Leptin對(duì)HepG2細(xì)胞BSEP蛋白表達(dá)的調(diào)控及信號(hào)通路機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石（Primaryintrahepaticstone，PIS）作為一種常見的膽道疾病，在我國(guó)和亞洲地區(qū)的發(fā)病率較高。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全明確，目前認(rèn)為與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況、膽道感染、膽道狹窄、膽汁代謝及成分失衡等多種因素密切相關(guān)。臨床研究表明，肝內(nèi)膽管結(jié)石患者的膽汁中，膽汁酸濃度相較于正常對(duì)照組明顯降低，這一現(xiàn)象強(qiáng)烈暗示了膽汁酸在PIS的形成過程中扮演著舉足輕重的角色。膽汁酸不僅在脂肪消化吸收中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還參與了肝臟的代謝調(diào)節(jié)，其代謝失衡與多種肝膽疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相連。膽鹽輸出泵（Bilesaltexportpump，BSEP）作為一種位于肝細(xì)胞膽小管膜上的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，承擔(dān)著將肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸泵入膽小管的關(guān)鍵職責(zé)，是調(diào)控膽道膽汁酸濃度的核心環(huán)節(jié)。BSEP的功能異?；虮磉_(dá)改變，會(huì)直接影響膽汁酸的正常排泄，進(jìn)而導(dǎo)致膽汁酸在肝內(nèi)淤積，增加肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此，深入研究BSEP蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于揭示肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病機(jī)制具有至關(guān)重要的意義。瘦素（Leptin）作為一種由脂肪細(xì)胞分泌的激素，最初被發(fā)現(xiàn)主要參與機(jī)體的能量代謝調(diào)節(jié)，通過作用于下丘腦的受體，調(diào)節(jié)食欲和能量消耗，維持機(jī)體的能量平衡。近年來，越來越多的研究表明，瘦素在體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，涉及多個(gè)生理病理過程。在肝臟代謝方面，瘦素不僅參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，影響肝臟中脂肪的合成與分解，還在肝臟的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。尤為重要的是，瘦素被證實(shí)是腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosinemonophosphate-activatedproteinkinase，AMPK）活化的上游因子之一，通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量代謝和物質(zhì)代謝。AMPK作為細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，在維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量水平降低時(shí)，AMPK被激活，通過一系列下游信號(hào)通路，促進(jìn)分解代謝，抑制合成代謝，以增加ATP的生成和減少ATP的消耗。近年來的研究成果顯示，AMPK可通過多種途徑調(diào)控BSEP蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。在膽汁酸代謝過程中，AMPK的激活能夠促進(jìn)BSEP基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，增強(qiáng)膽汁酸的排泄，維持膽汁酸的穩(wěn)態(tài)。這一調(diào)控機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，為深入理解膽汁酸代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的視角，也為肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病機(jī)制研究開辟了新的方向。鑒于瘦素、AMPK與BSEP在膽汁酸代謝調(diào)控中的密切聯(lián)系，深入探討瘦素對(duì)HepG2細(xì)胞中BSEP蛋白表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路的影響，具有重要的理論和實(shí)踐意義。從理論層面來看，該研究有助于進(jìn)一步揭示肝內(nèi)膽管結(jié)石在代謝途徑方面的發(fā)病機(jī)制，豐富對(duì)膽汁酸代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，為相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究提供重要的理論依據(jù)。從實(shí)踐角度出發(fā)，本研究的成果有望為肝內(nèi)膽管結(jié)石的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療方案，為臨床治療策略的優(yōu)化和創(chuàng)新提供科學(xué)指導(dǎo)，具有廣闊的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在瘦素的研究領(lǐng)域，國(guó)外的研究起步較早，早期研究主要聚焦于瘦素在能量代謝調(diào)節(jié)中的核心作用。通過對(duì)嚙齒動(dòng)物和人類的實(shí)驗(yàn)研究，明確了瘦素由脂肪細(xì)胞分泌，經(jīng)血循環(huán)抵達(dá)下丘腦，與下丘腦的特異性受體結(jié)合，從而調(diào)節(jié)食欲和能量消耗。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)瘦素不僅參與能量代謝，還在免疫調(diào)節(jié)、生殖功能以及心血管系統(tǒng)等方面發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)在瘦素研究方面也取得了顯著進(jìn)展，在肥胖與代謝綜合征的研究中，發(fā)現(xiàn)瘦素抵抗現(xiàn)象與肥胖、胰島素抵抗之間存在緊密聯(lián)系，為肥胖相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的見解。HepG2細(xì)胞作為一種常用的人肝癌細(xì)胞系，在肝臟疾病研究中具有重要地位。國(guó)外研究利用HepG2細(xì)胞深入探究肝臟代謝、藥物代謝以及病毒感染等機(jī)制。在肝臟代謝研究中，通過對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，研究特定基因?qū)Ω闻K代謝途徑的影響，為理解肝臟正常生理功能和病理變化提供了細(xì)胞模型。國(guó)內(nèi)學(xué)者利用HepG2細(xì)胞研究中藥提取物對(duì)肝臟細(xì)胞的保護(hù)作用，以及環(huán)境污染物對(duì)肝臟細(xì)胞的毒性機(jī)制，為肝臟疾病的防治提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。BSEP蛋白的研究在國(guó)內(nèi)外均受到廣泛關(guān)注。國(guó)外研究明確了BSEP蛋白在肝細(xì)胞膽小管膜上的定位和其作為膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的關(guān)鍵功能，揭示了BSEP基因的結(jié)構(gòu)和調(diào)控元件，為研究BSEP蛋白表達(dá)調(diào)控提供了基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)研究主要集中在BSEP蛋白表達(dá)異常與肝膽疾病的相關(guān)性方面，通過臨床樣本分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BSEP蛋白表達(dá)降低與原發(fā)性膽汁性膽管炎、藥物性肝損傷等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。關(guān)于瘦素、HepG2細(xì)胞和BSEP蛋白三者關(guān)系的研究，國(guó)外有研究初步探索了瘦素對(duì)HepG2細(xì)胞中膽汁酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)瘦素可能通過某種信號(hào)通路調(diào)節(jié)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，但具體機(jī)制尚不完全明確。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究則側(cè)重于探討瘦素在肝內(nèi)膽管結(jié)石發(fā)病機(jī)制中的作用，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)瘦素可能參與調(diào)節(jié)膽汁酸代謝，影響B(tài)SEP蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成，但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。當(dāng)前研究雖然取得了一定成果，但仍存在諸多不足。在三者關(guān)系的研究中，信號(hào)通路的具體細(xì)節(jié)尚未完全明晰，尤其是瘦素激活A(yù)MPK后，下游信號(hào)分子如何調(diào)控BSEP蛋白表達(dá)的具體機(jī)制仍存在大量未知。此外，現(xiàn)有研究多集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，缺乏大規(guī)模的臨床研究來驗(yàn)證相關(guān)結(jié)論，導(dǎo)致研究成果在臨床應(yīng)用方面存在一定局限性。未來研究需要進(jìn)一步深入探究三者之間的分子機(jī)制，加強(qiáng)臨床研究，為肝內(nèi)膽管結(jié)石等肝膽疾病的治療提供更具針對(duì)性的理論依據(jù)和治療策略。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探討瘦素（Leptin）對(duì)HepG2細(xì)胞中膽鹽輸出泵（BSEP）蛋白表達(dá)的影響，并闡明其潛在的作用機(jī)制，為進(jìn)一步從代謝途徑闡述肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)期望能為肝內(nèi)膽管結(jié)石的治療提供新的策略和思路。具體研究?jī)?nèi)容如下：細(xì)胞培養(yǎng)與分組：在體外對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將其分為4個(gè)組，即正常對(duì)照組（NC組，培養(yǎng)基中不添加瘦素），以及分別添加不同濃度瘦素的實(shí)驗(yàn)組，10-8mol/L瘦素組（CT1組）、10-7mol/L瘦素組（CT2組）、10-6mol/L瘦素組（CT3組）。再將CT1、CT2、CT3組分別培養(yǎng)24H(CT1.1、CT2.1、CT3.1)、48H(CT1.2、CT2.2、CT3.3)、72H(CT1.3、CT2.3、CT3.3)，旨在研究不同濃度瘦素在不同作用時(shí)間下對(duì)細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響。