T/CRHA017—2023

ICS11.100

CCSC04

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CRHA017—2023

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人肝祖細(xì)胞類器官構(gòu)建、質(zhì)量控制與保藏

操作指南

Guidelinesfortheestablishment，qualitycontrolandstorage

ofHumanhepaticprogenitorcellderivedorganoids

2023-07-14發(fā)布2023-08-01實(shí)施

中國(guó)研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)發(fā)布

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目次

前言...................................................................................................................................................II

引言.................................................................................................................................................III

1范圍...............................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件...........................................................................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義...................................................................................................................................1

4縮略語(yǔ)...........................................................................................................................................3

5基本原則.......................................................................................................................................3

6操作流程與方法...........................................................................................................................4

7檢測(cè)指標(biāo)與檢測(cè)方法...................................................................................................................7

附錄A（資料性）肝臟類器官培養(yǎng)用主要試劑材料與操作要點(diǎn).................................................9

附錄B（資料性）短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測(cè).........................................................................11

附錄C（資料性）染色體核型檢測(cè)...............................................................................................12

附錄D（資料性）肝臟類器官鑒定...............................................................................................13

附錄E（資料性）標(biāo)志基因檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法.............................................................17

參考文獻(xiàn)...........................................................................................................................................19

I

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人肝祖細(xì)胞類器官構(gòu)建、質(zhì)量控制與保藏操作指南

1范圍

本文件提供了人肝祖細(xì)胞類器官構(gòu)建、質(zhì)量控制和保藏的基本原則、操作流程方法以及檢測(cè)指標(biāo)與

檢測(cè)方法的指導(dǎo)與建議。

本文件適用于人肝祖細(xì)胞類器官的培養(yǎng)、傳代、儲(chǔ)存、復(fù)蘇和質(zhì)量控制。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T37864—2019生物樣本庫(kù)質(zhì)量和能力通用要求（ISO20387:2018）

GB/T38736—2020人類生物樣本保藏倫理要求

GB/T42060—2022醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室樣品采集、運(yùn)送、接收和處理指南（ISO/TS20658:2017）

WS233—2017病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

類器官organoids

類器官是干細(xì)胞、前體細(xì)胞和/或分化細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞間以及細(xì)胞-基質(zhì)間的互作而自發(fā)組織形成

的體外三維結(jié)構(gòu)，能在多個(gè)方面再現(xiàn)體內(nèi)相應(yīng)組織或器官的結(jié)構(gòu)與功能。

3.2

肝祖細(xì)胞liverprogenitorcells

一種卵圓形、高核質(zhì)比的細(xì)胞，位于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與匯管區(qū)交界的Hering’s管，從形態(tài)和體積上類似

于膽管上皮細(xì)胞，被認(rèn)為具有肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞雙向分化潛能。

3.3

3D細(xì)胞培養(yǎng)three-dimensionalcellculture

將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng),使細(xì)胞能夠在載體的三

維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長(zhǎng),構(gòu)成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合物。

1

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3.4

肝臟類器官培養(yǎng)基culturemediumofliverorganoids

用于提供體外模擬肝祖細(xì)胞生長(zhǎng)及分化所需微環(huán)境，能誘導(dǎo)肝臟祖細(xì)胞長(zhǎng)期體外擴(kuò)增培養(yǎng)，并向成

熟肝細(xì)胞分化，維持肝祖細(xì)胞及肝臟細(xì)胞特性，實(shí)現(xiàn)體外肝臟活組織類器官長(zhǎng)期存活的培養(yǎng)介質(zhì)。

3.5

3D培養(yǎng)基質(zhì)膠matrix

組成成分包括但不限于層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，添加物包括但不限于

生長(zhǎng)因子、小分子化合物和/或微量元素激素。在室溫條件下能夠聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，

模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)和功能，能夠?yàn)楦闻K上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支架。

3.6

類器官傳代passage

將培養(yǎng)至一定大小、狀態(tài)良好的類器官采用物理機(jī)械吹打或聯(lián)合酶消化方法使其解離為小細(xì)胞團(tuán)或

單細(xì)胞懸液，再重新接種于與原培養(yǎng)條件相同的培養(yǎng)體系內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行類器官培養(yǎng)。新一代類器官與原

來類器官具有相同的形態(tài)功能特征。

3.7

類器官凍存cryopreservation

將類器官解離成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸液后，加入凍存保護(hù)劑，通過程序降溫最終置于-196℃液氮中

低溫保存，使其暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，在需要的時(shí)候能夠通過復(fù)蘇用于試驗(yàn)的過

程。

3.8

類器官?gòu)?fù)蘇thawing

將處于深低溫凍存的類器官取出恢復(fù)其繼續(xù)生長(zhǎng)狀態(tài)的過程。

3.9

肝臟祖細(xì)胞分化differentiation

肝臟祖細(xì)胞逐漸產(chǎn)出形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、功能特征成熟肝細(xì)胞的過程。

