DB65/T4714—2023實驗動物先天性白內(nèi)障小鼠全流程管理技術規(guī)范Laboratoryanimal——Technicalspecificationfor2024-04-10實施2024-04-10實施I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心提出。本文件由新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會歸口并組織實施。本文件起草單位：新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心、天康生物制藥有限公司、新疆維吾爾自治區(qū)標準化研究院。本文件主要起草人：安冉、張燕、袁江玲、艾山江·哈德爾、陳欣如、雒濤、趙國玉、艾山·艾比布勒、史深、卡迪麗亞·賽都拉、艾爾肯·塔西鐵木爾、蔣健、徐佳麗、張段段、李麗、胡小明、文紅梅、石佳瑋、曹劍。本文件實施應用中的疑問，請咨詢新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心。對本文件的修改意見及建議，請反饋至新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(烏魯木齊市龍泉街191號)、新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心(烏魯木齊市堿泉一街380號)、新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局(烏魯木齊市新華南路167號)。新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心聯(lián)系電話傳真郵編：830002新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會聯(lián)系電話傳真郵編：830001新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局聯(lián)系電話傳真郵編：83000412規(guī)范性引用文件僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB14922實驗動物微生物、寄生蟲學等級及監(jiān)測GB/Z34792實驗動物引種技術規(guī)程殖。2全流程管理技術wholeprocessmanageme4.1人員、設施、繁殖與生產(chǎn)、使用、福利倫理等應按GB/T34791要求執(zhí)行。4.2飼料的營養(yǎng)成分及衛(wèi)生指標應符合GB14924的要求，墊料和飲水應符合GB14925的要求。5.1.1引種基本流程宜按照GB/Z34792規(guī)定執(zhí)行。5.1.2應放入規(guī)定的隔離檢疫室或隔離器中，隔離觀察2d后，無異常情況的轉(zhuǎn)入動物實驗室。如有5.1.3核心群引種應按照GB14923要5.2.1日常飼養(yǎng)應根據(jù)地區(qū)、季節(jié)、設施設備條件的不同制定切實可行的管理操作規(guī)程。5.3.2封閉群動物遺傳質(zhì)量監(jiān)測按照GB14923規(guī)定執(zhí)行。5.3.3產(chǎn)仔數(shù)較少的核心群宜采用祖父子三世代五a)長期同居法：將1只雄鼠與1只雌鼠同居。在雌鼠分娩后幾小時內(nèi)可再行交配受孕；b)定期同居法：將1只雄鼠與6只雌鼠編為一繁殖單元。確保雄鼠籠內(nèi)有2只～3只雌鼠，同時將受孕雌鼠提出，置單籠分娩、哺乳、離乳，6只雌鼠均受孕為一期。5.4.1選擇2月齡、健康、發(fā)育正常的小鼠為種鼠。5.4.2用于交配的種鼠，應編上個體號碼進行管理；在交配卡上記錄交配日期、產(chǎn)仔數(shù)、斷奶數(shù)等繁育指標；胎次數(shù)一般控制在5胎～6胎，超過胎次數(shù)或繁育性能不良的種鼠淘汰，5.4.3哺育數(shù)一般為5只～8只，產(chǎn)仔數(shù)多于哺育數(shù)時，可淘汰多余的，也可補充同品系產(chǎn)仔數(shù)少的。