試紙能夠在90s以內(nèi)獲得檢測結果，檢測速度快。本發(fā)明制備膠體金試紙時，納米金標記抗體所制得的抗體懸液中，還添加有雙甘肽和乙醇胺鹽酸鹽，將納米金溶液、雙甘肽和乙醇胺鹽酸鹽共同使用時，能夠增加膠體金試紙的耐高溫性，在70℃儲存5-10d后仍能夠準確檢測。附圖說明[0065]圖1為膠體金試紙組裝順序。具體實施方式[0066]這里將詳細地對示例性實施例進行說明，以下示例性實施例中所描述的實施方式并不代表與本公開相一致的所有實施方式。相反，它們僅是與如所附權利要求書中所詳述7再加入300mg4-氯苯甲酸甲酯升溫至75℃攪拌反應3h;反應后進行萃取，收集有機相并濃縮干燥后加2000mg25%的LiOH溶液，室溫下進行水解反應(400MHz,DMSO)δ:9.94(s,1H),8.19(d,2H),7.38(d,2H),6.70(s,1H),6.65(s,1H),5.82(d,1H),5.40(s,1H),5.29(m,1H),3.25(d,2H),2.67(m,2H6H),1.72(s,3H),1.62(m,2H),1.30-1.32(m,4H,CH?),0.95(m,3H).[0076]將5mg血藍蛋白溶于25mgCBS緩沖液中(pH9.6,濃度抗原溶液逐滴加入血藍蛋白溶液中，滴加完畢后室溫攪拌反應10h;反應后使用PBS緩沖液8.19(d,2H),7.38(d,2H),6.74(s,1H),6.69(s,1H),5.40(s,1H),5.35(m,1H),5.14(m,1H),4.95(m,1H),3.25(d,1H),2.75(d,1H),2.67(m,2H),2.06(m,1H),2.00(m,1H),1.85(81.79(m,1H),1.58(m,2H),1.52(m,1H),1.30-1.32(m,4H[0087]制備方法同CBG半抗原的制備，制得式III所示THC半抗原。采用核磁共振儀對式III所示THC半抗原進行核磁結構表征，核磁鑒定結果為：'HNMR(400MHz,DMSO)δ:9.86(s,1H),8.23(d,2H),7.44(d,2H),6.81(s,2H),5.42(d,1H),1H),1.93-1.99(t,2H),1.85(s,3H),1.79(t,1H),1.6[0090]制備方法同CBG完全抗原的制備，最終制得式VI所示THC-KLH。[0092]實施例2[0093]單克隆抗體的制備9的重量比為1:1;按皮下注射50μg/只的劑量進行免疫，每3周加強免疫一次，加強免疫時劑[0097](2)小鼠血清效價檢測及篩選[0098]包板：用PBS包被液(pH7.4)將抗原D-BSA稀釋成1μg/mL濃度，混勻后加入96孔板[0100]一抗：抗血清按1:500開始進行不同倍數(shù)的稀釋，每孔100μL;對照為0.01M的PBS;37℃恒溫箱1h;山羊抗鼠-HRP;37℃恒溫箱1h;大于設定的陰性對照OD值的2.1倍的孔對應的稀釋度，定為該樣品的效價；[0104]檢測結果如表1所示；[0105]表13免后7天CBG單克隆抗體效價檢測樣品對照12345678[0107]根據(jù)表1可知，1號小鼠的血清抗體效價最優(yōu)，最優(yōu)效價為1:13500;因此選擇1號小鼠進行后續(xù)實驗。[0109]復蘇SP2/0骨髓瘤細胞；斷頸處死1號小鼠取出脾臟制成脾細胞懸液；將骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞實驗PEG法誘導細胞融合；誘導融合后使用HAT培養(yǎng)基在96孔板中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃,5%CO?;第三天進行半換液培養(yǎng)，第六天進行全換液培養(yǎng)。[0111]培養(yǎng)第7天，按照“小鼠血清效價檢效價高的雜交瘤細胞保存?zhèn)溆谩0112](5)動物體內(nèi)誘生[0113]選擇BALB/c小鼠，腹腔注射1mL滅菌石蠟油，正常飼養(yǎng)7d;將篩選出的雜交瘤細胞按照10?個/只的劑量注射入小鼠腹腔；7d后小鼠明顯產(chǎn)生腹水，抽取腹水，8000r/min離心12min后取上清保存?zhèn)溆?。[0114](6)抗體純化[0115]使用飽和硫酸銨鹽析沉淀法純化抗體，純化后測定抗體濃度，保存?zhèn)溆?。[0117]制備方法同CBG單克隆抗體的制備。