《藥品生物檢定技術(shù)》項目四

注射劑其他安全檢查法目錄01.典型崗位工作任務(wù)07.其他03.靜脈用注射劑05.特殊途徑的注射劑02.注射劑降壓物質(zhì)檢查04.肌內(nèi)注射用注射劑06.注射劑用輔料01典型崗位工作任務(wù)02注射劑降壓物質(zhì)檢查注射劑降壓物質(zhì)檢查2.注射劑異常毒性檢查4.注射劑過敏反應(yīng)檢查5.注射劑溶血與凝聚檢查3.注射劑組胺類物質(zhì)檢查注射劑安全性檢查法注射劑安全性檢查包括異常毒性、細菌內(nèi)毒素（或熱原）、降壓物質(zhì)（包括組胺類物質(zhì)）、過敏反應(yīng)、溶血與凝聚等項。根據(jù)處方、工藝、用法及用量等設(shè)定相應(yīng)的檢查項目并進行適用性研究。其中，細菌內(nèi)毒素檢查與熱原檢查項目間、降壓物質(zhì)檢查與組胺類物質(zhì)檢查項目間，可以根據(jù)適用性研究結(jié)果相互替代，選擇兩者之一作為檢查項目。03靜脈用注射劑靜脈用注射劑靜脈用注射劑，均應(yīng)設(shè)細菌內(nèi)毒素（或熱原）檢查項。其中化學(xué)藥品注射劑一般首選細菌內(nèi)毒素檢查項；中藥注射劑一般首選熱原檢查項，若該藥本身的藥理作用或?qū)彝玫亩拘苑磻?yīng)影響熱原檢測，可選擇細菌內(nèi)毒素檢查項。所用原料系動植物來源或微生物發(fā)酵液提取物時，組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染毒性雜質(zhì)且又缺乏有效的理化分析方法的靜脈用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)立異常毒性檢查項。所用原料系動植物來源或微生物發(fā)酵液提取物時，組分結(jié)構(gòu)不清晰且有可能污染異源蛋白或未知過敏反應(yīng)物質(zhì)的靜脈用注射劑，如缺乏相關(guān)的理化分析方法且臨床發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)，應(yīng)考慮設(shè)立過敏反應(yīng)檢查項。靜脈用注射劑所用原料系動植物來源或微生物發(fā)酵液提取物時，組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染組胺、類組胺樣降血壓物質(zhì)的靜脈用注射劑，特別是中藥注射劑，如缺乏相關(guān)的理化分析方法且臨床發(fā)現(xiàn)類過敏反應(yīng)，應(yīng)考慮設(shè)立降壓物質(zhì)或組胺類物質(zhì)檢查項。檢查項目一般首選降壓物質(zhì)檢查項，但若降血壓藥理作用與該藥具有的功能主治有關(guān)，或?qū)ω埖姆磻?yīng)干擾血壓檢測，可選擇組胺類物質(zhì)檢查項替代。中藥注射劑應(yīng)考慮設(shè)溶血與凝聚檢查項。04肌內(nèi)注射用注射劑肌內(nèi)注射用注射劑所用原料系動植物來源或微生物發(fā)酵液提取物時，組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染毒性雜質(zhì)且又缺乏有效的理化分析方法的肌內(nèi)注射用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)立異常毒性檢查項。所用原料系動植物來源或微生物發(fā)酵液提取物時，組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染異源蛋白或未知過敏反應(yīng)物質(zhì)的肌內(nèi)注射用注射劑，如缺乏相關(guān)理化分析方法且臨床發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)，應(yīng)考慮設(shè)立過敏反應(yīng)檢查項。臨床用藥劑量較大，生產(chǎn)工藝易污染細菌內(nèi)毒素的肌內(nèi)注射用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)細菌內(nèi)毒素檢查項。05特殊途徑的注射劑特殊途徑的注射劑椎管內(nèi)、腹腔、眼內(nèi)、皮下等特殊途徑的注射劑，其安全性檢查項目一般應(yīng)符合靜脈用注射劑的要求，必要時應(yīng)增加其他安全性檢查項目，如刺激性檢查、細胞毒性檢查。06注射劑用輔料注射劑用輔料注射劑用輔料使用面廣，用量大，來源復(fù)雜，與藥品的安全性直接相關(guān)。在其質(zhì)量控制中，應(yīng)根據(jù)輔料的來源、性質(zhì)、用途、用法用量，配合理化分析方法，設(shè)立必要的安全性檢查項目。07其他其他原料和生產(chǎn)工藝特殊的注射劑必要時應(yīng)增加特殊的安全性檢查項目，如外源因子檢測、細胞毒性檢查等。異常毒性檢查法異常毒性有別于藥物本身所具有的毒性特征，是指由生產(chǎn)過程中引入或其他原因所致的毒性。01本法系給予動物一定劑量的供試品溶液，在規(guī)定時間內(nèi)觀察動物出現(xiàn)的異常反應(yīng)或死亡情況，檢查供試品中是否污染外源性毒性物質(zhì)以及是否存在意外的不安全因素。02供試品溶液的制備按品種項下規(guī)定的濃度制成供試品溶液。臨用前，供試品溶液應(yīng)平衡至室溫。03試驗用動物應(yīng)健康合格，在試驗前及試驗的觀察期內(nèi)，均應(yīng)按正常飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)。做過本試驗的動物不得重復(fù)使用。04異常毒性檢查法非生物制品試驗除另有規(guī)定外，取小鼠5只，體重18～22g，每只小鼠分別靜脈給予供試品溶液0.5ml。應(yīng)在4～5秒內(nèi)勻速注射完畢。規(guī)定緩慢注射的品種可延長至30秒。除另有規(guī)定外，全部小鼠在給藥后48小時內(nèi)不得有死亡；如有死亡時，應(yīng)另取體重19～21g的小鼠10只復(fù)試，全部小鼠在48小時內(nèi)不得有死亡。生物制品試驗除另有規(guī)定外，異常毒性試驗應(yīng)包括小鼠試驗和豚鼠試驗。試驗中應(yīng)設(shè)同批動物空白對照，觀察期內(nèi)，動物全部健存，且無異常反應(yīng)，到期時每只動物體重應(yīng)增加，則判定試驗成立。按照規(guī)定的給藥途徑緩慢注入動物體內(nèi)。異常毒性檢查法非生物制品試驗（1）小鼠試驗法除另有規(guī)定外，取小鼠5只，注射前每只小鼠稱體重，應(yīng)為18～22g。每只小鼠腹腔注射供試品溶液0.5ml，觀察7天。觀察期內(nèi)，小鼠應(yīng)全部健存，且無異常反應(yīng)，到期時每只小鼠體重應(yīng)增加，判定供試品符合規(guī)定。如不符合上述要求，應(yīng)另取體重19～21g的小鼠10只復(fù)試1次，判定標(biāo)準(zhǔn)同前。（2）豚鼠試驗法除另有規(guī)定外，取豚鼠2只，注射前每只豚鼠稱體重，應(yīng)為250～350g。每只豚鼠腹腔注射供試品溶液5.0ml，觀察7天。觀察期內(nèi)，豚鼠應(yīng)全部健存，且無異常反應(yīng)，到期時每只豚鼠體重應(yīng)增加，判定供試品符合規(guī)定。如不符合上述要求，應(yīng)另取4只豚鼠復(fù)試1次，判定標(biāo)準(zhǔn)同前。降壓物質(zhì)檢查本法系比較組胺對照品（S）與供試品（T）引起麻醉貓血壓下降的程度，以判定供試品中所含降壓物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定。01對照品溶液的制備精密稱取磷酸組胺對照品適量，按組胺計算，加水溶解使成每1ml中含1.0mg的溶液，分裝于適宜的容器內(nèi)，4～8℃貯存，經(jīng)驗證保持活性符合要求的條件下，可在3個月內(nèi)使用。02對照品稀釋液的制備臨用前，精密量取組胺對照品溶液適量，用氯化鈉注射液制成每1ml中含組胺0.5μg或其他適宜濃度的溶液。03供試品溶液的制備按品種項下規(guī)定的限值，且供試品溶液與對照品稀釋液的注入體積應(yīng)相等的要求，制備適當(dāng)濃度的供試品溶液。04降壓物質(zhì)檢查檢查法取健康合格、體重2kg以上的貓，雌者應(yīng)無孕，用適宜的麻醉劑（如巴比妥類）麻醉后，固定于保溫手術(shù)臺上，分離氣管，必要時插入插管以使呼吸暢通，或可進行人工呼吸。在一側(cè)頸動脈插入連接測壓計的動脈插管，管內(nèi)充滿適宜的抗凝劑溶液，以記錄血壓，也可用其他適當(dāng)儀器記錄血壓。在一側(cè)股靜脈內(nèi)插入靜脈插管，供注射藥液用。試驗中應(yīng)注意保持動物體溫。全部手術(shù)完畢后，將測壓計調(diào)節(jié)到與動物血壓相當(dāng)?shù)母叨龋ㄒ话銥?3.3～20.0kPa），開啟動脈夾，待血壓穩(wěn)定后，方可進行藥液注射。各次注射速度應(yīng)基本相同，每次注射后立即注入一定量的氯化鈉注射液，每次注射應(yīng)在前一次反應(yīng)恢復(fù)穩(wěn)定以后進行，且相鄰兩次注射的間隔時間應(yīng)盡量保持一致。自靜脈依次注入上述對照品稀釋液，劑量按動物體重每1kg注射組胺0.05μg、0.1μg及0.15μg，重復(fù)2～3次，如0.1μg劑量所致的血壓下降值均不小于2.67kPa，同時相應(yīng)各劑量所致反應(yīng)的平均值有差別，可認為該動物的靈敏度符合要求。降壓物質(zhì)檢查取對照品稀釋液按動物體重每1kg注射組胺0.1μg的劑量（dS），供試品溶液按品種項下規(guī)定的劑量（dT），照下列次序注射一組4個劑量∶dS、dT、dT、dS。然后以第一與第三、第二與第四劑量所致的反應(yīng)分別比較；如dT所致的反應(yīng)值均不大于dS所致反應(yīng)值的一半，則判定供試品的降壓物質(zhì)檢查符合規(guī)定。否則應(yīng)按上述次序繼續(xù)注射一組4個劑量，并按相同方法分別比較兩組內(nèi)各對dS、dT劑量所致的反應(yīng)值；如dT所致的反應(yīng)值均不大于dS所致的反應(yīng)值，則判定供試品的降壓物質(zhì)檢查符合規(guī)定；如dT所致的反應(yīng)值均大于dS所致的反應(yīng)值，則判定供試品的降壓物質(zhì)檢查不符合規(guī)定；否則應(yīng)另取動物復(fù)試。如復(fù)試的結(jié)果仍有dT所致的反應(yīng)值大于dS所致的反應(yīng)值，則判定供試品的降壓物質(zhì)檢查不符合規(guī)定。所用動物經(jīng)靈敏度檢查如仍符合要求，可繼續(xù)用于降壓物質(zhì)檢查。