5.4.5小鼠初生后17d～22d離乳，淘汰畸形、發(fā)育極差、尾卷曲或斷尾的、無鼻毛以及腹瀉等異常3的仔鼠。5.4.6一般從第2胎~4胎中選取生產(chǎn)群繁殖用種用動物，原則上從1窩中選取發(fā)育較好、體格健壯，先天性白內(nèi)障特征明顯的小鼠作為種用動物。選作種用的動物，記錄組、編號、性別、只數(shù)和出生年月5.5微生物、寄生蟲學質(zhì)量控制應按照GB14922中規(guī)定執(zhí)行，監(jiān)測工作應由專業(yè)人員完成。6組織病理學檢查6.1抽樣要求宜選擇4周齡以上先天性白內(nèi)障小鼠用于檢查，隨機抽樣。6.2檢查程序?qū)ο忍煨园變?nèi)障小鼠眼晶狀體進行取樣和檢查，檢查程序見圖1。圖1檢查程序6.3檢查步驟封閉群先天性白內(nèi)障小鼠組織病理學檢查按照以下步驟進行：a)肉眼對小鼠眼晶狀體進行外觀檢查；b)使用裂隙燈對小鼠眼晶狀體進行檢查；4d)白內(nèi)障小鼠眼球大體解剖及取材，摘取白內(nèi)障小鼠眼球投入g)病理組織制片，具體方法按附錄A執(zhí)行。常規(guī)石蠟切片，伊紅-蘇木精染色，必h)閱片及分析，具體方法按附錄B執(zhí)行。由具有病理診斷經(jīng)驗的病理學專業(yè)人員進行。a)具有明確的遺傳背景資料，來源清楚，有完整的資料，包括種群名稱、來源、遺傳基因特點及主要生物學特性等，并能充分表明新培育的或引種的封閉群先天性白內(nèi)障小鼠符合封閉群b)用于保種及生產(chǎn)的繁殖記錄卡應清c)經(jīng)遺傳檢測質(zhì)量合格，遺傳檢測抽樣方法及監(jiān)測頻次按照GB14923要求執(zhí)行。59.3各項資料定期進行整理歸檔，根據(jù)需要確定保存年限。6(規(guī)范性)取材和標本制作A.1光鏡標本制作取正常小鼠和白內(nèi)障小鼠各3只，常規(guī)麻醉后處死，行小鼠雙眼球摘除術，乳酸林格氏液沖洗眼球，將眼球置于眼球固定液中固定一周。A.2光鏡觀察在低倍鏡和高倍鏡下分別觀察晶狀體的前后囊膜和赤道部，同時觀察淺層皮質(zhì)和核心部纖維的排列狀態(tài)，比較兩組之間的形態(tài)學差異。A.3電鏡標本制作和檢查取正常小鼠和白內(nèi)障小鼠各4只，將小鼠常規(guī)麻醉后處死，行小鼠雙眼球摘除術，乳酸林格氏液沖洗眼球，在解剖鏡下從后部剪開鞏膜，完整取出小鼠晶狀體。透射電鏡標本平均切成4塊，掃描電鏡2只為完整晶狀體，另兩只平均切成2塊，立即放入2.5%戊二醛固定液。透射電鏡、掃描電鏡觀察病變情7(規(guī)范性)切片病變的定量觀察B.1切片染色常規(guī)HE染色，切片厚度應≤4μm。B.2切片觀察光鏡下首先區(qū)分是否有病變及病變范圍，然后從臟器一端向另一端進行整體觀察和描述。B.3定量觀察將制作好的切片用切片掃描儀進行全片掃描，電腦分析病灶占位比例。B.4定量積分占比1/10的為小灶病變，積一分。依次類推全晶狀體病變?yōu)闈M分10分。8(規(guī)范性)先天性白內(nèi)障小鼠遺傳檢測方法C.1樣本核酸提取C.1.1在樣本處理區(qū)進行。為防止RNA降解，所用試驗用具及溶液應無RNA酶，操作過程中應佩戴一次性橡膠或乳膠手套。C.1.2采集白內(nèi)障小鼠眼球組織，用RNA抽提試劑盒提取白內(nèi)障小鼠眼球組織的總RNA。C.2.2擴增體系取出相應的RT-PCR試劑、引物探針等，在室溫下融化后，2000g離心5s。按樣品數(shù)量配制反應液，40U/μLRNA酶抑制劑0.5μL,DEPC水6.5μL。充分混合均勻，向每個反應管中各分裝16μL,轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)，最后加入總RNA4μL。C.2.3反應程序RT-PCR反應程序為50℃,反轉(zhuǎn)錄30min。94℃,4