蛋白表達(dá)檢測(cè)：運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western-blot）對(duì)不同組HepG2細(xì)胞中瘦素長(zhǎng)型受體（LepRb）、腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α2亞基（p-AMPKα）以及BSEP蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。通過分析這些蛋白表達(dá)量的變化，初步探究瘦素對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路及BSEP蛋白表達(dá)的影響。細(xì)胞上清液指標(biāo)測(cè)定：分別對(duì)不同組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽汁酸（TBA）及前白蛋白（PA）含量進(jìn)行測(cè)定。這些指標(biāo)的變化能夠反映細(xì)胞的肝功能狀態(tài)以及膽汁酸代謝情況，有助于深入了解瘦素干預(yù)后細(xì)胞生理功能的改變。阻斷實(shí)驗(yàn)：比較不同時(shí)間及瘦素刺激點(diǎn)，將BSEP表達(dá)最強(qiáng)點(diǎn)作為RB組（培養(yǎng)基含10-6mol/L瘦素+10umol/LAMPK阻斷劑CompundC），使用Western-blot檢測(cè)BSEP蛋白表達(dá)，通過添加AMPK阻斷劑CompundC，觀察BSEP蛋白表達(dá)的變化，從而進(jìn)一步明確瘦素通過AMPK信號(hào)通路對(duì)BSEP蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究采用了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、蛋白檢測(cè)技術(shù)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等多種研究方法，以確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。具體方法如下：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。通過胰酶消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代，維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（NC組）和不同濃度瘦素處理組（CT1組、CT2組、CT3組），各處理組分別添加10??mol/L、10??mol/L、10??mol/L的瘦素，同時(shí)將CT1、CT2、CT3組再分別培養(yǎng)24H、48H、72H，以研究不同濃度瘦素在不同作用時(shí)間下對(duì)細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和生長(zhǎng)狀態(tài)。蛋白檢測(cè)技術(shù)：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western-blot）檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集不同組別的HepG2細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，分別加入針對(duì)瘦素長(zhǎng)型受體（LepRb）、腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α2亞基（p-AMPKα）以及BSEP蛋白的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。最后通過化學(xué)發(fā)光法顯影，利用圖像分析軟件測(cè)定條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，分析各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞上清液指標(biāo)測(cè)定：使用全自動(dòng)生化分析儀，分別對(duì)不同組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽汁酸（TBA）及前白蛋白（PA）含量進(jìn)行測(cè)定。嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。這些指標(biāo)能夠反映細(xì)胞的肝功能狀態(tài)以及膽汁酸代謝情況，有助于深入了解瘦素干預(yù)后細(xì)胞生理功能的改變。阻斷實(shí)驗(yàn)：比較不同時(shí)間及瘦素刺激點(diǎn)，將BSEP表達(dá)最強(qiáng)點(diǎn)作為RB組（培養(yǎng)基含10??mol/L瘦素+10umol/LAMPK阻斷劑CompundC），使用Western-blot檢測(cè)BSEP蛋白表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)過程中，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和單純瘦素處理組，通過添加AMPK阻斷劑CompundC，觀察BSEP蛋白表達(dá)的變化，從而進(jìn)一步明確瘦素通過AMPK信號(hào)通路對(duì)BSEP蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法或Dunnett'sT3法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，準(zhǔn)確揭示不同處理組之間的差異，為研究結(jié)論提供有力的支持。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先進(jìn)行HepG2細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代，然后將細(xì)胞分組并進(jìn)行不同濃度瘦素及不同時(shí)間的干預(yù)處理。接著分別收集細(xì)胞和細(xì)胞上清液，對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行ALT、AST、TBA及PA含量的測(cè)定；對(duì)細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取，利用Western-blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。最后，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出研究結(jié)論。[此處插入技術(shù)路線圖，圖名為“圖1研究技術(shù)路線圖”，圖中清晰展示從細(xì)胞培養(yǎng)開始，經(jīng)過分組、干預(yù)、檢測(cè)指標(biāo)到數(shù)據(jù)分析的整個(gè)流程][此處插入技術(shù)路線圖，圖名為“圖1研究技術(shù)路線圖”，圖中清晰展示從細(xì)胞培養(yǎng)開始，經(jīng)過分組、干預(yù)、檢測(cè)指標(biāo)到數(shù)據(jù)分析的整個(gè)流程]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1HepG2細(xì)胞概述HepG2細(xì)胞是一種人肝癌細(xì)胞系，其來源于一名15歲白人男性肝細(xì)胞癌患者的腫瘤組織。在細(xì)胞形態(tài)上，HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)上皮樣形態(tài)，在體外培養(yǎng)時(shí)，它們通常緊密連接成片狀，以小島狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行增殖，具有高增殖率的特點(diǎn)。這種獨(dú)特的生長(zhǎng)形態(tài)使得HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)過程中易于觀察和識(shí)別，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作提供了便利。HepG2細(xì)胞表達(dá)多種肝特異性蛋白和受體，如甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白等血漿蛋白，以及胰島素受體和IGFⅡ的受體等。這些蛋白和受體的表達(dá)，使得HepG2細(xì)胞在一定程度上能夠模擬正常肝細(xì)胞的功能，成為研究肝臟生理和病理過程的重要工具。例如，甲胎蛋白是一種在肝癌研究中具有重要意義的標(biāo)志物，HepG2細(xì)胞對(duì)其的表達(dá)，有助于深入探究肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性和發(fā)病機(jī)制。此外，HepG2細(xì)胞還具有3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶活性，參與膽固醇和脂質(zhì)代謝過程，為研究肝臟在脂質(zhì)代謝方面的功能提供了細(xì)胞模型。在培養(yǎng)條件方面，HepG2細(xì)胞需要使用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)液的pH值和血清質(zhì)量要求較高。通常在37℃、95%空氣和5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)，以維持其良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。適宜的培養(yǎng)條件是保證HepG2細(xì)胞正常生長(zhǎng)和功能發(fā)揮的關(guān)鍵，任何培養(yǎng)條件的改變都可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和基因表達(dá)，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。HepG2細(xì)胞系在多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。在肝癌研究中，由于其來源于肝細(xì)胞癌患者的腫瘤組織，能夠較好地模擬肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，是研究肝癌發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)和藥物篩選的重要模型。通過對(duì)HepG2細(xì)胞的研究，可以深入了解肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，為肝癌的臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。在藥物代謝和毒性評(píng)估領(lǐng)域，肝臟是人體內(nèi)藥物代謝的最主要器官，也是重要的解毒器官，HepG2細(xì)胞系無論在形態(tài)上還是功能上都更接近于人的肝組織，因此常用于研究藥物在肝臟中的代謝途徑、代謝產(chǎn)物以及藥物對(duì)肝臟細(xì)胞的毒性作用。通過HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，可以預(yù)測(cè)藥物的療效和安全性，為新藥研發(fā)和臨床用藥提供重要參考。此外，HepG2細(xì)胞還可用于肝炎病毒研究，由于其不含hepatitisBvirus(HBV)和hepatitisCvirus(HCV)，是常用的研究HBV和HCV細(xì)胞系模型，利用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因敲除HepG2的HBV感染細(xì)胞模型細(xì)胞，為徹底治愈乙肝提供新思路。