3.10

知情同意informedconsent

2

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有自主判斷能力的供體或其法定監(jiān)護(hù)人，在獲得并充分了解樣本和數(shù)據(jù)捐贈(zèng)相關(guān)信息之后，供體所

受到的風(fēng)險(xiǎn)最小，且沒有受到任何利誘或恐嚇等不當(dāng)行為影響的前提下，自愿自主的捐贈(zèng)個(gè)人生物樣本

及其關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，并與采集者/收集者共同簽署的文件。

注：知情同意書由采集者/收集者和被收集者共同簽署，一式兩份。正本由采集者/收集者保存，被

收集者保存副本。

[來源：GB/T38736—2020]

3.11

類器官存活率organoidsviability

類器官保持活性的屬性（例如，新陳代謝活躍，具有增殖能力，有完整的三維結(jié)構(gòu)，或有能力恢復(fù)

這些功能）。

4縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

ALB——白蛋白（albumin）

CYP3A4——細(xì)胞色素蛋白P450酶3A4（CytochromeP4503A4）

DMSO——二甲基亞砜（DimethylSulfoxide）

DNA——脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

EpCAM——上皮細(xì)胞黏附蛋白（Epithelialcelladhesionmolecule）

H&E——蘇木精-伊紅（Hematoxylinandeosin）

HNF4α——肝細(xì)胞核因子同源框蛋白α（HNF4homeoboxα）

LGR5——亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5（LeucinerepeatGprotein-coupledreceptor5）

Ki67——細(xì)胞增殖蛋白

PBS——磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSaline）

SOX9——SRY基因（性別決定區(qū)域Y）9（SRY(sexdeterminingregionY)-box9）

STR——短串聯(lián)重復(fù)序列（shorttandemrepeat）

ZO-1——緊密連接蛋白1（zonulaoccluden1）

5基本原則

5.1簽署知情同意

應(yīng)在樣本采集前獲得類器官細(xì)胞源供者的書面的知情同意，明確供者和樣本收集方雙方的利益和責(zé)

任，知情同意的要求應(yīng)符合GB/T38736—2020中5.3的要求。

3

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5.2倫理要求

人肝祖細(xì)胞類器官的構(gòu)建和研究方案應(yīng)由倫理審查委員會(huì)審查通過。

5.3隱私保護(hù)

類器官細(xì)胞源供者享有個(gè)人隱私權(quán)，其個(gè)人隱私信息的保密和保護(hù)應(yīng)符合GB/T38736—2020中6的

要求。

6操作流程與方法

6.1肝祖細(xì)胞類器官構(gòu)建

6.1.1組織的獲取

肝移植供體肝臟組織，體積約5mm×5mm×5mm。新鮮組織應(yīng)在離體30min內(nèi)切取。

6.1.2組織的運(yùn)送

手術(shù)獲取的肝臟組織置于4℃保存的組織保存液（含2×雙抗的1640培養(yǎng)基），在4℃恒溫的低溫條

件下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。對(duì)運(yùn)輸過程的記錄符合GB/T37864—2019中A.3、B.3條，宜記錄的內(nèi)容包括但不限

于運(yùn)送方式、運(yùn)送過程中的溫度，接收時(shí)溫度或溫度范圍、運(yùn)送起止時(shí)間和日期。

6.1.3組織的處理

6.1.3.1組織的清洗

在超凈臺(tái)中將肝臟組織取出，用預(yù)冷的含1×雙抗的PBS緩沖液震蕩漂洗3次（超凈臺(tái)內(nèi)手動(dòng)搖晃培

養(yǎng)皿10s）。

6.1.3.2組織的消化

用手術(shù)刀片將漂洗后的肝臟組織機(jī)械解離成1mm3大小的組織塊，加入消化酶（含1mg/mL的IV型

膠原酶、30,000units/mL的DNaseI的混合液）37℃消化30min，用預(yù)冷PBS緩沖液離心漂洗2次（1000r/min,

3min）終止消化。

6.1.3.3細(xì)胞的過濾

離心后的細(xì)胞沉淀用1640培養(yǎng)基重懸后用70μm的篩網(wǎng)去除胞外基質(zhì)雜質(zhì)。

6.1.4類器官培養(yǎng)

采用機(jī)械加酶消化法將人肝臟組織分散為單個(gè)細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠混合后形成3D培

4

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養(yǎng)空間結(jié)構(gòu)，加入適用于肝臟上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的類器官培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)（EM）及分化培養(yǎng)（DM），