組胺類物質(zhì)檢查法本法系比較組胺對照品（S）與供試品（T）引起豚鼠離體回腸收縮的程度，以判定供試品中所含組胺類物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定。對照品溶液的制備精密稱取磷酸組胺對照品適量，按組胺計算，加水溶解成每1ml中含1.0mg的溶液，分裝于適宜的容器內(nèi)，4～8℃貯存，經(jīng)驗證在確保收縮活性符合要求的條件下，可在3個月內(nèi)使用。對照品稀釋液的制備試驗當(dāng)日，精密量取組胺對照品溶液適量，用氯化鈉注射液按高、低劑量組(dS2、dS1配成兩種濃度的稀釋液，高劑量dS2應(yīng)不致使回腸收縮達到極限，低劑量dS1所致反應(yīng)值約為高劑量的一半，調(diào)節(jié)劑量使反應(yīng)可以重復(fù)岀現(xiàn)。一般組胺對照品浴槽中的終濃度為10-7～10-9g/ml，注入體積一般0.2～0.5ml為宜，高低劑量的比值(r)為1∶0.5左右。調(diào)節(jié)劑量使低劑量能引起回腸收縮，高劑量不致使回腸收縮達極限，且高低劑量所致回腸的收縮應(yīng)有明顯差別。組胺類物質(zhì)檢查法供試品溶液的配制按品種項下規(guī)定的限值，且供試品溶液與對照品稀釋液的注入體積應(yīng)相等的要求，制備適當(dāng)濃度的供試品溶液。供試品組胺溶液的制備取同一支組胺對照品溶液，按高、低劑量組（dS2+T、dS1+T）加供試品溶液配成兩種濃度的稀釋液，且供試品組胺溶液的高低劑量(dS2+T、dS1+T）應(yīng)與組胺對照品溶液的高、低劑量(dS2、dS1）一致。回腸肌營養(yǎng)液的制備A液：試驗當(dāng)日，取氯化鈉160.0g、氯化鉀4.0g、氯化鈣（按無水物計算）2.0g、氯化鎂（按無水物計算）1.0g與磷酸氫二鈉（含12個結(jié)晶水）0.10g，加純化水700ml使溶解，再加入注射用水適量，使成1000ml。B液：取硫酸阿托品0.5mg、碳酸氫鈉1.0g、葡萄糖（含1個結(jié)晶水）0.5g，加適量注射用水溶解，加A液50.0ml，混合后加注射用水使成1000ml，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4。B液應(yīng)臨用前制備。組胺類物質(zhì)檢查法檢查法取健康合格的成年豚鼠，雌雄均可，雌者無孕，體重250～350g，禁食24小時，迅速處死，立即剖腹取出回腸一段（選用遠端腸段，該段最敏感）仔細分離腸系膜，注意避免因牽拉使回腸受損，剪取適當(dāng)長度，用注射器抽取回腸肌營養(yǎng)B液，小心沖洗去除腸段的內(nèi)容物。將腸段下端固定于離體器官恒溫水浴裝置的浴槽底部，上端用線與記錄裝置相連；浴槽中事先放入一定量的回腸肌營養(yǎng)B液（約10～30ml），連續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體，維持恒溫（34～36℃），用適當(dāng)方法記錄該回腸收縮幅度。如果使用杠桿，其長度應(yīng)能使腸段的收縮放大約20倍。選擇1g左右的預(yù)負荷，可根據(jù)其靈敏度加以調(diào)節(jié)?；啬c放入浴槽后，靜置約15～30分鐘，方可開始注入藥液。每次注入藥液前，要用回腸肌營養(yǎng)B液沖洗浴槽2～3次。相鄰兩次給藥的間隔時間應(yīng)一致（約2分鐘），每次給藥前應(yīng)在前一次反應(yīng)恢復(fù)穩(wěn)定后進行。組胺類物質(zhì)檢查法在上述高低劑量范圍內(nèi)選定對照品稀釋液的劑量(dS2、dS1）和供試品溶液按品種項下規(guī)定的劑量(dT），照下列次序準(zhǔn)確注入浴槽6個劑量∶dS2、dS1、dT、dT、dS1、dS2，如dS2所致的反應(yīng)值大于dS1所致反應(yīng)值并且可重復(fù)時判定試驗有效。如供試品溶液引起回腸收縮，分別將第二個劑量dS1與第四個劑量dT、第五個劑量dS1與第三個劑量dT所致反應(yīng)值進行比較，若dT所致反應(yīng)值均不大于dS1所致反應(yīng)值，即判定供試品組胺類物質(zhì)檢查符合規(guī)定；若dT所致反應(yīng)值均大于dS1所致反應(yīng)值，即判定供試品組胺類物質(zhì)檢查不符合規(guī)定；否則應(yīng)另取動物按初試方法進行復(fù)試，復(fù)試結(jié)果若dT所致反應(yīng)值均不大于dS1所致反應(yīng)值，即判定供試品組胺類物質(zhì)檢查符合規(guī)定；只要一個dT所致反應(yīng)值大于dS1所致反應(yīng)值，即判定供試品組胺類物質(zhì)檢查不符合規(guī)定。如供試品不引起回腸收縮，組胺類物質(zhì)檢查法應(yīng)按下列次序準(zhǔn)確注入dS2、dS1+T、dS2+T、dS1，重復(fù)一次，若供試品組胺溶液高、低劑量（dS2+T、dS1+T）產(chǎn)生的收縮與對應(yīng)組胺對照液高、低劑量（dS2、dS1）的收縮反應(yīng)基本一致，可判定供試品組胺類物質(zhì)檢查符合規(guī)定；若供試品組胺溶液產(chǎn)生的收縮與對應(yīng)組胺對照液高、低劑量的收縮不相符，即減少或無收縮，或不能重復(fù)出現(xiàn)，則此試驗結(jié)果無效，應(yīng)另取動物重試。組胺類物質(zhì)檢查不能得到有效結(jié)果時，可進行供試品的降壓物質(zhì)檢查。過敏反應(yīng)檢查本法系將一定量的供試品溶液注入豚鼠體內(nèi)，間隔一定時間后靜脈注射供試品溶液進行激發(fā)，觀察動物出現(xiàn)過敏反應(yīng)的情況,以判定供試品是否引起動物全身過敏反應(yīng)。供試用的豚鼠應(yīng)健康合格，體重250～350g，雌鼠應(yīng)無孕。在試驗前和試驗過程中，均應(yīng)按正常飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)。做過本試驗的豚鼠不得重復(fù)使用。供試品溶液的制備除另有規(guī)定外，按品種項下規(guī)定的濃度制成供試品溶液。檢查法除另有規(guī)定外，取上述豚鼠6只，隔日每只每次腹腔或適宜的途徑注射供試品溶液0.5ml，共3次，進行致敏。每日觀察每只動物的行為和體征，首次致敏和激發(fā)前稱量并記錄每只動物的體重。然后將其均分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14日和第21日，由靜脈注射供試品溶液1ml進行激發(fā)。觀察激發(fā)后30分鐘內(nèi)動物有無過敏反應(yīng)癥狀。過敏反應(yīng)檢查結(jié)果判斷靜脈注射供試品溶液30分鐘內(nèi)，不得出現(xiàn)過敏反應(yīng)。如在同一只動物上出現(xiàn)豎毛、發(fā)抖、干嘔、連續(xù)噴嚏3聲、連續(xù)咳嗽3聲、紫癜和呼吸困難等現(xiàn)象中的2種或2種以上，或出現(xiàn)二便失禁、步態(tài)不穩(wěn)或倒地、抽搐、休克、死亡現(xiàn)象之一者，判定供試品不符合規(guī)定。溶血與凝聚檢查法本法系將一定量供試品與2%的家兔紅細胞混懸液混合，溫育一定時間后，觀察其對紅細胞狀態(tài)是否產(chǎn)生影響的一種方法。2%紅細胞混懸液的制備取健康家兔血液，放入含玻璃珠的錐形瓶中振搖10分鐘，或用玻璃棒攪動血液，以除去纖維蛋白原，使成脫纖血液。加入0.9%氯化鈉溶液約10倍量，搖勻，每分鐘1000～1500轉(zhuǎn)離心15分鐘，除去上清液，沉淀的紅細胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用0.9%氯化鈉溶液制成2%的混懸液，供試驗用。供試品溶液的制備除另有規(guī)定外，按品種項下規(guī)定的濃度制成供試品溶液。溶血與凝聚檢查法檢查法取潔凈玻璃試管5只，編號，1、2號管為供試品管，3號管為陰性對照管，4號管為陽性對照管，5號管為供試品對照管。按下表所示依次加入2%紅細胞懸液、0.9%氯化鈉溶液、純化水，混勻后，立即置37℃±0.5℃的恒溫箱中進行溫育。3小時后觀察溶血和凝聚反應(yīng)。溶血與凝聚檢查法如試管中的溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留或有少量紅細胞殘留，表明有溶血發(fā)生；如紅細胞全部下沉，上清液無色澄明，或上清液雖有色澄明，但1、2號管和5號管肉眼觀察無明顯差異，則表明無溶血發(fā)生。若溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，輕輕倒轉(zhuǎn)3次仍不分散，表明可能有紅細胞凝聚發(fā)生，應(yīng)進一步置顯微鏡下觀察，如可見紅細胞聚集為凝聚。結(jié)果判斷當(dāng)陰性對照管無溶血和凝聚發(fā)生，陽性對照管有溶血發(fā)生，若2支供試品管中的溶液在3小時內(nèi)均不發(fā)生溶血和凝聚，判定供試品符合規(guī)定；若有1支供試品管的溶液在3小時內(nèi)發(fā)生溶血和（或）凝聚，應(yīng)設(shè)4支供試品管進行復(fù)試，其供試品管的溶液在3小時內(nèi)均不得發(fā)生溶血和（或）凝聚，否則判定供試品不符合規(guī)定。單項選擇題1.靜脈用注射劑，均應(yīng)設(shè)細菌內(nèi)毒素（或熱原）檢查項。其中化學(xué)藥品注射劑一般首選檢查項（）A.細菌內(nèi)毒素B.熱原檢查項C.無菌檢查項D.微生物總數(shù)檢查項2.給予動物一定劑量的供試品溶液，在規(guī)定時間內(nèi)觀察動物出現(xiàn)的異常反應(yīng)或死亡情況，檢查供試品中是否污染外源性毒性物質(zhì)以及是否存在意外的不安全因素.為（）檢查法。A.降壓物質(zhì)B.組胺類物質(zhì)C.過敏反應(yīng)D.異常毒性3.降壓物質(zhì)檢查是比較組胺對照品（S）與供試品（T）引起麻醉（）血壓下降的程度，以判定供試品中所含降壓物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定。A.貓B.大白鼠C.狗D.兔子多項選擇題1.注射劑安全性檢查包括（）及溶血與凝聚等項。A.異常毒性B.細菌內(nèi)毒素（或熱原）C.降壓物質(zhì)（包括組胺類物質(zhì)）D.過敏反應(yīng)2.降壓物質(zhì)檢查法中，以下操作正確的是（）A.取健康合格、體重2kg以上的貓B.雌者應(yīng)無孕C.用適宜的麻醉劑（如巴比妥類）麻醉D.固定于保溫手術(shù)臺上，分離氣管，必要時插入插管以使呼吸暢通，或可進行人工呼吸《藥品生物檢定技術(shù)》項目五