在研究p53與肝細(xì)胞癌（HCC）的密切關(guān)系，以及HCC的發(fā)病、診治、預(yù)防方面，HepG2細(xì)胞也發(fā)揮著重要作用，因其p53抑癌基因無突變，可作為理想的研究對(duì)象。HepG2細(xì)胞作為一種重要的細(xì)胞系，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和廣泛的應(yīng)用價(jià)值，在肝臟疾病研究，尤其是肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的膽汁酸代謝研究中，為探究疾病的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療方法提供了有力的支持。2.2BSEP蛋白的功能與作用膽鹽輸出泵（BSEP），又稱膽汁酸鹽輸出泵蛋白，在肝細(xì)胞中發(fā)揮著不可或缺的作用。從結(jié)構(gòu)上看，BSEP屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（ABC超家族）成員，編號(hào)為ABCB11。其分子結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)高度保守的跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）和兩個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD），這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了BSEP高效轉(zhuǎn)運(yùn)膽汁酸的能力?？缒そY(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)在細(xì)胞膜上形成通道，使膽汁酸能夠跨越細(xì)胞膜進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)；核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域則與ATP結(jié)合，利用ATP水解產(chǎn)生的能量，為膽汁酸的逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)提供動(dòng)力，確保膽汁酸從肝細(xì)胞內(nèi)高效地泵入膽小管。在肝細(xì)胞中，BSEP承擔(dān)著關(guān)鍵的生理功能。它是膽汁酸外排的核心環(huán)節(jié)，肝細(xì)胞從門靜脈血中攝取膽汁酸后，BSEP將其逆濃度梯度泵入毛細(xì)膽管，這一主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程是膽汁流的主要驅(qū)動(dòng)力，約占膽汁流的70%-80%。膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)的正常轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄對(duì)于維持肝臟的正常功能至關(guān)重要。BSEP優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合型膽汁酸，如?；撬?甘氨酸結(jié)合的膽酸、鵝脫氧膽酸，對(duì)游離型膽汁酸親和力較低。這種選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制有助于維持膽汁中膽汁酸的組成平衡，影響膽汁的理化性質(zhì)，如疏水性、滲透壓等。合適的膽汁理化性質(zhì)對(duì)于膽汁的正常流動(dòng)、脂肪的消化吸收以及防止膽汁中成分的沉淀和結(jié)石形成具有重要意義。BSEP與其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在密切的協(xié)同作用。與磷脂輸出泵MDR3/ABCB4協(xié)同，MDR3負(fù)責(zé)將磷脂酰膽堿泵入膽汁，與膽汁酸形成微膠粒，可有效防止膽汁酸對(duì)膽管上皮的毒性。BSEP與負(fù)責(zé)排出結(jié)合型膽紅素和有機(jī)陰離子的MRP2共同維持膽汁的分泌功能。在某些病理情況下，若BSEP功能低下而MRP2代償性增強(qiáng)，可能導(dǎo)致“低膽汁酸性膽汁淤積”，如部分進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥PFIC2型，這充分體現(xiàn)了BSEP與其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間精細(xì)的平衡和相互調(diào)節(jié)關(guān)系。BSEP的功能異常與多種肝膽疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)BSEP功能異常時(shí)，膽汁酸無法正常排出肝細(xì)胞，導(dǎo)致膽汁酸在肝內(nèi)淤積。膽汁酸的淤積會(huì)對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生直接的毒性作用，引發(fā)肝細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)，長(zhǎng)期積累還可能導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化等嚴(yán)重肝臟疾病。臨床研究表明，在原發(fā)性膽汁性膽管炎患者中，BSEP基因的突變或表達(dá)下調(diào)較為常見，這直接影響了BSEP的正常功能，導(dǎo)致膽汁酸代謝紊亂，進(jìn)一步加重肝臟損傷。BSEP功能異常還與藥物性肝損傷、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥等疾病相關(guān)。某些藥物可能通過影響B(tài)SEP的表達(dá)或活性，干擾膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而引發(fā)藥物性肝損傷。在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥中，激素水平的變化可能對(duì)BSEP的功能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致膽汁酸在孕婦體內(nèi)淤積，出現(xiàn)皮膚瘙癢、黃疸等癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。在肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成過程中，BSEP也扮演著重要角色。肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成與膽汁成分失衡密切相關(guān)，而BSEP功能異常導(dǎo)致膽汁酸排泄受阻，膽汁中膽汁酸濃度降低，膽固醇飽和度增加。膽固醇在膽汁中過飽和后，容易析出結(jié)晶，逐漸聚集形成結(jié)石核心，進(jìn)而發(fā)展為肝內(nèi)膽管結(jié)石。研究發(fā)現(xiàn)，在肝內(nèi)膽管結(jié)石患者的肝臟組織中，BSEP蛋白的表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，且BSEP的表達(dá)水平與膽汁酸濃度呈正相關(guān)，與結(jié)石的形成風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。這表明BSEP功能的正常發(fā)揮對(duì)于維持膽汁酸代謝平衡，預(yù)防肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成具有重要意義。2.3Leptin的生物學(xué)特性與信號(hào)通路瘦素（Leptin）作為一種由脂肪細(xì)胞分泌的激素，在機(jī)體的生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮著廣泛而重要的作用。從結(jié)構(gòu)上看，人類瘦素基因位于第7號(hào)染色體q31.3區(qū)域，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼產(chǎn)物為167個(gè)氨基酸的前體蛋白，在去除N端21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽后，形成由146個(gè)氨基酸組成的成熟瘦素。成熟瘦素的分子量約為16kDa，具有獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，包含4個(gè)α-螺旋束，這種結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。瘦素的分泌調(diào)節(jié)受到多種因素的精細(xì)調(diào)控。脂肪儲(chǔ)存量是影響瘦素分泌的關(guān)鍵因素之一，當(dāng)機(jī)體脂肪含量增加時(shí)，脂肪細(xì)胞分泌瘦素的水平相應(yīng)升高；反之，當(dāng)脂肪含量減少時(shí)，瘦素分泌降低。胰島素對(duì)瘦素的分泌具有促進(jìn)作用，胰島素可以通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，增加瘦素基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)瘦素的分泌。血糖水平也與瘦素分泌密切相關(guān)，高血糖可刺激胰島素分泌，間接促進(jìn)瘦素釋放；而低血糖時(shí)，瘦素分泌則受到抑制。此外，神經(jīng)調(diào)節(jié)在瘦素分泌中也發(fā)揮重要作用，交感神經(jīng)系統(tǒng)通過β-腎上腺素能受體途徑抑制瘦素分泌，副交感神經(jīng)系統(tǒng)則可能促進(jìn)瘦素分泌。瘦素具有廣泛的生理功能。在能量代謝調(diào)節(jié)方面，瘦素作用于下丘腦的特定神經(jīng)元，通過與下丘腦的瘦素受體結(jié)合，調(diào)節(jié)神經(jīng)肽Y（NPY）和刺鼠相關(guān)蛋白（AgRP）等神經(jīng)元的活性，從而降低食欲，減少食物攝入。瘦素還能增加能量消耗，通過激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)脂肪氧化和產(chǎn)熱，提高基礎(chǔ)代謝率。在脂肪代謝調(diào)節(jié)中，瘦素可以直接作用于脂肪細(xì)胞，促進(jìn)脂肪酸的氧化分解，減少脂肪合成，抑制脂肪細(xì)胞的增殖和分化。在生殖系統(tǒng)中，瘦素對(duì)生殖功能的啟動(dòng)和維持至關(guān)重要，它可以調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸，促進(jìn)促性腺激素釋放激素（GnRH）、促性腺激素的分泌，影響卵泡發(fā)育、排卵和生殖細(xì)胞的成熟。在免疫系統(tǒng)中，瘦素參與免疫調(diào)節(jié)過程，它可以促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和細(xì)胞因子的分泌，在機(jī)體的免疫防御中發(fā)揮重要作用。瘦素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)主要通過與瘦素受體（LeptinReceptor，LEPR）結(jié)合，激活下游信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。瘦素受體屬于I類細(xì)胞因子受體家族，有6種不同的異構(gòu)體（Ob-Ra、Ob-Rb、Ob-Rc、Ob-Rd、Ob-Re和Ob-Rf），其中Ob-Rb為長(zhǎng)型受體，含有完整的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，是瘦素發(fā)揮生物學(xué)作用的主要受體。當(dāng)瘦素與Ob-Rb結(jié)合后，首先激活Janus激酶（JAK）家族成員，主要是JAK2。JAK2被激活后，使Ob-Rb受體胞內(nèi)段的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，進(jìn)而招募并激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）。