[0119]制備方法同CBG單克隆抗體的制備。[0120]實施例3[0121]膠體金試紙的制備[0122](1)納米金標記抗體：將100mL納米金溶液pH值調(diào)節(jié)至9后，與5mL0.3mg/mL的CBG單克隆抗體溶液、CBD單克隆抗體溶液或THC單克隆抗體溶液混合振蕩30min,加入50mL5%的BSA溶液封閉后離心，去上清，加入10mL20mMPBS溶液重懸后即得抗體懸液；[0123](2)檢測線制備：將抗體懸液涂布于硝酸纖維膜靠近樣品墊的一端，即得檢測線；[0124](3)質(zhì)控線制備：將0.4mg/mL的羊抗鼠抗體涂布于硝酸纖維膜靠近吸水墊的一端，即得質(zhì)控線。[0125](4)試紙組裝：將樣品墊和吸水墊貼在底板兩端，將硝酸纖維膜貼在底板中間并與樣品墊和吸水墊有重疊，組裝完成即得膠體金試紙；[0126]根據(jù)抗體的種類和數(shù)量的不同，分別按照上述方法制得：[0127]單檢測線試紙(如圖1所示):CBG膠體金試紙、CBD膠體金試紙、THC膠體金試紙；[0128]雙檢測線試紙：CBG-CBD膠體金試紙、CBG-THC膠體金試紙、CBD-THC膠體金試紙；[0132](1)納米金標記抗體：將100mL納米金溶液pH值調(diào)節(jié)至9后，加入1g雙甘肽與0.5g乙醇胺鹽酸鹽，混勻后再與5mL0.3mg/mL的CBG單克隆抗體溶液、CBD單克隆抗體溶液或THC單克隆抗體溶液混合振蕩30min,加入50mL5%的BSA溶液封閉后離心，去上清，加入10mL20mMPBS溶液重懸后即得抗體懸液；[0133](2)檢測線制備：同實施例3;[0134](3)質(zhì)控線制備：同實施例3;[0135](4)試紙組裝：同實施例3;[0136]根據(jù)抗體的種類和數(shù)量的不同，分別按照上述方法制得：[0140]試驗例1[0141]單克隆抗體的檢測[0142]1、完全抗原偶聯(lián)比測定[0143]使用紫外分光光度法對偶聯(lián)后的完全抗原進行掃描，按照吸光度的加和性原理計112中“小鼠血清效價檢測及篩選”;之后進行封閉，封閉方法同實及篩選”;取實施例2中制得的單克隆抗體使用緩沖液稀釋至5μg/mL;將實施例1中制得的選”;測定OD值后計算單克隆抗體的親和常數(shù)K:[0149]經(jīng)測定，實施例2中制得的CBG單克隆抗體的親和常數(shù)為5.74×101?m?1,CBD單克隆抗體的親和常數(shù)為5.47×101?m1,THC單克隆抗體的親和常數(shù)為5.59×101?M1;測得的親和力常數(shù)滿足制備膠體金試紙的需求。[0151]使用實施例2中“小鼠血清效價檢測及篩選”中的檢測方法測定CBG單克隆抗體、[0152]交叉反應率(%)=(目標物質(zhì)IC50值/其他物質(zhì)IC50值)×100%;[0153]測定結果如表3所示。[0154]表3實施例2中單克隆抗體的交叉反應率實施例2CBD單抗THC單抗CBG單抗/CBD單抗/THC單抗/[0157]試驗例2[0158]膠體金試紙檢測CBD和THC溶液作為標準液，使用實施例3和4中的單檢測線膠體金試紙進行檢測；用膠頭滴管吸取標準液，滴3滴在樣品墊上，滴加后靜置觀察；檢測線和質(zhì)控線同時顯色，判定為陽定為膠體金試紙失效；對陽性樣品，同時記[0161]實施例3檢測結果如表4所示，實施例4檢測結果與實施例3結果類似，為避免冗余，在此不做展示。[0162]表4實施例3膠體金試紙靈敏度檢測結果[0163]標準液濃度(ng/mL)CBG膠體金試紙CBD膠體金試紙THC膠體金試紙陽性，65s陽性，62s陽性，63s陽性，63s陽性，62s陽性，65s陽性，64s陽性，65s陽性，64s陽性，68s陽性，67s陽性，66s陽性，69s陽性，71s陽性，74s陽性，75s陽性，77s陽性，76s陽性，77s陽性，77s陽性，80s陽性，81s陽性，80s陽性，84s5陰性陰性陰性4陰性陰性陰性3陰性陰性陰性2陰性陰性陰性1陰性陰性陰性為10ng/mL,靈敏度高；此外，所有陽性樣品均能夠在85s內(nèi)得出檢測結果，檢測時間短。[0165]2、特異性檢測用實施例4中的膠體金試紙進行檢測；用膠頭滴管吸取標準液，滴3滴在樣品墊上，滴加后靜置觀察；檢測線和質(zhì)控線同時顯色，判定為陽性；檢測線不顯色，質(zhì)控線顯色，