抗生素效價的微生物檢定抗生素是生物(包括微生物、植物、動物在內(nèi))在其生命活動中產(chǎn)生的(或并用化學(xué)、生物或生化方法衍生的),能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機能的化學(xué)物質(zhì)的總稱。

由于抗生素可使95%以上由細菌感染而引起的疾病得到控制，因此被廣泛應(yīng)用于人類、家禽、家畜、作物等病害的防治，現(xiàn)在已成為治療傳染性疾病的主要藥物。此外，在抗腫瘤、抗病毒、抗原蟲、寄生蟲和昆蟲等領(lǐng)域也有較快發(fā)展?？股氐奶攸c結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜穩(wěn)定性差化學(xué)純度低抗生素效價和單位抗菌活性是指抗菌藥物抑制或殺死病原微生物的能力。抗生素的抗菌活性大小通常用效價單位來表示，即抗菌效價指抗生素藥物的作用強度。在臨床應(yīng)用中，抗生素的效價可準(zhǔn)確地反映抗生素的醫(yī)療價值，以“單位(U或IU)”表示?？股匦r和單位效價是表達藥物效力強弱或活性物質(zhì)含量的一種公認的劑量單位。效價單位（U）是衡量生物藥物有效成分效力的具體尺度。

效價

青霉素鈉的效價為1670U/mg慶大霉素的效價為590U/mg洋地黃的效價為10U/mL例如：用每毫升或每毫克中含有某種生物藥物的效價單位數(shù)表示藥物效力或濃度單位U/g，U/mL?？股匦r單位質(zhì)量單位類似質(zhì)量單位質(zhì)量折算單位特定單位抗生素效價單位如硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素等均以質(zhì)量單位表示。以抗生素中所含特定的抗菌活性部分的質(zhì)量1μg作為1單位（U），即1g=1000U。用這種方法表示，對不同有機酸根的同一抗生素，只要單位一樣或有效部分重量一樣，則這一抗生素的各種鹽類雖然稱重不同，但實際有效含量是相同的。質(zhì)量單位抗生素效價單位這種類似質(zhì)量單位，雖然并不合理，但在國際上已經(jīng)習(xí)慣沿用。類似質(zhì)量單位以特定的純抗生素鹽的質(zhì)量作為一個單位，即1g=1000單位，

其中包括了無抗菌活性的酸根在內(nèi)。如四環(huán)素鹽酸鹽（包括無生物活性的鹽酸根在內(nèi))。抗生素效價單位以特定的純抗生素鹽的某一質(zhì)量為一個單位而加以折算。質(zhì)量折算單位如青霉素國際標(biāo)準(zhǔn)品（1952年）青霉素G鈉稱重0.5998μg為1U，即1mg=1670單位，則1mg青霉素鉀的單位=1670×356.4/372.5=1598U?？股匦r單位制霉菌素（1963年）為1mg=3000單位等。特定單位以一特定量的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品（或?qū)φ掌?作為1單位。如第一批桿菌肽國際標(biāo)準(zhǔn)品（1953年)桿菌肽A為1mg=55單位。第二批桿菌肽A國際標(biāo)準(zhǔn)品為74U/mg。抗生素微生物檢定用標(biāo)準(zhǔn)品和供試品標(biāo)準(zhǔn)品種類國際標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)過國際有關(guān)機構(gòu)協(xié)議認定的每1mg含有一定單位的標(biāo)準(zhǔn)品。其單位稱為國際單位（U）。國家標(biāo)準(zhǔn)品工作標(biāo)準(zhǔn)品

應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品，可以降低由于生物差異造成的實驗誤差，使在不同實驗室里檢定同一藥物時，即使實驗條件或影響因素不盡相同，但由于同時作用于標(biāo)準(zhǔn)品和供試品，在對比檢定中，這些影響因素可以互相抵消，它們之間的反應(yīng)強度比例保持不變，這樣就大大提高了生物檢定的可靠性和精密度。