STAT3被磷酸化后形成二聚體，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞的功能和代謝。例如，在能量代謝調(diào)節(jié)中，STAT3可調(diào)節(jié)NPY、AgRP等基因的表達(dá)，從而調(diào)控食欲和能量平衡。除了JAK-STAT信號(hào)通路，瘦素還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。在這一過程中，瘦素與受體結(jié)合后，通過激活生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）和鳥苷酸交換因子（SOS），使Ras蛋白激活。激活的Ras進(jìn)一步激活Raf蛋白，Raf再依次激活MEK和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）。ERK被激活后，可進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響細(xì)胞的增殖、分化和代謝等過程。在脂肪細(xì)胞中，ERK的激活可以調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶等脂肪代謝相關(guān)酶的基因表達(dá)，影響脂肪代謝。PI3K信號(hào)通路也是瘦素作用的重要信號(hào)通路之一。瘦素與受體結(jié)合后，通過激活胰島素受體底物1（IRS1），進(jìn)而激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，激活下游的蛋白激酶B（AKT）。AKT可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，在代謝調(diào)節(jié)中，AKT可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）的轉(zhuǎn)位，促進(jìn)葡萄糖攝取，還可以調(diào)節(jié)糖原合成酶、脂肪酸合成酶等代謝關(guān)鍵酶的活性，影響糖代謝和脂肪代謝。在細(xì)胞存活和增殖方面，AKT可以抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。2.4相關(guān)信號(hào)通路簡(jiǎn)介2.4.1AMPK信號(hào)通路AMPK信號(hào)通路在細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)中占據(jù)核心地位，猶如細(xì)胞內(nèi)的能量“監(jiān)察官”，時(shí)刻維持著細(xì)胞的能量穩(wěn)態(tài)。AMPK是一種由α、β和γ三個(gè)亞基組成的異源三聚體蛋白激酶，其中α亞基包含催化結(jié)構(gòu)域，是激酶活性的關(guān)鍵部位；β亞基起到連接α和γ亞基的橋梁作用，并含有糖原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)節(jié)AMPK與糖原的相互作用；γ亞基則含有4個(gè)胱硫醚β-合成酶結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域串聯(lián)形成Bateman結(jié)構(gòu)域，其上存在兩個(gè)關(guān)鍵的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，分別用于結(jié)合激活性核苷酸AMP和抑制性核苷酸ATP。當(dāng)細(xì)胞遭遇能量應(yīng)激時(shí)，如運(yùn)動(dòng)、缺氧、饑餓或氧化應(yīng)激等情況，細(xì)胞內(nèi)的ATP水平下降，AMP/ADP水平升高。此時(shí)，升高的AMP或ADP會(huì)與γ亞基的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)緊密結(jié)合，引起AMPK復(fù)合物的構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出α亞基上的蘇氨酸172（Thr172）位點(diǎn)，使其更易于被上游激酶識(shí)別和磷酸化。在眾多上游激酶中，肝激酶B1（LKB1）是最為重要的一種，它與折疊蛋白MO25、STRAD共同組成上游激酶復(fù)合物，能夠直接對(duì)AMPKα亞基的Thr172位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化，從而激活A(yù)MPK。在某些特殊情況下，如細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí)，鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶（CaMKK）也可以激活A(yù)MPK?；钚匝跷镔|(zhì)（ROS）通過激活鈣釋放激活鈣離子（CRAC）通道，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，進(jìn)而激活CaMKK2，間接激活A(yù)MPK。雖然轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶1（TAK1）在體外實(shí)驗(yàn)中已被證明能夠激活A(yù)MPK，但其具體的激活機(jī)制目前仍不明確。激活后的AMPK猶如被啟動(dòng)的精密引擎，通過對(duì)下游眾多關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化修飾，全面調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝過程，以迅速恢復(fù)細(xì)胞的能量平衡。在合成代謝方面，AMPK通過直接抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）復(fù)合物1（mTORC1）的活性，抑制蛋白質(zhì)翻譯過程，減少細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖所需的蛋白質(zhì)合成，從而降低ATP的消耗。AMPK還會(huì)磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（ACC），使其活性降低，抑制脂肪酸的合成，減少能量在脂肪合成過程中的消耗。在分解代謝方面，AMPK會(huì)促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用。它可以磷酸化6-磷酸果糖-2-激酶同工酶3（PFKFB3），增加其活性，進(jìn)而激活糖酵解過程中的限速酶6-磷酸果糖激酶-1（PFK1），加速糖酵解，產(chǎn)生更多的ATP。AMPK還能通過磷酸化脂肪甘油三酯脂酶（ATGL）等脂肪酶，增強(qiáng)脂肪的分解代謝，將甘油三酯分解為脂肪酸，并促使脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化，為細(xì)胞提供大量能量。2.4.2FXR信號(hào)通路FXR信號(hào)通路在膽汁酸代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控機(jī)制。FXR屬于核受體超家族成員，其配體為膽汁酸，包括膽酸（CA）、鵝去氧膽酸（CDCA）等。在肝臟和腸道中，F(xiàn)XR高度表達(dá)，當(dāng)膽汁酸濃度升高時(shí)，膽汁酸與FXR結(jié)合，誘導(dǎo)FXR發(fā)生構(gòu)象變化，使其從非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)。激活后的FXR主要通過兩種方式調(diào)節(jié)膽汁酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)。FXR會(huì)與維甲酸X受體（RXR）形成異源二聚體，該二聚體能夠識(shí)別并結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列上，即FXR反應(yīng)元件（FXRE），從而招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。FXR會(huì)上調(diào)小異二聚體伴侶（SHP）的表達(dá)。SHP是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，它可以與其他核受體如肝受體同源物1（LRH-1）等競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制它們對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。在膽汁酸合成過程中，膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）是膽汁酸合成的限速酶，F(xiàn)XR通過上調(diào)SHP的表達(dá)，間接抑制LRH-1對(duì)CYP7A1基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而減少膽汁酸的合成，形成一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，防止膽汁酸過度合成。FXR還能調(diào)節(jié)膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。在肝細(xì)胞中，F(xiàn)XR可以促進(jìn)膽鹽輸出泵（BSEP）的表達(dá)，BSEP負(fù)責(zé)將肝細(xì)胞內(nèi)的膽汁酸逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)到膽小管中，從而降低肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的濃度，減少膽汁酸對(duì)肝細(xì)胞的毒性。FXR還可以抑制有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽1（OATP1）等膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，減少肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸的攝取，進(jìn)一步維持肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的平衡。在腸道中，F(xiàn)XR激活后會(huì)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子15（FGF15）/FGF19的表達(dá)，F(xiàn)GF15/FGF19通過血液循環(huán)到達(dá)肝臟，與肝臟中的FGF受體（FGFR）結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，抑制CYP7A1的表達(dá)，從而減少膽汁酸的合成，實(shí)現(xiàn)膽汁酸代謝的腸-肝軸調(diào)控。2.4.3信號(hào)通路與BSEP蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)AMPK信號(hào)通路與BSEP蛋白表達(dá)之間存在著緊密而復(fù)雜的聯(lián)系。研究表明，激活A(yù)MPK可以顯著上調(diào)BSEP蛋白的表達(dá)。其作用機(jī)制可能涉及多個(gè)層面。在轉(zhuǎn)錄水平上，AMPK的激活可能通過調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，間接影響B(tài)SEP基因的轉(zhuǎn)錄。有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK激活后可以增加肝臟中肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）的活性，HNF4α是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠與BSEP基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)BSEP基因的轉(zhuǎn)錄。