甘薯脫毒試管苗培養(yǎng)及快繁技術(shù)Cultivationandfastpropa2019-01-01實(shí)施新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的規(guī)則編制。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇徐州甘薯研究中心、新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：周志林、唐君、劉恩良、金平、趙冬蘭、徐其江、曹清河、高海峰、張安、聶石輝、陳傳信、梅宇、李強(qiáng)、王仙、李瓊詩(shī)。工11范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了甘薯脫毒試管苗培養(yǎng)及快繁技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、甘薯試管苗培養(yǎng)、脫毒試管苗檢測(cè)、脫毒試管苗快繁及甘薯脫毒試管苗的利用要求、病毒檢測(cè)、脫毒試管苗快繁各環(huán)節(jié)操作規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于全疆各甘薯產(chǎn)區(qū)，甘薯脫毒種薯(苗)生產(chǎn)前期，甘薯脫毒試管苗的培養(yǎng)和快繁。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。NY/T402脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1200-2006甘薯脫毒種薯3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用本文件。外植體Implants外植體是指在組織培養(yǎng)時(shí)，第一次接種用的植物材料。在本技術(shù)中，特指在甘薯生產(chǎn)上具有推廣應(yīng)用價(jià)值的品種。脫毒試管苗Detoxictesttubeseedlings利用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的再生試管苗，經(jīng)硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(NCM-ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)3種檢測(cè)方法，確認(rèn)不含甘薯羽狀斑駁病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)、甘薯潛隱病毒(Sweet甘薯G病毒(SweetpotatovirusG,SPVG)、甘薯病毒2(Sweetpotatovirus2,SPV2)、甘薯褪綠斑病毒(Sweetpotatochloroticfleckvirus,SPCFV)、甘薯褪綠矮化病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus,SPCSV)和甘薯卷葉病毒(Sweetpotatoleafcurlvirus,SPLCV)等7種病毒的試管苗為脫毒試管苗。高級(jí)脫毒試管苗Advanceddetoxtesttubeseedlings用脫毒試管苗，經(jīng)試管快繁后獲得的脫毒試管苗株系，被認(rèn)定為高級(jí)脫毒試管苗。2脫毒試管苗和高級(jí)脫毒試管苗的病毒檢測(cè)程序和標(biāo)準(zhǔn)，參照NY/T402。4甘薯試管苗培養(yǎng)4.1培養(yǎng)基選擇甘薯莖尖培養(yǎng)基：常用基本培養(yǎng)基是MS(Murashige和Skoog)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上添加不同類型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。4.2培養(yǎng)基配制4.2.1母液配制和保存為方便基本培養(yǎng)基的配置，可先配制大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽母液、肌醇母液、維生素母液和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液五類，母液濃度為10倍～200倍，甚至1000倍的濃縮貯備液。配制好的母液需置于冰箱4℃中低溫保存。在配制培養(yǎng)基時(shí)，將其按照一定的比例進(jìn)行稀釋。母液具體配制方法見附錄A。4.2.2基本培養(yǎng)基配方甘薯莖尖分生組織培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基為MS(Murashige和Skoog)培養(yǎng)基，其具體配方和配制操作程序見附錄B。