藥典所采用的標(biāo)準(zhǔn)品，為參照國際標(biāo)準(zhǔn)品制備的對照標(biāo)準(zhǔn)品，由中國食品藥品檢定研究院發(fā)放，單位效價相當(dāng)于國際單位效價。標(biāo)準(zhǔn)品有均勻、穩(wěn)定而持久的性質(zhì)，應(yīng)存放于除去氧氣的干燥器中，低溫處避光貯放。標(biāo)準(zhǔn)品(S—Standardsubstance)系指用于生物檢定中效價測定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以效價單位（U）表示。Tips與商品同質(zhì)純度較高標(biāo)準(zhǔn)品是由產(chǎn)品的生產(chǎn)、研制單位自己制備的，僅供內(nèi)部使用。國際標(biāo)準(zhǔn)品工作標(biāo)準(zhǔn)品國家標(biāo)準(zhǔn)品是由世界衛(wèi)生組織WHO)邀請有條件的國家檢定機構(gòu)或藥廠參加協(xié)作標(biāo)定的；是各國指定的機構(gòu)選定一批性質(zhì)完全相同的藥品與國際標(biāo)準(zhǔn)品進行比較，定出它的效價，統(tǒng)一向全國的檢定、科研、教育、生產(chǎn)單位分發(fā)，在檢定產(chǎn)品效價時使用；抗生素微生物檢定用標(biāo)準(zhǔn)品和供試品標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示量是按生物活性來計算的，不是按純度來標(biāo)示，

按效價單位（或μg）計。對照品(R—Referencesubstance)標(biāo)示量是某單一組分的純度指標(biāo)，以百分含量表示。標(biāo)準(zhǔn)品和對照品在定量時是不可相互替代的。對照品以抗生素微生物檢定法測羅紅霉素其含量時，必須使用羅紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品；但以HPLC法測定羅紅霉素含量時，又必須使用羅紅霉素對照品，不可混淆?？股匚⑸餀z定用標(biāo)準(zhǔn)品和供試品供試品是供檢定其效價的樣品，它的活性成分應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品基本相同。供試品（T）抗生素微生物檢定法

量反應(yīng)平行線是指當(dāng)S和T屬于同種抗生素時，在相同的試驗條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液對試驗菌所得的量反應(yīng)曲線，在一定劑量范圍內(nèi)相互平行。即“同種物質(zhì)，同種反應(yīng)”，因此每種抗生素有著各自的效價單位，不同抗生素之間的效價單位沒有可比性。是在適宜條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理設(shè)計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，計算抗生素活性（效價）的方法。原理抗生素微生物檢定方法管碟法利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。濁度法

利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對試驗菌生長抑制的程度，以測定供試品效價的一種方法。課堂小結(jié)一、抗生素和其效價單位的表示方法二、標(biāo)準(zhǔn)品、對照品和供試品三、抗生素的微生物檢定方法管碟法濁度法管碟法測定抗生素效價管碟法是瓊脂擴散法中的一種，將不銹鋼小管安置在攤布特定試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基平板上，當(dāng)小管內(nèi)加入抗生素溶液后，抗生素分子就隨溶劑向培養(yǎng)基內(nèi)呈球形擴散。同時將培養(yǎng)基平板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗菌就開始繁殖。管碟法測定抗生素效價本法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生的抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。管碟法的原理抑菌圈的形成通用方法管碟法的原理兩種互動作用：一種是抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴散作用；

另一種是試驗菌的生長作用。當(dāng)培養(yǎng)到一定時間，培養(yǎng)基中的兩種互動作用達到動態(tài)平衡時，瓊脂培養(yǎng)基中便形成透明的抑菌圈。在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗菌生長受到抑制，此處瓊脂培養(yǎng)基成透明狀。在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。檢定方法分類二劑量法（通則1431中2.2法)三劑量法（通則1431中3.3法)試驗準(zhǔn)備菌懸液的制備枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）懸液短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）金黃色葡萄球菌（Szaphylococcusaureus）懸液藤黃微球菌（Micrococcusluteus）懸液大腸埃希菌（Escherichiacoli）懸液啤酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）懸液肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）懸液支氣管炎博德特菌（Bordetellabronchiseptica）試驗準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品的使用和保存標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、低濃度的劑量比一般為2∶1高劑量點的抑菌圈直徑應(yīng)18-22mm高劑量與低劑量抑菌圈之差最好不小于2mm抗生素差數(shù)較小時，可用4∶1的高、低劑量比率標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備試驗準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品的使用和保存標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備試驗準(zhǔn)備供試品溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備室內(nèi)精密稱（或量)取供試品適量，用各品種項下規(guī)定的溶劑溶解后，再按估計效價或標(biāo)示量照表的規(guī)定稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)臐舛?。試驗?zhǔn)備菌液量以能得清晰的抑菌圈為度：二劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22mm;三劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15～18mm。雙碟的制備取直徑約90mm，高16～17mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)

基20ml，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺面上使凝固，作為底層。取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃)，加入規(guī)定的試驗菌懸液適量，搖勻，在每1雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，作為菌層。試驗準(zhǔn)備放置在水平臺上冷卻后，在每1雙碟中以等距離均勻安置不銹鋼小管（內(nèi)徑為6.0mm±0.1mm,高為10.0mm±0.1mm,外徑7.8mm±0.1mm)4個（二劑量法）或6個（三劑量法），用陶瓦圓蓋覆蓋備用。雙碟的制備試驗準(zhǔn)備三劑量法用于抗生素藥品的仲裁和標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定。生物檢定統(tǒng)計法（通則1431）中的(3.3)。高、低濃度的劑距為1∶0.8。檢定方法二劑量法用于抗生素藥品效價的常規(guī)測定。生物檢定統(tǒng)計法（通則1431）中的（2.2）。標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液的高低劑距為2∶1，如高低劑量所致的抑菌圈差別較小時，可用4∶1的計量比率。三劑量法試驗準(zhǔn)備按照生物檢定統(tǒng)計法（通則1431）中的（2.2）法和（3.3）法進行可靠性測驗及效價計算?？股匚⑸餀z定法生物統(tǒng)計培養(yǎng)測定在規(guī)定條件（溫度、時間）下培養(yǎng)各抑菌圈直徑或者面積課堂小結(jié)管碟法的操作步驟：配制菌懸液→供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備→雙碟的制備→滴加抗生素溶液→雙碟的培養(yǎng)→抑菌圈的測量→效價測定及結(jié)果的可靠性檢驗管碟法測定抗生素效價的影響因素有哪些？濁度法測定抗生素效價濁度法本法系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對試驗菌生長抑制的程度，以測定供試品效價的一種方法。原理分別加入抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品到已接種有試驗菌的培養(yǎng)基中，因不同濃度的抗生素對試驗菌的抑制作用不同，在一定時間內(nèi),通過測量培養(yǎng)基內(nèi)試驗菌濃度(濁度)變化就可確定供試品的效價。檢定方法分類標(biāo)準(zhǔn)曲線法（通則1431中標(biāo)準(zhǔn)曲線法）二劑量/三劑量法（通則1431中2.2法/3.3法）試驗準(zhǔn)備菌懸液的制備金黃色葡萄球菌（Szaphylococcusaureus）懸液大腸埃希菌（Escherichiacoli）懸液白色念珠菌（Candidaalbicans）試驗準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品的使用和保存在規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi)，以線性濃度范圍的中間值作為中間濃度，標(biāo)準(zhǔn)品溶液選擇5個劑量，劑量間的比例通常為1∶1.25或更小。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備試驗準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品的使用和保存標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備試驗準(zhǔn)備供試品溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備供試品根據(jù)估計效價或標(biāo)示量溶液選擇中間劑量，每一劑量不少于3個試管。試驗準(zhǔn)備試管的制備取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管。在各試驗管內(nèi)精密加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0mL，再分別精密加入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液各1.0mL，立即混勻，每一濃度組不少于4個試管。按隨機區(qū)組分配各試管。在規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi)，選擇適宜的高、（中、）低濃度，分別精密加入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各1.0mL，二劑量的劑距為2∶1或4∶1，三劑量的劑距為1∶0.8。

每一濃度組不少于4個試管，按隨機區(qū)組分配。試驗準(zhǔn)備生物檢定統(tǒng)計法（通則1431）中的（2.2）/（3.3）。二劑量的高、低濃度的劑距為2∶1或4∶1

三劑量的高、低濃度的劑距為1

∶0.8。檢定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法用于抗生素藥品效價的常規(guī)測定。生物檢定統(tǒng)計法（通則1431）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法。另取2支試管各加入藥品稀釋劑1.0mL，再分別加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0mL，其中一支試管與上述各管同法操作作為細菌生長情況的陽性對照，另一支試管立即加入甲醛溶液0.5mL，混勻，作為吸光度測定的空白液。二/三劑量法試驗準(zhǔn)備按照生物檢定統(tǒng)計法（通則1431）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法/（2.2）法/（3.3）法進行可靠性測驗及效價計算?？股匚⑸餀z定法生物統(tǒng)計培養(yǎng)測定在規(guī)定條件（溫度、時間）下培養(yǎng)，通常約為4h。各試管的吸光度（530nm/580nm處）課堂小結(jié)濁度法的操作步驟：配制菌懸液→供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備→試管的制備→試管的培養(yǎng)→吸光度的測量→效價測定及結(jié)果的可靠性檢驗濁度法測定抗生素效價的影響因素有哪些？注射用硫酸鏈霉素的效價測定本品對結(jié)核桿菌具有強大的抗菌作用，對許多革蘭陰性桿菌有較強的抗菌作用。本品對各種皮膚結(jié)核病皆有效，有抑制結(jié)核桿菌繁殖及毒素產(chǎn)生的作用。結(jié)核桿菌對鏈霉素的耐藥性產(chǎn)生迅速，宜與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合應(yīng)用。硫酸鏈霉素硫酸鏈霉素為一種氨基糖苷類抗生素藥品。注射用硫酸鏈霉素的效價測定查閱中國藥典確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)實驗準(zhǔn)備