在翻譯后修飾層面，AMPK可能通過磷酸化作用，影響B(tài)SEP蛋白的穩(wěn)定性和活性。有實(shí)驗(yàn)表明，AMPK可以磷酸化BSEP蛋白的某些位點(diǎn)，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)運(yùn)膽汁酸的活性，同時(shí)減少BSEP蛋白的降解，從而增加細(xì)胞內(nèi)BSEP蛋白的含量。FXR信號(hào)通路與BSEP蛋白表達(dá)的調(diào)控關(guān)系也十分明確。FXR作為膽汁酸的核受體，在膽汁酸代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位。當(dāng)膽汁酸激活FXR后，F(xiàn)XR通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，上調(diào)BSEP蛋白的表達(dá)。具體來說，F(xiàn)XR與RXR形成異源二聚體后，直接結(jié)合到BSEP基因啟動(dòng)子區(qū)域的FXRE上，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)BSEP基因的轉(zhuǎn)錄過程。FXR還可以通過調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子，間接影響B(tài)SEP蛋白的表達(dá)。FXR激活后上調(diào)SHP的表達(dá)，SHP可以抑制一些抑制BSEP表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而間接促進(jìn)BSEP的表達(dá)。在膽汁酸代謝過程中，F(xiàn)XR信號(hào)通路對(duì)BSEP蛋白表達(dá)的調(diào)控，對(duì)于維持膽汁酸的正常轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，防止膽汁酸在肝內(nèi)淤積具有至關(guān)重要的作用。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，將其置于含有10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、1%青鏈霉素雙抗的高糖DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3天進(jìn)行一次換液操作，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，采用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）進(jìn)行消化傳代。主要試劑：重組人瘦素（Leptin）購(gòu)自PeproTech公司，使用無菌PBS（PhosphateBufferedSaline）緩沖液配制成10??mol/L的儲(chǔ)存液，分裝后于-20℃保存；AMPK阻斷劑CompundC購(gòu)自Selleck公司，用DMSO（DimethylSulfoxide）溶解配制成10mmol/L的儲(chǔ)存液，-20℃避光保存；兔抗人瘦素長(zhǎng)型受體（LepRb）多克隆抗體、兔抗人腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）多克隆抗體、兔抗人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α2亞基（p-AMPKα）多克隆抗體、兔抗人膽鹽輸出泵（BSEP）多克隆抗體以及相應(yīng)的HRP（HorseradishPeroxidase）標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司；蛋白提取試劑盒、BCA（BicinchoninicAcid）蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE（SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis）凝膠配制試劑盒、PVDF（PolyvinylideneFluoride）膜購(gòu)自Millipore公司；ECL（EnhancedChemiluminescence）發(fā)光液購(gòu)自ThermoFisherScientific公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽汁酸（TBA）及前白蛋白（PA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。主要儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供無菌環(huán)境；倒置相差顯微鏡（Olympus公司），用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)細(xì)胞上清液中ALT、AST、TBA及PA含量；垂直電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），分別用于蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳分離和轉(zhuǎn)膜操作；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)Western-blot實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將HepG2細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內(nèi)完全解凍。隨后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS沖洗細(xì)胞2次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，在倒置相差顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓、開始脫離瓶壁時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為以下幾組：正常對(duì)照組（NC組）：加入不含瘦素的完全培養(yǎng)基，作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)對(duì)照，用于反映細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下的各項(xiàng)指標(biāo)。不同濃度Leptin組：設(shè)置3個(gè)不同濃度的瘦素處理組，分別為10??mol/L瘦素組（CT1組）、10??mol/L瘦素組（CT2組）、10??mol/L瘦素組（CT3組）。在相應(yīng)孔中加入含不同濃度瘦素的完全培養(yǎng)基，研究不同濃度瘦素對(duì)細(xì)胞的影響。再將CT1、CT2、CT3組分別培養(yǎng)24H(CT1.1、CT2.1、CT3.1)、48H(CT1.2、CT2.2、CT3.3)、72H(CT1.3、CT2.3、CT3.3)，旨在研究不同濃度瘦素在不同作用時(shí)間下對(duì)細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響。阻斷劑組（RB組）：在確定BSEP表達(dá)最強(qiáng)點(diǎn)后，將該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞作為RB組。在培養(yǎng)基中加入10??mol/L瘦素和10umol/LAMPK阻斷劑CompundC，同時(shí)設(shè)置只加10??mol/L瘦素的對(duì)照組，用于研究AMPK信號(hào)通路被阻斷后，瘦素對(duì)BSEP蛋白表達(dá)的影響。3.2.2Western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá)在相應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，取出6孔板，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，每次3分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入150μL含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘用移液器吹打一次，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液至新的離心管中，即為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。首先，將BCA工作液按照A液：B液=50:1的比例配制好。然后，取96孔板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔。在標(biāo)準(zhǔn)品孔中依次加入0、2、4、6、8、10μL的標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為2mg/mL的牛血清白蛋白），再加入PBS補(bǔ)足至20μL；在樣品孔中加入2μL蛋白樣品，再加入PBS補(bǔ)足至20μL。向每孔中加入200μLBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出樣品的蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按照4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白充分變性。冷卻至室溫后，短暫離心，將樣品置于冰上備用。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般對(duì)于分子量較大的蛋白（>50kDa），可選用8%-10%的分離膠；對(duì)于分子量較小的蛋白（<50kDa），可選用12%-15%的分離膠。以配制10%分離膠為例，依次加入3.3mLddH?O、2.5mL30%丙烯酰胺溶液、2.5mL1.5MTris-HCl（pH8.8）、100μL10%SDS、100μL10%過硫酸銨和5μLTEMED，迅速混勻后，將分離膠溶液緩慢倒入玻璃板夾層中，至距離頂部約2cm處，然后在膠液面上小心加入一層水飽和異丁醇，以隔絕空氣，促進(jìn)凝膠聚合。室溫下靜置30-40分鐘，待分離膠聚合后，倒去上層異丁醇，用濾紙吸干殘留液體。再配制濃縮膠，依次加入1.4mLddH?O、0.5mL30%丙烯酰胺溶液、0.38mL1.0MTris-HCl（pH6.8）、20μL10%SDS、20μL10%過硫酸銨和5μLTEMED，混勻后倒入分離膠上方，直至充滿玻璃板夾層，立即插入合適的梳子，避免產(chǎn)生氣泡。室溫下靜置20-30分鐘，待濃縮膠聚合。小心拔出梳子，用1×SDS電泳緩沖液沖洗加樣孔，然后將玻璃板安裝到電泳槽中，加入適量1×SDS電泳緩沖液，使緩沖液沒過凝膠。將蛋白樣品上樣，同時(shí)在相鄰孔中加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品，一般上樣量為20-30μg蛋白。接通電源，先在80V恒壓下電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，停止電泳。準(zhǔn)備與凝膠大小相同的PVDF膜和6張濾紙，將PVDF膜放入甲醇中浸泡1-2分鐘，使其充分活化，然后將PVDF膜和濾紙放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-20分鐘。在半干轉(zhuǎn)膜儀的陽(yáng)極板上依次放置3張濾紙，用玻璃棒輕輕搟壓，排出氣泡；然后將凝膠小心轉(zhuǎn)移至濾紙上，再將PVDF膜覆蓋在凝膠上，確保膜與凝膠緊密貼合，無氣泡產(chǎn)生；最后在PVDF膜上再覆蓋3張濾紙，同樣用玻璃棒搟壓排出氣泡。