4.2.3甘薯莖尖一步誘導(dǎo)成苗培養(yǎng)基與快繁培養(yǎng)基配方4.2.3.1莖尖一步誘導(dǎo)成苗培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基+1mg/L～2mg/L6-BA+0.5mg/L～1mg/LTDZ+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉pH:5.84.2.3.2快繁培養(yǎng)基(適宜不同蔓長(zhǎng)特性甘薯品種的快繁最佳培養(yǎng)基):MS基本培養(yǎng)基+0.01mg/L~0.1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉pH:5.84.2.4培養(yǎng)基配制與分裝4.2.4.1根據(jù)母液倍數(shù)或濃度計(jì)算和吸取相應(yīng)量的各種母液和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)；同時(shí)分別計(jì)算和稱取瓊脂和蔗糖。4.2.4.2先將一定量的水(約為準(zhǔn)備配制培養(yǎng)基總量的1/2或2/3),放入容器中加熱，同時(shí)加入瓊脂，在加熱過程中不斷攪動(dòng)，使之溶化。4.2.4.3將按量取的母液加入溶化的瓊脂中，待充分溶解后加入蔗糖，當(dāng)糖溶解后，再加水定容至所需體積。然后根據(jù)培養(yǎng)容器進(jìn)行分裝，然后用鋁箔紙、棉塞、硅膠塞等封口以備高壓滅菌。4.2.4.4調(diào)整培養(yǎng)基的pH值，用1NHCL或1NNaOH,滅菌前調(diào)pH值5.8～6.0。4.2.5培養(yǎng)基滅菌與保存3保持15min～20min。對(duì)于操作器械、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、滅菌水等的消毒處理，可適當(dāng)延長(zhǎng)滅菌時(shí)間，值；時(shí)間太短，滅菌不充分，易污染。滅菌后的培養(yǎng)基，需要在常溫下放置3d,若沒有污染現(xiàn)象，說尖首先去除葉片，然后自來水(加洗滌劑)沖洗2min~3min(以輕度去除附著于材料表面的污物),然后加吐溫1mL～2mL(最理想的表面活性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的除污能力，亦可在表面滅菌時(shí)加入滅菌溶液，提高滅菌效果)洗滌2min~3min,最后流動(dòng)自來水沖洗1min～2min。瀝水后待用。將預(yù)處理的甘薯莖尖裝入100mL三角瓶(或100mL燒杯)中，先用70%乙醇浸泡30s,無菌水沖洗后；再用0.1%氯化汞，計(jì)時(shí)5min~8min,其間需要多次震蕩，以達(dá)到較好的滅菌效果。然后，倒出氯化汞溶液(需用棕色瓶收存),用無菌水沖洗3次~4次，不斷搖蕩，以去除殘余氯化汞，減少對(duì)分生組培養(yǎng)室內(nèi)溫度28℃±2℃,相對(duì)濕度50%以下，每天光照時(shí)間12h～16h,光照強(qiáng)45脫毒試管苗檢測(cè)5.1在莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)10d～20d后，觀察莖尖分生組織生長(zhǎng)情況，待莖尖分化植株再生后，每個(gè)再生植株為一個(gè)株系分別進(jìn)行擴(kuò)繁，當(dāng)每一個(gè)株系繁殖有5株以上時(shí)，即可進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)(ELISA)。具體檢測(cè)方法參照NY/T402。經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)后，對(duì)指定病毒檢測(cè)呈陽(yáng)性的株系予以汰除，保留脫毒的株系。5.2在未檢測(cè)前，每切一個(gè)株系，需對(duì)鑷子和剪刀(或解剖刀)進(jìn)行一次滅菌，防治病毒交叉感染。在莖尖脫毒培養(yǎng)的前期進(jìn)行血清學(xué)病毒檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是，可盡早汰除陽(yáng)性株系，快繁無病毒株系，同時(shí)可避免病毒交叉感染，提高試管脫毒苗的繁殖效率。6脫毒試管苗快繁6.1.1第一次快繁與檢測(cè)將經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)(NCM-ELISA)后不帶指定病毒的株系，于超凈工作臺(tái)中，將每個(gè)試管苗單株分別切取為1個(gè)~2個(gè)莖節(jié)段，接種于快繁培養(yǎng)基中，所用培養(yǎng)基請(qǐng)參照本技術(shù)4.2.3甘薯莖尖培養(yǎng)培養(yǎng)與快繁培養(yǎng)基配方。