注射用硫酸鏈霉素的效價測定超凈工作臺、抑菌圈面積測量分析儀、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平（萬分之一或十萬分之一）、水平儀、游標(biāo)卡尺（精密度為0.02mm)儀器用具玻璃雙碟：內(nèi)徑約90mm，高16～17mm的硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，水平透明，無色斑氣泡（碟底平度檢查，將雙碟放在水平臺上，下墊一張白紙，碟內(nèi)加水2～3ml，再滴加藍墨水，觀察藍色深淺是否一致）陶瓦（圓)蓋：應(yīng)水平，無凹凸現(xiàn)象。注射用硫酸鏈霉素的效價測定磷酸鹽緩沖液（pH7.8)取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，濾過。不銹鋼小管（牛津杯）：內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，重量差異不超過±0.01g，光潔平坦其他用具：滴管、容量瓶、吸管、移液管、洗耳球、稱量瓶（配套蓋)、廢液缸、電爐子（帶石棉網(wǎng)）、溫度計、不銹鋼鍋等用具實驗準(zhǔn)備緩沖液的制備注射用硫酸鏈霉素的效價測定成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂20g蒸餾水1000mL

配制方法：將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2L，校正

pH至7.2～7.4。加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化。分裝在試管中，在

115℃滅菌30分鐘，做成試管斜面。成分：胨5g瓊脂15～20g牛肉浸出粉3g水1000ml磷酸氫二鉀3g配制方法：除瓊脂外，混合上述成分，調(diào)節(jié)pH使最終的pH值略高0.2～0.4，加入瓊脂，加

熱溶化后濾過，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃滅菌30分鐘。培養(yǎng)基制備——培養(yǎng)基Ι培養(yǎng)基制備——營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基實驗準(zhǔn)備注射用硫酸鏈霉素的效價測定

取枯草芽孢桿菌[CMCC（B)63501]的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營

養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在35~37℃培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30分鐘，備用。實驗準(zhǔn)備平衡稱量W=V·C/P稀釋平行制備枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)懸液標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的制備注射用硫酸鏈霉素的效價測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備室溫平衡后，用天平以減量法精密稱取30mg標(biāo)準(zhǔn)品（不得反復(fù)稱取)，

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)示效價單位加入稀釋液制成濃度一般為1000U/ml的

濃溶液，存于冰箱中各用。臨用時照表的規(guī)定進行稀釋，取上述1000U/ml的標(biāo)準(zhǔn)品濃溶液，用pH7.8磷酸鹽緩沖液

分2～3步稀釋，最終制成高劑量SH為1.4U/mL、低劑量SL為0.7U/mL的兩種鏈霉素溶液。作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。量取不得少于2ml，稀釋不得超過3次。實驗準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的制備注射用硫酸鏈霉素的效價測定供試品溶液的制備實驗準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的制備按鏈霉素樣品的標(biāo)示效價或原料藥的估計效價，精密稱(或量)取供試品適量，先用滅菌蒸餾水溶解或稀釋，再用pH7.8磷酸鹽緩沖液分2～3步稀釋，最終制成高劑量TH為1.4U/mL、低劑量TL為0.7U/mL的兩種鏈霉素樣品溶液。管碟法底層的制備加20ml融化的培養(yǎng)基。均勻攤布凝固待用注射用硫酸鏈霉素的效價測定菌層的制備制備菌層培養(yǎng)基（培養(yǎng)基+菌懸液)培養(yǎng)基（48-50度，不超過60度)加5ml菌層培養(yǎng)基均勻攤布，速度要快雙碟的制備注射用硫酸鏈霉素的效價測定管碟法放置小鋼管（牛津杯）雙碟冷卻等距均勻安置4個牛津杯靜置沉穩(wěn)5～10min注射用硫酸鏈霉素的效價測定管碟法滴加抗生素溶液雙碟≥4T或S的兩個濃度滴在對角位置滴加順序SH→TH→SL→TL劑距2：1或4：1覆蓋陶瓦蓋注射用硫酸鏈霉素的效價測定管碟法測量抑菌圈培養(yǎng)水平疊放雙碟數(shù)≤三層35～37℃將培養(yǎng)好的雙碟取出。將鋼管倒入消毒液中，換上玻璃蓋，按批號排好。檢查抑菌圈是否完整，如不完整，棄去該碟。注射用硫酸鏈霉素的效價測定

測量并記錄抑菌圈的大小用游標(biāo)卡尺或抑菌圈測量儀測量各抑菌圈的直徑或面積，將測量結(jié)果填寫在原始記錄上。統(tǒng)計處理、可靠性測驗、FL%、效價計算。管碟法測量抑菌圈課堂小結(jié)注射用硫酸鏈霉素效價測定過程：準(zhǔn)備儀器用具，配制緩沖液、培養(yǎng)基、菌懸液、標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液→雙碟的制備→滴加抗生素→培養(yǎng)→測量抑菌圈和效價計算《藥品生物檢定技術(shù)》項目六

酶類藥物的生物活性檢定基礎(chǔ)知識胃蛋白酶的活力測定目錄項目六

酶類藥物的生物活性檢定基礎(chǔ)知識20世紀(jì)60年代，DeDuve就提出酶類藥物是替代治療遺傳缺陷病的一種可行方式。1987年，第一種重組酶類藥物activasel誕生，由FDA批準(zhǔn)，用于治療由冠狀動脈阻塞引起的心臟病，標(biāo)志著酶類藥物新時代的到來。國內(nèi)生產(chǎn)品種也從原來的十幾種發(fā)展到現(xiàn)有的百余種。一、酶類藥物概述1.助消化酶類2.蛋白水解酶類3.凝血酶及抗栓酶4.抗腫瘤酶類5.其他酶類酶類藥物的主要種類如下基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識1.蛋白質(zhì)顯色反應(yīng)

酶類藥物分子中與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，能在堿性溶液中與銅離子結(jié)合生成藍紫色或紫紅色化合物。例如，《中國藥典》(2020年版)中對門冬酰胺酶的鑒別：取5mg/mL的供試品溶液，加入20%的氫氧化鈉溶液5mL，搖勻后再加入1%的硫酸銅溶液1滴，搖勻，溶液應(yīng)顯藍紫色。二、酶類藥物鑒別基礎(chǔ)知識2.酶活性試驗 某些酶類藥物能與特異性底物反應(yīng)，這些特異性生化反應(yīng)可用于相應(yīng)酶類藥物的鑒別。如抑肽酶能抑制胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶、糜胰蛋白酶等酶的活性，利用這一特性，可通過檢測胰蛋白酶活性是否受到抑制而鑒別抑肽酶：胰蛋白酶能專一地作用于對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯的酯鍵，生成的水解產(chǎn)物使甲基紅-亞甲藍試液變成紫紅色，有抑肽酶存在時，因胰蛋白酶的活性受抑制，上述水解反應(yīng)無法完成，則試液不顯紫紅色?！吨袊幍洹?2020年版)中即采用此法鑒別抑肽酶：取抑肽酶與胰蛋白酶溶液（均為1mg/mL)各10uL置點滴板上，充分混勻，加對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽試液0.2mL，放置數(shù)分鐘后，應(yīng)不顯紫紅色；而以胰蛋白酶溶液10μL作對照，同法操作，應(yīng)顯紫紅色?；A(chǔ)知識3.沉淀試驗 某些酶遇到某種有機酸或重金屬鹽溶液，即出現(xiàn)沉淀反應(yīng)。如胃蛋白酶水溶液中加入5%鞣酸或25%氯化鋇溶液，即生成沉淀。4.動物試驗 利用動物體內(nèi)某些指標(biāo)或特征的變化進行鑒定。如可以通過在動物皮內(nèi)注射玻璃酸酶，觀察其對染色劑亞甲藍在皮內(nèi)的擴散和吸收情況的影響，對其進行鑒定?；A(chǔ)知識5.標(biāo)準(zhǔn)品對照法

將待測供試品與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品以同法測定，通過對照比較測定結(jié)果而進行鑒別。如《中國藥典》(2020年版)中采用高效液相色譜法對抑肽酶進行鑒別，要求供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致?；A(chǔ)知識現(xiàn)在生產(chǎn)的酶類藥物多為生化產(chǎn)品和微生物發(fā)酵產(chǎn)品，在生產(chǎn)過程中可能帶入微量的脂肪類物質(zhì)、其他的酶類和大分子雜質(zhì)，這些雜質(zhì)能影響酶的質(zhì)量，因此需檢查雜質(zhì)含量限度。

1.