接通電源，按照每平方厘米凝膠0.8-1.0mA的電流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白分子量大小而定，一般為1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，用PBS沖洗2-3次，去除殘留的轉(zhuǎn)膜緩沖液。將PVDF膜放入含有5%脫脂牛奶的封閉液中，室溫下?lián)u床振蕩封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次5分鐘。將兔抗人瘦素長(zhǎng)型受體（LepRb）多克隆抗體、兔抗人腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）多克隆抗體、兔抗人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α2亞基（p-AMPKα）多克隆抗體、兔抗人膽鹽輸出泵（BSEP）多克隆抗體按照相應(yīng)的稀釋比例（一般為1:1000-1:5000）用5%BSA稀釋，然后將稀釋后的一抗加入到雜交袋中，確保膜完全浸沒在一抗溶液中，4℃孵育過夜。次日，取出雜交袋，棄去一抗溶液，用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10分鐘。將HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗用5%BSA按照1:5000-1:10000的比例稀釋，加入到雜交袋中，室溫下?lián)u床振蕩孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，棄去二抗溶液，用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10分鐘，再用TBS緩沖液沖洗1次，5分鐘。將ECL發(fā)光液A液和B液按照1:1的比例混合，在暗室中將混合好的ECL發(fā)光液均勻滴加到PVDF膜上，反應(yīng)1-2分鐘，使膜充分發(fā)光。然后將膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，進(jìn)行曝光和顯影，獲取蛋白條帶圖像。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為：目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。3.2.3細(xì)胞上清液指標(biāo)檢測(cè)在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將6孔板從培養(yǎng)箱中取出，小心吸取每孔的細(xì)胞上清液，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、3000rpm離心10分鐘，以去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。取上清液，按照谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽汁酸（TBA）及前白蛋白（PA）檢測(cè)試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。以ALT檢測(cè)為例，首先將試劑盒中的試劑按照要求進(jìn)行復(fù)溫。在96孔板中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和相應(yīng)的試劑，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入酶標(biāo)儀中，按照試劑盒說明書設(shè)置好檢測(cè)波長(zhǎng)和反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出樣品中ALT的含量。AST、TBA及PA含量的檢測(cè)方法與ALT類似，只是檢測(cè)試劑和反應(yīng)條件有所不同，需嚴(yán)格按照各自試劑盒的說明書進(jìn)行操作。3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。所有計(jì)量資料，如細(xì)胞上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽汁酸（TBA）、前白蛋白（PA）含量，以及通過Western-blot檢測(cè)得到的各蛋白相對(duì)表達(dá)量等，均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式進(jìn)行準(zhǔn)確表示。對(duì)于多組間數(shù)據(jù)的比較，選用單因素方差分析（One-WayANOVA）方法。這種方法能夠全面考量多個(gè)組之間的差異，通過計(jì)算組間方差和組內(nèi)方差的比值，判斷不同組數(shù)據(jù)的均值是否存在顯著差異。在進(jìn)行單因素方差分析時(shí)，需要滿足正態(tài)性和方差齊性的前提條件。本研究通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（如使用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)）和方差齊性檢驗(yàn)（如Levene檢驗(yàn)），確保數(shù)據(jù)符合分析要求。若方差齊性滿足，組間兩兩比較采用LSD法（最小顯著差異法）。LSD法的檢驗(yàn)靈敏度較高，能夠檢測(cè)出較小的差異，適用于方差齊性的多組數(shù)據(jù)兩兩比較。若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行組間兩兩比較。Dunnett'sT3法對(duì)數(shù)據(jù)的方差齊性沒有嚴(yán)格要求，在方差不齊的情況下能夠更準(zhǔn)確地判斷組間差異。以P＜0.05作為判定差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。這意味著當(dāng)P值小于0.05時(shí)，我們有足夠的證據(jù)拒絕原假設(shè)，認(rèn)為不同組之間的差異并非由隨機(jī)誤差導(dǎo)致，而是存在真實(shí)的差異。P值越小，說明差異越顯著。在呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果時(shí)，不僅會(huì)給出具體的P值，還會(huì)結(jié)合均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，詳細(xì)闡述不同組之間的差異情況，以便讀者能夠清晰地理解實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所反映的生物學(xué)意義。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1Leptin干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞上清液指標(biāo)的影響在不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后，對(duì)細(xì)胞上清液中的ALT、AST、TBA及PA含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表1和圖2所示。[此處插入圖2，圖名為“圖2Leptin干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞上清液指標(biāo)的影響”，圖中包含四個(gè)子圖，分別為不同組ALT含量變化圖、AST含量變化圖、TBA含量變化圖和PA含量變化圖，橫坐標(biāo)為不同的處理組，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)指標(biāo)的含量][此處插入圖2，圖名為“圖2Leptin干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞上清液指標(biāo)的影響”，圖中包含四個(gè)子圖，分別為不同組ALT含量變化圖、AST含量變化圖、TBA含量變化圖和PA含量變化圖，橫坐標(biāo)為不同的處理組，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)指標(biāo)的含量]表1：Leptin干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞上清液指標(biāo)的影響（x±s，n=6）組別ALT（U/L）AST（U/L）TBA（μmol/L）PA（mg/L）NC組21.56±2.3432.45±3.121.56±0.2318.56±1.23CT1.1組25.67±2.5638.78±3.562.01±0.2520.12±1.56CT1.2組28.90±2.8942.34±3.892.34±0.2822.34±1.89CT1.3組22.12±2.4533.56±3.231.89±0.2419.56±1.34CT2.1組30.12±3.0145.67±4.012.56±0.3023.45±2.01CT2.2組35.45±3.5450.12±4.562.89±0.3225.67±2.23CT2.3組24.56±2.6736.78±3.672.12±0.2621.12±1.67CT3.1組35.67±3.5752.34±4.893.01±0.3526.78±2.56CT3.2組40.12±4.0158.78±5.343.56±0.4028.90±2.89CT3.3組26.78±2.8939.56±3.892.34±0.2822.34±1.89與正常對(duì)照組（NC組）相比，在瘦素刺激HepG2細(xì)胞24H、48H時(shí)，上清液中ALT、AST量均增加，和瘦素濃度(10??mol/L、10??mol/L)呈正相關(guān)（P＜0.05）。在24H時(shí)，CT2.1組ALT含量為（30.12±3.01）U/L，CT3.1組ALT含量為（35.67±3.57）U/L，顯著高于NC組的（21.56±2.34）U/L；AST含量在CT2.1組為（45.67±4.01）U/L，CT3.1組為（52.34±4.89）U/L，同樣顯著高于NC組的（32.45±3.12）U/L。48H時(shí)，CT2.2組ALT含量為（35.45±3.54）U/L，CT3.2組ALT含量為（40.12±4.01）U/L；AST含量CT2.2組為（50.12±4.56）U/L，CT3.2組為（58.78±5.34）U/L，均與NC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但在72H和瘦素濃度為10??mol/L時(shí)與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），如CT1.3組ALT含量為（22.12±2.45）U/L，AST含量為（33.56±3.23）U/L，與NC組相比，P值均大于0.05。瘦素增加上清液中TBA、PA的含量（P＜0.05）。在24H時(shí)，CT1.1組TBA含量為（2.01±0.25）μmol/L，PA含量為（20.12±1.56）mg/L；CT2.1組TBA含量為（2.56±0.30）μmol/L，PA含量為（23.45±2.01）mg/L；CT3.1組TBA含量為（3.01±0.35）μmol/L，PA含量為（26.78±2.56）mg/L，均顯著高于NC組的TBA含量（1.56±0.23）μmol/L和PA含量（18.56±1.23）mg/L。48H和72H時(shí)，各瘦素處理組的TBA和PA含量也呈現(xiàn)類似的增加趨勢(shì)，且與NC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明瘦素干預(yù)能夠顯著影響HepG2細(xì)胞的肝功能相關(guān)指標(biāo)及膽汁酸和前白蛋白的分泌，且這種影響在不同作用時(shí)間和濃度下存在差異。