待脫毒苗株系切段快繁成苗10株以上時(shí)，每系取5株左右栽種到防蟲網(wǎng)室內(nèi)(土壤要為無病原土壤),一是指示植物嫁接的第二次病毒檢測(cè)，通過檢測(cè)再次汰除陽(yáng)性株系的試管苗株系；二是以同品種普通帶毒薯為對(duì)照，進(jìn)行優(yōu)良株系評(píng)選，選出既符合品種特性又高產(chǎn)的最優(yōu)株系，從而篩選出高級(jí)脫毒試管苗。6.1.2第二次快繁與檢測(cè)將高級(jí)脫毒試管苗在無菌條件下切成1個(gè)~2個(gè)葉節(jié)的莖段，接種于快繁培養(yǎng)基上，在28℃±2℃,相對(duì)濕度50%以下，每天光照時(shí)間12h～16h,光照強(qiáng)度20001x～30001x。離體培養(yǎng)條件下，30d左右即可長(zhǎng)成5片～7片葉大小的幼苗，可以進(jìn)入下一輪繼代培養(yǎng)。7甘薯脫毒試管苗的利用7.1煉苗移栽將快繁的高級(jí)脫毒試管苗，先在室內(nèi)打開瓶蓋，煉苗5d～7d,然后將試管苗用鑷子取出，洗凈根系附著的培養(yǎng)基，截?cái)噍^長(zhǎng)根系，去掉老葉和黃葉，然后用多菌靈溶液蘸根，移栽到無病原菌的營(yíng)養(yǎng)缽或營(yíng)養(yǎng)網(wǎng)畦中，同時(shí)對(duì)周圍環(huán)境也要進(jìn)行消毒和清潔。下午4點(diǎn)～5點(diǎn)后移栽試管苗，并保溫、保濕和遮光。7d～10d后可以緩苗，2周以后，去掉遮陽(yáng)網(wǎng)及塑料膜。7.2隔離種植為防止蚜蟲、粉虱傳病毒，需用40目以上的網(wǎng)紗隔離，且每隔15天噴灑一次殺蟲藥劑，以防蚜蟲、粉虱傳毒。保證脫毒試管苗在與病毒嚴(yán)密隔離的條件下栽培種植。防治蚜蟲、粉虱時(shí)，多種藥劑輪換使用，以免產(chǎn)生抗藥性，達(dá)不到防治效果。7.3甘薯脫毒試管苗培育、檢測(cè)程序甘薯脫毒試管苗培育和檢測(cè)程序見圖1。5商商品薯一代生產(chǎn)用種脫毒原種繁育脫毒原原種繁生產(chǎn)性能鑒定病毒嫁接檢測(cè)病毒血清檢測(cè)莖尖組織培養(yǎng)選擇優(yōu)良品種6(資料性附錄)母液配制要求A.1大量元素母液的配置：將各種藥品分別進(jìn)行稱量、加水充分溶解，因?yàn)镃a2+、SO?等離子在一起可能會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成沉淀；所以各種藥品依次混合；CaCl?最后加入混合液，邊加邊攪拌，因?yàn)樗械腃O?等物質(zhì)的存在會(huì)導(dǎo)致沉淀。配置母液的水必須是高純度的蒸餾水或重蒸水。A.2微量元素母液的配置：根據(jù)微量元素的用量，減少以后培養(yǎng)基配置的工作量，將微量元素母液的配置分為母液I(10×)和母液Ⅱ(100×);將各種藥瓶分別稱量并充分溶解后，依次混合。A.3鐵鹽母液的配置：MS培養(yǎng)基中的鐵鹽為硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸鈉的螯合物，所以將硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸鈉分別用溫水溶解，充分溶解后混合，呈金黃色溶液，充分?jǐn)嚢?10min~20min),螯合徹底，避免未螫合的硫酸亞鐵結(jié)晶的析出，配置的鐵鹽溶液，待冷卻至室溫后，貯存于棕色試劑瓶中，再將其放入冰箱冷藏。A.4肌醇母液的配置：稱取適量鐵鹽加水充分溶解后、定容，冷藏。A.5維生素母液的配置：直接用蒸餾水分別溶解，然后混合，貯存于棕色試劑瓶中A.6植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液的配置：A.6.1生長(zhǎng)素：IAA、NAA、2.4-D、IBA等應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1N的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。以后者效果好。A.6.2細(xì)胞分裂素：KT、ZT等，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇加3滴~4滴1mol/L的鹽酸溶解，或直接用1mol/LHCl溶解，再用蒸餾水定容。A.6.3赤霉素：以95%酒精或無水乙醇溶解。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中IAA、ZT、GA3等不耐高溫，需過濾滅菌；MS