脂肪含量限度檢查

一些從動物臟器提取制備的酶類藥物，在生產(chǎn)過程中可能會帶入微量的脂肪類物質(zhì)，需要對產(chǎn)品進行脂肪含量限度檢查。如《中國藥典》(2020年版)中要求每1.0g胰酶產(chǎn)品中的脂肪含量不得超過20mg,每1.0g胰激肽原酶產(chǎn)品中的脂肪含量不得超過5mg。

三、酶類藥物檢查基礎(chǔ)知識

2.

其他酶類含量限度檢查

在胰蛋白酶中需要檢查糜蛋白酶的含量，而糜蛋白酶中也需要檢查胰蛋白酶的含量。如《中國藥典》(2020年版)中利用糜蛋白酶專屬性水解芳香氨酸(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸)的羧基形成的肽鍵、酰胺鍵和酯鍵的特性，以N-乙酰-L-酪氨酸乙酯為底物，通過分光光度法測定水解速率，進而測定糜蛋白酶的含量限度，要求每2500U胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。基礎(chǔ)知識

3.大分子活性物質(zhì)含量限度檢查

在提取分離酶類藥物的過程中，可能會引入一些目標(biāo)產(chǎn)物以外的、具有活性的生物大分子物質(zhì)，需要對這些大分子活性物質(zhì)進行限度檢查。如尿激酶是從新鮮人尿中提取的一種能激活纖維蛋白溶酶原的堿性蛋白水解酶，由于人尿中含有一些凝血質(zhì)樣活性物質(zhì)，可能影響血栓病患者的使用，還會增加并發(fā)腦血栓的意外風(fēng)險。因此，應(yīng)對尿激酶產(chǎn)品中的凝血質(zhì)樣活性物質(zhì)進行最低安全限量控制?！吨袊幍洹?2020年版)規(guī)定，凝血質(zhì)樣活性為零值時的尿激酶供試品酶活力，按每1mL供試品溶液的單位表示，每1mL應(yīng)不得少于150U。基礎(chǔ)知識

（一）酶的活力單位

酶的活力單位用以量度酶活力的大小，用U表示。①“國際單位(IU)”,規(guī)定在最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量為一個活力單位，即1IU=1μmol/min；②“Katal(即Kat)”,規(guī)定在最適反應(yīng)條件下，每秒催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量為一個Kat單位，即1Kat=1mol/L。

1Kat=60×106IU1IU=16.67×10-9Kat四、酶類藥物活力測定基礎(chǔ)知識

（二）酶活力測定的原理

進行酶法分析時，第一步是進行酶促反應(yīng)，即將酶與相應(yīng)底物接觸，并在適當(dāng)條件下（溫度、pH等）進行催化反應(yīng)；第二步是測定酶促反應(yīng)前后的物質(zhì)變化情況，如檢測底物的減少量、產(chǎn)物的增加量、輔酶的變化量等。

1.終點法

（1）單酶反應(yīng)定量法 a.底物減少量的測定；b.產(chǎn)物增加量的測定；c.輔酶變化量的測定。

（2）和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法基礎(chǔ)知識

2.反應(yīng)速度法

（1）一般反應(yīng)速度測定法：利用反應(yīng)速度法可測定底物、輔酶或抑制劑的含量。

（2）特殊的反應(yīng)速度測定法：通過第三種指示劑酶的反應(yīng)速度就可計算出待測物質(zhì)的量。

3.酶循環(huán)放大分析法

酶循環(huán)放大分析法仍然利用酶對底物的專一性，使微量的底物“增幅放大”以達到定量分析目的?；A(chǔ)知識

（三）酶活力測定的方法

按酶法分析方法測定酶活性時，需要跟蹤酶促反應(yīng)中某一反應(yīng)底物或產(chǎn)物的濃度隨時間發(fā)生的變化量（速度法），或測量酶促反應(yīng)中反應(yīng)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量（終點法）?？舍槍δ承┮子跍y定的酶促反應(yīng)底物或產(chǎn)物（如H+、OH-、ATP、CO2、H2O2等）選擇具體的檢測方法，包括容量分析法、氣體檢測法、分光光度法、黏度測定法等?；A(chǔ)知識

1.容量分析法

若酶促反應(yīng)中，反應(yīng)底物或產(chǎn)物之一具有特定電化學(xué)性質(zhì)，可以采用相應(yīng)的某種已知準(zhǔn)確濃度的試劑溶液（滴定液）對其進行滴定，直到所加的滴定液與被測的反應(yīng)底物或產(chǎn)物按化學(xué)計量關(guān)系完全反應(yīng)為止，然后根據(jù)消耗的滴定液的濃度和用量，計算出反應(yīng)底物或產(chǎn)物的含量，進而推算出酶的活力。

2.氣體檢測法

若酶促反應(yīng)能產(chǎn)生氣體，可以將生成氣體的變化量作為檢測指標(biāo)，計算酶的活力?；A(chǔ)知識

3.分光光度法

若酶促反應(yīng)中，反應(yīng)底物或產(chǎn)物之一由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，其吸光度的強度發(fā)生變化，可以通過測定該酶促反應(yīng)系統(tǒng)的吸光度的變化量，推算出酶的活力。

4.黏度測定法

若酶促反應(yīng)中，反應(yīng)產(chǎn)物或底物之一具有某種可以指示反應(yīng)變化的物理特性，也可利用其物理特性的改變來測定酶的活力。胃蛋白酶的活力測定胃蛋白酶(pepsin)是一種消化性蛋白酶，由胃中的胃黏膜主細胞所分泌，功能是將食物中的蛋白質(zhì)分解為小肽。胃蛋白酶不是由主細胞直接生成的，主細胞分泌的是胃蛋白酶原，胃蛋白酶原在pH1.5~5.0胃酸條件下被活化成胃蛋白酶。胃蛋白酶作用的主要部位是芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵，將蛋白質(zhì)分解為小肽，而且一部分被分解為酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。胃蛋白酶的活力測定

用血紅蛋白作為底物，在規(guī)定的試驗條件下，利用胃蛋白酶催化水解血紅蛋白生成水解產(chǎn)物（小肽及酪氨酸等氨基酸），準(zhǔn)確反應(yīng)一定時間。在一定范圍內(nèi)，其反應(yīng)后溶液的紫外吸光度與胃蛋白酶的活力成一定比例，同時用酪氨酸作對照品，計算胃蛋白酶的活力單位。一、胃蛋白酶活力測定原理胃蛋白酶的活力測定1.試劑

（1）鹽酸溶液取1mol/L鹽酸溶液65mL,用水稀釋至1000mL。

（2）血紅蛋白試液取牛血紅蛋白1.0g,加鹽酸溶液溶解并稀釋至100mL。

（3）5%三氯醋酸溶液取三氯醋酸5.0g,加水溶解并稀釋至100mL。

2.對照品溶液的制備

精密稱取酪氨酸對照品適量，加上述鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1mL中含0.5mg的溶液。3.供試品溶液的制備

取樣品適量，精密稱定，加上述鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1mL中含0.2~0.4單位的溶液。二、胃蛋白酶效價測定操作過程胃蛋白酶的活力測定

4.測定法取試管6支，其中3支各精密加入對照品溶液1mL，另3支各精密加入供試品溶液1mL，置37℃±0.5℃水浴中，保溫5min,精密加入預(yù)熱至37℃±0.5℃的血紅蛋白試液5mL,搖勻并準(zhǔn)確計時，在37℃±0.5℃水浴中反應(yīng)10min,立即精密加入5%三氯醋酸溶液5mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。另取試管2支，各精密加入血紅蛋白試液5mL,置37℃±0.5℃水浴中保溫10min,再精密加入5%三氯醋酸溶液5mL，其中1支加供試品溶液1mL，另1支加上述鹽酸溶液1mL,搖勻，濾過，取續(xù)濾液，分別作為供試品和對照品的空白對照，在275nm的波長處測定吸光度，算出平均值A(chǔ)s和A。胃蛋白酶的活力測定

5.注意事項

（1）酶的催化活性受溫度的影響很大，要嚴格控制胃蛋白酶效價測定溫度為37℃±0.5℃。

（2）胃蛋白酶活力測定是在單位時間內(nèi)進行計算的，所以在測定過程中對時間的控制要非常準(zhǔn)確，在精密加入血紅蛋白試液開始反應(yīng)時或在精密加入三氯醋酸溶液終止反應(yīng)時，每支試管之間的時間間隔可控制在20s左右，也可根據(jù)操作者的熟練程度控制一定的時間間隔。