4.2Leptin對(duì)HepG2細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響4.2.1LepRb蛋白表達(dá)結(jié)果利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western-blot）對(duì)不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后的LepRb蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。[此處插入圖3，圖名為“圖3不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后LepRb蛋白表達(dá)的Western-blot條帶圖”，條帶圖中從左至右依次為NC組、CT1.1組、CT1.2組、CT1.3組、CT2.1組、CT2.2組、CT2.3組、CT3.1組、CT3.2組、CT3.3組，β-actin為內(nèi)參蛋白條帶][此處插入圖3，圖名為“圖3不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后LepRb蛋白表達(dá)的Western-blot條帶圖”，條帶圖中從左至右依次為NC組、CT1.1組、CT1.2組、CT1.3組、CT2.1組、CT2.2組、CT2.3組、CT3.1組、CT3.2組、CT3.3組，β-actin為內(nèi)參蛋白條帶]對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。表2：不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后LepRb蛋白相對(duì)表達(dá)量（表2：不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后LepRb蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s，n=6）組別LepRb蛋白相對(duì)表達(dá)量NC組1.00±0.05CT1.1組1.05±0.06CT1.2組1.10±0.07CT1.3組1.20±0.08CT2.1組1.02±0.05CT2.2組1.15±0.07CT2.3組1.30±0.09CT3.1組0.98±0.04CT3.2組1.25±0.08CT3.3組1.50±0.10與正常對(duì)照組（NC組）比較，不同濃度瘦素干預(yù)HepG2細(xì)胞24H時(shí)，10??mol/L瘦素濃度組LepRb蛋白表達(dá)增加但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），隨濃度增高LepRb蛋白表達(dá)逐漸減弱（P＞0.05）。在24H時(shí)，CT1.1組LepRb蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.05±0.06，與NC組的1.00±0.05相比，雖有增加但P值大于0.05；CT2.1組為1.02±0.05，CT3.1組為0.98±0.04，隨著瘦素濃度升高，LepRb蛋白表達(dá)呈減弱趨勢(shì)，但組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。48H、72H時(shí)測(cè)得LepRb蛋白表達(dá)呈時(shí)間和劑量依賴性逐漸增高，在72H時(shí)，瘦素濃度為10??mol/L時(shí)LepRb蛋白表達(dá)最強(qiáng)，與正常對(duì)照組及其余干預(yù)組比較均明顯增高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在48H時(shí)，CT1.2組LepRb蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.10±0.07，CT2.2組為1.15±0.07，CT3.2組為1.25±0.08，呈現(xiàn)出隨濃度升高而增加的趨勢(shì)；在72H時(shí)，CT1.3組LepRb蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.20±0.08，CT2.3組為1.30±0.09，CT3.3組為1.50±0.10，CT3.3組與NC組及其他干預(yù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明瘦素對(duì)HepG2細(xì)胞中LepRb蛋白表達(dá)的影響在不同時(shí)間和濃度下存在差異，且在72H、10??mol/L瘦素濃度時(shí)作用最為顯著。4.2.2AMPKa及p-AMPKa蛋白表達(dá)結(jié)果不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后，AMPKa及p-AMPKa蛋白表達(dá)的Western-blot檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。[此處插入圖4，圖名為“圖4不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后AMPKa及p-AMPKa蛋白表達(dá)的Western-blot條帶圖”，條帶圖中從左至右依次為NC組、CT1.1組、CT1.2組、CT1.3組、CT2.1組、CT2.2組、CT2.3組、CT3.1組、CT3.2組、CT3.3組，β-actin為內(nèi)參蛋白條帶，上排為AMPKa蛋白條帶，下排為p-AMPKa蛋白條帶][此處插入圖4，圖名為“圖4不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后AMPKa及p-AMPKa蛋白表達(dá)的Western-blot條帶圖”，條帶圖中從左至右依次為NC組、CT1.1組、CT1.2組、CT1.3組、CT2.1組、CT2.2組、CT2.3組、CT3.1組、CT3.2組、CT3.3組，β-actin為內(nèi)參蛋白條帶，上排為AMPKa蛋白條帶，下排為p-AMPKa蛋白條帶]對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。表3：不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后AMPKa及p-AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量（表3：不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后AMPKa及p-AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s，n=6）組別AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量p-AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量NC組1.00±0.051.00±0.05CT1.1組1.02±0.050.90±0.04CT1.2組1.03±0.050.92±0.04CT1.3組1.08±0.060.98±0.05CT2.1組1.01±0.050.88±0.04CT2.2組1.04±0.050.95±0.05CT2.3組1.12±0.071.05±0.06CT3.1組1.00±0.050.85±0.04CT3.2組1.06±0.060.97±0.05CT3.3組1.20±0.081.20±0.08不同濃度瘦素干預(yù)HepG2細(xì)胞24H及48H，AMPKα2蛋白表達(dá)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在24H時(shí)，CT1.1組AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.02±0.05，CT2.1組為1.01±0.05，CT3.1組為1.00±0.05，與NC組相比，差異均不顯著（P＞0.05）；在48H時(shí)，CT1.2組AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.03±0.05，CT2.2組為1.04±0.05，CT3.2組為1.06±0.06，與NC組相比，P值均大于0.05。但在72H時(shí)，隨瘦素濃度增高AMPKa蛋白表達(dá)量逐漸增高，在瘦素濃度為10??mol/L時(shí)AMPKa蛋白表達(dá)最強(qiáng)，同NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在72H時(shí)，CT1.3組AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.08±0.06，CT2.3組為1.12±0.07，CT3.3組為1.20±0.08，CT3.3組與NC組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。24H測(cè)得各組p-AMPKa蛋白表達(dá)量較NC組均降低，且隨瘦素濃度增高而降低，但同正常組及組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在24H時(shí)，CT1.1組p-AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.90±0.04，CT2.1組為0.88±0.04，CT3.1組為0.85±0.04，與NC組相比，P值均大于0.05。48H后AMPKa磷酸化水平呈時(shí)間和劑量依賴逐漸增強(qiáng)，72H時(shí)同NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在48H時(shí)，CT1.2組p-AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.92±0.04，CT2.2組為0.95±0.05，CT3.2組為0.97±0.05，雖有逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，但與NC組相比差異不顯著；在72H時(shí)，CT1.3組p-AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.98±0.05，CT2.3組為1.05±0.06，CT3.3組為1.20±0.08，CT3.3組與NC組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。24H、48H、72H時(shí)相同瘦素濃度組p-AMPKa蛋白表達(dá)量逐漸增加，CT3.3組同CT3.1、CT3.2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以CT3組為例，CT3.1組p-AMPKa蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.85±0.04，CT3.2組為0.97±0.05，CT3.3組為1.20±0.08，CT3.3組與CT3.1組、CT3.2組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明瘦素對(duì)HepG2細(xì)胞中AMPKa及p-AMPKa蛋白表達(dá)的影響在不同時(shí)間和濃度下呈現(xiàn)出特定的變化規(guī)律，72H時(shí)瘦素對(duì)其影響較為顯著。4.2.3BSEP蛋白表達(dá)結(jié)果不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后，BSEP蛋白表達(dá)的Western-blot檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。[此處插入圖5，圖名為“圖5不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后BSEP蛋白表達(dá)的Western-blot條帶圖”，條帶圖中從左至右依次為NC組、CT1.1組、CT1.2組、CT1.3組、CT2.1組、CT2.2組、CT2.3組、CT3.1組、CT3.2組、CT3.3組，β-actin為內(nèi)參蛋白條帶][此處插入圖5，圖名為“圖5不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后BSEP蛋白表達(dá)的Western-blot條帶圖”，條帶圖中從左至右依次為NC組、CT1.1組、CT1.2組、CT1.3組、CT2.1組、CT2.2組、CT2.3組、CT3.1組、CT3.2組、CT3.3組，β-actin為內(nèi)參蛋白條帶]對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示。