（3）配制三氯醋酸溶液時，戴上塑料手套或乳膠手套，佩戴防塵口罩，以避免吸入三氯醋酸粉塵引起呼吸道的刺激，或者粘到手上引起皮膚灼傷。項目六

酶類藥物的生物活性檢定THANKS謝謝觀看《藥品生物檢定技術(shù)》項目七

其他藥物生物活性檢定生物檢定法是利用生物體包括整體動物、離體組織、器官、細胞和微生物等評估藥物生物活性的一種方法。它以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗設(shè)計在一定條件下比較供試品和與其相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌匪a(chǎn)生的特定反應(yīng)，通過等反應(yīng)劑量間比例的運算或限值劑量引起的生物反應(yīng)程度，測定供試品的效價、生物活性或雜質(zhì)引起的毒性。生物反應(yīng)類型藥物對生物體所引起的反應(yīng)，隨著藥物劑量的增加，產(chǎn)生的量變可以測量。如血壓值、血凝時間值、血糖值等。直接測得藥物對各個動物最小效量或最小致死量的檢定方法。四參數(shù)回歸計算法生物活性檢定方法藥物對生物體所引起的反應(yīng)隨著藥物劑量的增加產(chǎn)生的量變可以測量者，稱量反應(yīng)。量反應(yīng)檢定用平行線測定法，要求在一定劑量范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品(S)和供試品(T)的對數(shù)劑量x和反應(yīng)或反應(yīng)的特定函數(shù)y呈直線關(guān)系，當(dāng)S和T的活性組分基本相同時，兩直線平行。給藥后，觀察某一反應(yīng)的某一程度出現(xiàn)與否。如是否死亡、是否驚厥，實驗動物發(fā)生的是質(zhì)的變化。質(zhì)反應(yīng)量反應(yīng)直接測定法量反應(yīng)平行線測定法肝素洋地黃胰島素破傷風(fēng)毒素狂犬病免疫球蛋白人白介素-2常見藥物的生物檢定胰島素的生物活性檢定胰島素胰島素是胰島B細胞分泌的一種促進合成代謝的蛋白質(zhì)激素，在調(diào)節(jié)機體糖代謝、脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝方面有重要作用，是維持血糖在正常水平的主要激素之一。1921年首次從牛胰島中分離出胰島素1922年用于臨床治療糖尿病我國1965首次成功合成牛胰島素結(jié)晶胰島D細胞（分泌生長素）胰島素的生物活性檢定藥用品胰島素的制備方法動物源胰島素基因工程DNA重組技術(shù)半合成法合成胰島素的特點種屬特異性免疫原性非預(yù)期的多向性活性胰島素的生物活性檢定胰島素的生物活性檢定特異性高靈敏度高重現(xiàn)性好回收率高線性范圍寬胰島素測定方法標(biāo)準(zhǔn)胰島素的生物活性檢定檢定標(biāo)準(zhǔn)胰島素的生物活性檢定《美國藥典》（XXΙ版）、《日本藥典》（XΙ版）均采用兔血糖法?！队幍洹?1988年版)規(guī)定可用家兔或小鼠血糖降低法或小鼠驚厥法。《中國藥典》（1963年版、1977年版、1985年版)均采用小鼠驚厥法，

此法為質(zhì)反應(yīng)?！吨袊幍洹纷?990年版后改為小鼠血糖法，并沿用至今。胰島素測定方法胰島素的生物活性檢定本法系比較胰島素標(biāo)準(zhǔn)品（S）與供試品（T）引起小鼠血糖下降的作用，以測定供試品的效價。小鼠血糖法一、溶液配制1、0.1mol/L枸櫞酸緩沖液（pH6.6）2、POD氧化酶試劑3、5%三氯乙酸溶液4、1%草酸鉀溶液5、pH2.5生理鹽水6、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液7、標(biāo)準(zhǔn)品溶液與稀釋液8、供試品溶液與稀釋液小鼠血糖法胰島素的生物活性檢定標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的制備精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液，按高低劑量組ds2，ds1加0.9%氯化鈉溶液（pH2.5）制成兩種濃度的稀釋液，高、低劑量的比值（r）不得大于1∶0.5。小鼠血糖法胰島素的生物活性檢定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取胰島素標(biāo)準(zhǔn)品適量，按標(biāo)示效價加入0.9%的氯化鈉溶液（每100mL中含有苯酚0.2g并用鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.5），使溶解成每1mL中含20單位的溶液，4～8℃貯存，

以不超過5天為宜。注意：高濃度稀釋液一般可制成每1ml中含0.06～0.12單位，調(diào)節(jié)劑量使低劑量能引起血糖明顯下降，高劑量不致引起血糖過度降低，高低劑量間引起的血糖下降有明顯差別。按供試品的標(biāo)示量或估計效價（AT），照標(biāo)準(zhǔn)品溶液與其稀釋液的制備法制成高、低兩種濃度的稀釋液，其比值（r）應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品相等，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品高、低劑量所致的反應(yīng)平均值應(yīng)相近。供試品溶液與稀釋液的制備小鼠血糖法胰島素的生物活性檢定二、實驗動物健康合格、同一來源、同一性別、出生日期相近的成年小鼠40只，體重相差不得超過3g小鼠按體重隨機等分成4組，每組不少于10只，逐只編號，實驗前按體重分盒放置。小鼠血糖法胰島素的生物活性檢定三、檢定方法1.給藥第一次給藥，按表中順序給小鼠頸下注射標(biāo)準(zhǔn)品和公示品溶液0.2～0.3ml/只，各鼠的注射體積（ml）應(yīng)相等。小鼠血糖法胰島素的生物活性檢定2.取血樣注射后40分鐘，按給藥順序分別自眼靜脈叢采血，血液自然地落于凝集盤中。微量取樣器精密量取血液0.06ml，按編號加入預(yù)先盛有5%三氯乙酸的小試管中搖勻。取血后的動物迅速用脫脂棉輕壓上口止血。每組動物采血后回復(fù)供給飼料和飲水。小鼠血糖法胰島素的生物活性檢定將小試管放入離心機管架中，2500r/min離心15min后取出。精密量取上清液0.20ml，放入相應(yīng)編號的另一套小試管中。另取小試管5支，編號，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液0mg/ml、

5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml，各管0.20ml。將各管分別準(zhǔn)確加入葡萄糖氧化酶試劑2.0ml，混勻。小管同時放入（37.0±0.5)℃恒溫水浴，保溫30min取出，放置至室溫。按分光光度法，于550nm波長處測定各管的吸收度。小鼠血糖法胰島素的生物活性檢定3.測血糖值葡萄糖氧化酶-過氧化酶法4.交叉實驗在第一次給藥后間隔至少3h進行。交叉實驗除給藥順序不同外，操作與第一次實驗相同。小鼠血糖法胰島素的生物活性檢定5.實驗結(jié)果計算照生物檢定統(tǒng)計法（通則1431)中量反應(yīng)平行線測定雙交叉設(shè)計法計算效價及實驗誤差。本法的可信限率（FL%)不得大于25%。小鼠血糖法胰島素的生物活性檢定課堂小結(jié)胰島素效價測定（小鼠血糖法）：配制緩沖溶液、實驗動物的準(zhǔn)備、標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液的配制→小鼠給藥和采血方法→實驗數(shù)據(jù)測定和記錄→效價計算破傷風(fēng)抗毒素的生物活性檢定破傷風(fēng)抗毒素是由破傷風(fēng)類毒素免疫馬所得的血漿，經(jīng)胃酶消化后純化制成的液體抗毒素球蛋白制劑，用于預(yù)防和治療破傷風(fēng)梭菌引起的感染。破傷風(fēng)抗毒素(TAT)源自馬血，含異種蛋白，具抗原性，嚴重者可導(dǎo)致過敏性休克。注射破傷風(fēng)抗毒素前必須做皮膚過敏試驗。破傷風(fēng)毒素破傷風(fēng)桿菌破傷風(fēng)抗毒素的生物活性檢定檢定標(biāo)準(zhǔn)破傷風(fēng)抗毒素的生物活性檢定小鼠試驗法依據(jù)抗毒素能中和毒素的作用，將供試品與標(biāo)準(zhǔn)品進行對比試驗，推算出每1mL供試品中所含抗毒素的國際單位數(shù)(IU/mL)。破傷風(fēng)抗毒素的生物活性檢定2、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備破傷風(fēng)抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品用硼酸鹽緩沖鹽水稀釋至每1mL含0.5IU，即與毒素等量混合后每0.4mL注射量中含1/10IU?？苟舅貥?biāo)準(zhǔn)品原倍溶液的1次吸取量應(yīng)不低于o.5mL。小鼠試驗法1、試劑準(zhǔn)備硼酸鹽緩沖鹽水：稱取氯化鈉8.5g、硼酸4.5g、四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O)0.5g，加水溶解并稀釋至1000mL，過濾，滅菌后pH為7.0～7.2。注意使用干燥毒素時，須精密稱定,每次稱取量應(yīng)不低于10mg。毒素溶解后應(yīng)一次用完。剩余的干燥毒素應(yīng)封存于裝有干燥劑的真空器皿中，亦可用干燥毒素制成液體毒素即干燥毒素以0.85%～0.90%氯化鈉溶液溶解，與中性甘油(經(jīng)116℃、10分鐘滅菌)等量混合，每1mL至少含20個試驗量。毒素應(yīng)保存于2～8℃避光處。破傷風(fēng)抗毒素的生物活性檢定小鼠試驗法2、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備破傷風(fēng)毒素的稀釋毒素用硼酸鹽緩沖鹽水稀釋至每1mL含5個試驗量(1/10L+)，即與抗毒素等量混合后每0.4mL注射量中含1個試驗量(1/10L+)。試驗用的毒素須以國家藥品檢定機構(gòu)頒發(fā)的抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確標(biāo)定其試驗量(1/10L+)，并須每3個月復(fù)檢1次。3、供試品溶液的制備用硼酸鹽緩沖鹽水將供試品稀釋成數(shù)個稀釋度,使每1mL含抗毒素約0.5IU，即與毒素等量混合后每0.4mL注射量中含抗毒素約1/10IU。稀釋度的間隔約為5%。破傷風(fēng)抗毒素的生物活性檢定小鼠試驗法破傷風(fēng)抗毒素的生物活性檢定小鼠試驗法4、測定法定量吸取稀釋后的抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液及不同稀釋度的供試品溶液，分別加入小試管中，每管加入等量的稀釋毒素溶液，混合均勻，加塞，37℃結(jié)合1小時后立即注射。