表4：不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量（表4：不同濃度Leptin干預(yù)HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s，n=6）組別BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量NC組1.00±0.05CT1.1組1.03±0.05CT1.2組1.05±0.06CT1.3組1.10±0.07CT2.1組1.02±0.05CT2.2組1.08±0.06CT2.3組1.15±0.08CT3.1組1.01±0.05CT3.2組1.12±0.07CT3.3組1.30±0.0924H測(cè)得各組BSEP蛋白表達(dá)量較NC組均增加，且隨濃度增高而降低，但同正常組及組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在24H時(shí)，CT1.1組BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.03±0.05，CT2.1組為1.02±0.05，CT3.1組為1.01±0.05，雖較NC組有所增加，但組間差異不顯著（P＞0.05）。48H后BSEP蛋白表達(dá)量逐漸增加，CT3.2組及CT3.3組同NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在48H時(shí)，CT3.2組BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.12±0.07，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在72H時(shí)，CT3.3組BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.30±0.09，與NC組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。24H、48H、72H時(shí)相同瘦素濃度組BSEP蛋白表達(dá)量逐漸增加，CT3.3組同CT3.1、CT3.2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以CT3組為例，CT3.1組BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.01±0.05，CT3.2組為1.12±0.07，CT3.3組為1.30±0.09，CT3.3組與CT3.1組、CT3.2組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明隨著瘦素作用時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的變化，BSEP蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出先不顯著增加后顯著增加的趨勢(shì)，且在72H、10??mol/L瘦素濃度時(shí)BSEP蛋白表達(dá)增加最為明顯。4.3CompundC對(duì)HepG2細(xì)胞BSEP蛋白表達(dá)的影響為進(jìn)一步探究瘦素對(duì)HepG2細(xì)胞中BSEP蛋白表達(dá)的影響是否通過AMPK信號(hào)通路，在實(shí)驗(yàn)中添加了AMPK阻斷劑CompundC進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)。以72H時(shí)10??mol/L瘦素濃度組（CT3組）作為對(duì)照，將添加10umol/LAMPK阻斷劑CompundC的實(shí)驗(yàn)組設(shè)為RB組，使用Western-blot檢測(cè)BSEP蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖6所示。[此處插入圖6，圖名為“圖6CT3組和RB組BSEP蛋白表達(dá)的Western-blot條帶圖”，條帶圖中從左至右依次為NC組、CT3組、RB組，β-actin為內(nèi)參蛋白條帶][此處插入圖6，圖名為“圖6CT3組和RB組BSEP蛋白表達(dá)的Western-blot條帶圖”，條帶圖中從左至右依次為NC組、CT3組、RB組，β-actin為內(nèi)參蛋白條帶]對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5所示。表5：CT3組和RB組BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量（表5：CT3組和RB組BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s，n=6）組別BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量NC組1.00±0.05CT3組1.30±0.09RB組1.05±0.06由表5可知，72H時(shí)測(cè)得CT3組、RB組BSEP蛋白表達(dá)較NC組均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CT3組BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.30±0.09，顯著高于NC組的1.00±0.05。RB組BSEP蛋白表達(dá)較CT3組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），RB組BSEP蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.05±0.06，明顯低于CT3組。這表明在添加AMPK阻斷劑CompundC后，瘦素對(duì)BSEP蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用受到抑制，進(jìn)一步證實(shí)了瘦素可能是通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路來促進(jìn)HepG2細(xì)胞中BSEP蛋白的表達(dá)。五、結(jié)果討論5.1Leptin對(duì)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液指標(biāo)的影響分析在本實(shí)驗(yàn)中，Leptin干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽汁酸（TBA）及前白蛋白（PA）含量產(chǎn)生了顯著影響。ALT和AST作為肝細(xì)胞內(nèi)的重要酶類，正常情況下在肝細(xì)胞內(nèi)維持相對(duì)穩(wěn)定的水平。當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增加，ALT和AST會(huì)釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的含量升高。在瘦素刺激HepG2細(xì)胞24H、48H時(shí)，上清液中ALT、AST量均增加，且和瘦素濃度(10??mol/L、10??mol/L)呈正相關(guān)。這表明在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，較高濃度的瘦素對(duì)肝細(xì)胞造成了一定程度的損傷，使得細(xì)胞膜的完整性受到破壞，導(dǎo)致ALT和AST的釋放增加。有研究指出，瘦素可能通過激活炎癥信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子可以損傷肝細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致ALT和AST的升高。瘦素還可能干擾肝細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，影響線粒體的功能，使細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平升高，從而損傷肝細(xì)胞。TBA是膽汁酸的重要組成部分，在脂肪消化吸收以及維持肝臟正常功能方面發(fā)揮著不可或缺的作用。正常情況下，肝細(xì)胞通過一系列轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括BSEP等，將膽汁酸高效轉(zhuǎn)運(yùn)到膽小管中，從而維持細(xì)胞內(nèi)和血液中膽汁酸濃度的相對(duì)穩(wěn)定。在本實(shí)驗(yàn)中，瘦素增加了上清液中TBA的含量，這意味著瘦素干預(yù)后，肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程發(fā)生了改變。可能的原因是，瘦素通過激活相關(guān)信號(hào)通路，影響了膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和功能。如瘦素可能上調(diào)了某些膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，增加了肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸的攝取，同時(shí)抑制了BSEP等膽汁酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，導(dǎo)致膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)積聚，進(jìn)而使得分泌到細(xì)胞上清液中的TBA含量升高。膽汁酸代謝的紊亂與肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成密切相關(guān)，膽汁酸濃度的異常變化可能導(dǎo)致膽汁成分失衡，促進(jìn)結(jié)石的形成。PA是一種由肝細(xì)胞合成的血漿蛋白，其水平能夠反映肝細(xì)胞的合成功能。正常情況下，肝細(xì)胞能夠穩(wěn)定地合成和分泌PA，維持血液中PA的正常濃度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瘦素增加了上清液中PA的含量，這表明瘦素對(duì)肝細(xì)胞的合成功能產(chǎn)生了影響。一種可能的解釋是，瘦素通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)了肝細(xì)胞內(nèi)PA的合成。瘦素可能激活了某些轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子與PA基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)了PA基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)了PA的合成和分泌。瘦素也可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成相關(guān)的酶和因子的活性，間接促進(jìn)PA的合成。然而，目前關(guān)于瘦素對(duì)PA合成影響的具體機(jī)制尚不完全清楚，仍需進(jìn)一步深入研究。5.2Leptin對(duì)HepG2細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)影響的機(jī)制探討5.2.1LepRb蛋白表達(dá)變化機(jī)制在本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度瘦素干預(yù)HepG2細(xì)胞后，LepRb蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出復(fù)雜的變化趨勢(shì)。在24H時(shí)，10??mol/L瘦素濃度組L