(1)于17～19g小鼠腹部或大腿根部皮下注射0.4mL，應(yīng)注意勿使注射液流出，標(biāo)準(zhǔn)品及供試品的每個稀釋度各注射小鼠至少3只。破傷風(fēng)抗毒素的生物活性檢定小鼠試驗法破傷風(fēng)抗毒素的生物活性檢定小鼠試驗法4、測定法(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液不得用同一支注射器注射。同一供試品的不同稀釋度溶液可用同一支注射器注射。

(3)由高稀釋度向低稀釋度依次注射。注意：在更換稀釋度時應(yīng)用下一稀釋度溶液洗2～3次。(4)每日上、下午至少觀察試驗小鼠1次，連續(xù)5天，并記錄其發(fā)病及死亡情況。破傷風(fēng)抗毒素的生物活性檢定小鼠試驗法5、結(jié)果判定與統(tǒng)計對照小鼠應(yīng)于72～120小時內(nèi)全部死亡。供試品的效價為與對照小鼠同時死亡或出現(xiàn)破傷風(fēng)神經(jīng)毒癥狀最重者的最高稀釋度。有下列情況之一者應(yīng)重試:(1)供試品的稀釋度過高或過低；

(2)對照試驗小鼠在72小時前或120小時后死亡；

(3)死亡不規(guī)則以及在同一稀釋度的小鼠中有2只以上屬非特異死亡?？袢∶庖咔虻鞍资且环N向人類注射的狂犬病疫苗，以產(chǎn)生足夠量的抗狂犬病病毒抗體，即免疫球蛋白。這種抗體可以再次從人的血清中提取，對狂犬病病毒有直接的中和作用。狂犬病免疫球蛋白的生物活性檢定免疫球蛋白分子的基本結(jié)構(gòu)狂犬病免疫球蛋白狂犬病免疫球蛋白的生物活性檢定檢定標(biāo)準(zhǔn)狂犬病免疫球蛋白的生物活性檢定依據(jù)供試品中狂犬病免疫球蛋白能中和狂犬病病毒的作用，將供試品和標(biāo)準(zhǔn)品做系列稀釋，分別與狂犬病病毒懸液混合，感染敏感細胞，在規(guī)定的時間內(nèi)用熒光抗體染色并觀察熒光灶減少的情況，以測定供試品效價。

原理：基于熒光抗體技術(shù)的抗原抗體反應(yīng)。快速熒光灶抑制試驗法(RFFIT)狂犬病免疫球蛋白的生物活性檢定1.含5%新生牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基2.含10%新生牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基3.磷酸鹽緩沖液(PBS)4.80%冷丙酮5.80%甘油6.0.25%胰蛋白酶EDTA7.FITC標(biāo)記的狂犬病病毒核蛋白抗體按使用說明書要求稀釋到工作濃度?？焖贌晒庠钜种圃囼灧?RFFIT)試劑準(zhǔn)備狂犬病免疫球蛋白的生物活性檢定取含5%新生牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基，加入抗生素，使其終濃度為100U/mL抗生素，并加入谷氨酰胺，使其終濃度為0.03%，并按DMEM說明書要求加入適量NaHCO3，調(diào)pH至7.6。臨用前配制。取含10%新生牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基,加入抗生素，使其終濃度為100U/mL抗生素，并加入谷氨酰胺,使其終濃度為0.03%，并按DMEM說明書要求加入適量NaHCO3，調(diào)pH至7.6。臨用前配制。快速熒光灶抑制試驗法(RFFIT)2.含10%新生牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基1.含5%新生牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基狂犬病免疫球蛋白的生物活性檢定稱取磷酸二氫鉀0.24g、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)1.44g、氯化鈉8g，加水溶解并稀釋至1000mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.2。臨用前配制。量取80mL甘油,加入20mL水中，混勻，加蓋后于4℃保存。量取80mL丙酮，加入0.1mol/LPBS(pH7.6)20mL，混勻后密封，于4℃保存?？焖贌晒庠钜种圃囼灧?RFFIT)4.80%冷丙酮3.磷酸鹽緩沖液(PBS)5.80%甘油BSR細胞的培養(yǎng)：?培養(yǎng)條件?：使用75cm2方瓶，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，待細胞鋪滿單層。?消化處理?：加入5ml消化液（如

胰蛋白酶

），37℃孵育5-10分鐘至細胞脫落，隨后用

DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度（如1×10?cells/ml）?？袢∶庖咔虻鞍椎纳锘钚詸z定快速熒光灶抑制試驗法(RFFIT)狂犬病免疫球蛋白的生物活性檢定快速熒光灶抑制試驗法(RFFIT)1.病毒懸液的制備取CVS-11毒種(一般為凍干毒種)做適當(dāng)稀釋，以0.1mol的感染量接種生長良好的BSR細

胞，于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)1天后轉(zhuǎn)入34℃繼續(xù)培養(yǎng)，2天后收集培養(yǎng)上清液，

于4℃以每分鐘4000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除細胞碎片，取上清液加入10%新生牛血清，混后

分裝小管，-70℃以下凍存?zhèn)溆谩Ｖ泻陀貌《镜闹苽淇袢∶庖咔虻鞍椎纳锘钚詸z定快速熒光灶抑制試驗法(RFFIT)中和用病毒的制備病毒液的預(yù)滴定取凍存的病毒懸液1支，經(jīng)流水速融后，取100μL病毒液加入400μL含10%滅能新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，充分混勻后，在24孔培養(yǎng)板上從1∶5開始做5倍系列稀釋。每個稀釋度取50μL轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板，每個稀釋度平行做2份，每孔再加入5×106

個/mL的BSR細胞懸液50μL，于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24小時。狂犬病免疫球蛋白的生物活性檢定快速熒光灶抑制試驗法(RFFIT)中和用病毒的制備病毒液的預(yù)滴定培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，PBS洗1遍，再加入80%冷丙酮，每孔50μL，4℃固定30分鐘或-30℃固定10分鐘，棄丙酮。待揮發(fā)干燥后每孔加入50μL工作濃度的FITC標(biāo)記的狂犬病病毒核蛋白抗體染色，于37℃孵育30分鐘，用PBS洗3遍，甩干，每孔加80%甘油50μL。于熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)每孔中的熒光灶數(shù)，取每孔熒光灶數(shù)在30以下的孔，記錄相鄰4孔熒光灶數(shù)，取其平均值。狂犬病免疫球蛋白的生物活性檢定快速熒光灶抑制試驗法(RFFIT)中和用病毒的制備病毒滴度(FFU/mL)=(最高稀釋倍數(shù)孔熒光灶平均值×5+相鄰孔稀釋倍數(shù)較低的熒光灶平均值)/2×稀釋倍數(shù)較低孔病毒稀釋倍數(shù)×20狂犬病免疫球蛋白的生物活性檢定2.中和用病毒液的制備

取病毒懸液1支，按病毒液的預(yù)滴定同法操作。在熒光顯微鏡下計數(shù)每孔中的熒光灶比例，以80%～95%的細胞被病毒感染的病毒稀釋度為中和試驗用病毒稀釋度。取凍存的病毒懸液1支，經(jīng)流水融化后,用含5%滅能新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液將病毒稀釋至中和試驗用病毒稀釋度，置冰浴備用?？焖贌晒庠钜种圃囼灧?RFFIT)中和用病毒的制備中和用病毒滴度不得小于106FFU/mL。病毒稀釋時，應(yīng)盡可能在冰浴中進行?？袢∶庖咔虻鞍椎纳锘钚詸z定快速熒光灶抑制試驗法(RFFIT)狂犬病免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品由國家藥品檢定機構(gòu)提供，或用經(jīng)國家藥品檢定機構(gòu)標(biāo)定的工作用標(biāo)準(zhǔn)品。配制方法按使用說明書進行。用含10%滅能新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液將狂犬病免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品做3倍系列稀釋，即在96孔培養(yǎng)板中每孔預(yù)先加入100μL培養(yǎng)液