由此獲得具有肝臟祖細(xì)胞特性及成熟肝臟細(xì)胞功能的肝臟類器官。相關(guān)耗材和操作見附錄A。構(gòu)建流程

圖見圖1。

圖1肝祖細(xì)胞類器官構(gòu)建流程圖

6.1.5類器官的傳代與保藏

6.1.5.1類器官傳代

應(yīng)選擇合適的類器官進(jìn)行科學(xué)試驗(yàn)或傳代，一般為生長(zhǎng)1周左右，飽滿度達(dá)到80%左右，顯微鏡10

×下可看到超過20個(gè)類器官，或者大小100-200μm的類器官。培養(yǎng)傳代流程見圖2。

5

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圖2肝祖細(xì)胞類器官傳代流程圖

6.1.5.2類器官凍存

暫不使用的類器官應(yīng)按附錄A處理，加入凍存液后移入低溫環(huán)境凍存。

6.1.5.3類器官的復(fù)蘇

類器官?gòu)?fù)蘇遵循速融原則。使用37℃水浴令其盡快融化，選擇合適的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，見附

錄A。

6.2廢棄類器官處置

類器官構(gòu)建和傳代過程中產(chǎn)生的廢棄物處置應(yīng)符合國(guó)家或地方法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范要求，符合WS233

—2017中7.8條規(guī)定，對(duì)于不合格的或者污染的類器官細(xì)胞應(yīng)遵循法律和實(shí)驗(yàn)室規(guī)定丟棄到指定地點(diǎn)，

最終處置應(yīng)交由經(jīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)保部門資質(zhì)認(rèn)定的醫(yī)療廢物處理單位集中處置。同時(shí)應(yīng)由專人進(jìn)行書面記錄，

并存檔。

6.3操作注意事項(xiàng)

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樣本采集、運(yùn)送、處理以及類器官的構(gòu)建、傳代、凍存、復(fù)蘇等過程均應(yīng)無(wú)菌操作，以免污染。宜

符合GB/T42060—2022中附錄A要求，注意保持手衛(wèi)生的時(shí)間點(diǎn)包括但不限于接觸患者前、無(wú)菌操作前、

體液暴露后、接觸患者后、接觸試驗(yàn)環(huán)境后、試驗(yàn)結(jié)束后。

7檢測(cè)指標(biāo)與檢測(cè)方法

編號(hào)檢測(cè)指標(biāo)指標(biāo)描述強(qiáng)制/推薦檢測(cè)檢測(cè)方法

7.1形態(tài)光學(xué)顯微鏡下觀察人肝臟類器官，強(qiáng)制按照附錄D檢測(cè)。

應(yīng)具備邊緣清晰、折光性強(qiáng)的空心

單層細(xì)胞構(gòu)成的球形結(jié)構(gòu)，高倍鏡

下可見核質(zhì)比較大、緊密連接的單

層上皮細(xì)胞。

7.2體外可培養(yǎng)從捐獻(xiàn)者獲得的人肝臟組織，通過強(qiáng)制顯微鏡觀察，消化后臺(tái)

機(jī)械和消化酶聯(lián)用的方法獲得單盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活

細(xì)胞懸液，3D培養(yǎng)方式生成肝臟類死，H&E染色和FFPE

器官后，可以在體外維持長(zhǎng)期培組織病理切片對(duì)比

養(yǎng)，且核型正常，傳代10代以上。

7.3體外可重建當(dāng)類器官解離成5-20個(gè)細(xì)胞組成強(qiáng)制顯微鏡觀察。

的細(xì)胞片段后，仍能進(jìn)行體外重建

成為新的類器官，新培養(yǎng)出的類器

官與原來類器官具有相同的形態(tài)、

細(xì)胞組成、細(xì)胞核型等特征。

7.4存活率新復(fù)蘇的類器官存活率不低于強(qiáng)制按照附錄D檢測(cè)。

80%。且存活的類器官在體外可以

進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。

7.5染色體核型正常核型應(yīng)為46，XY或46，XX。推薦按照附錄C檢測(cè)。

7.6標(biāo)志基因表肝祖細(xì)胞表達(dá)SOX9、EpCAM、LGR5強(qiáng)制基因表達(dá)按照附錄E檢

達(dá)等早期肝系標(biāo)志物以及肝細(xì)胞標(biāo)測(cè)。

志物HNF4、ALB和CYP3A4。

α蛋白質(zhì)表達(dá)按照附錄

D.1.2檢測(cè)。

7.7功能指標(biāo)擴(kuò)增培養(yǎng)的肝臟類器官主要由肝推薦按照附錄D.3檢測(cè)。

祖細(xì)胞構(gòu)成，尚不發(fā)揮成熟肝臟的

功能，而分化培養(yǎng)后的肝臟類器官

具有糖原儲(chǔ)存、脂質(zhì)儲(chǔ)存、低密度

脂蛋白攝取、白蛋白分泌、尿素合

成及藥物代謝等肝臟特異性合成

代謝功能。

7.8微生物真菌、細(xì)菌、支原體、病毒等應(yīng)為強(qiáng)制

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陰性。

7.8.1細(xì)菌及真菌真菌、細(xì)菌應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照《中華人民共和國(guó)

藥典（四部）》中“1101

無(wú)菌檢查法”項(xiàng)檢測(cè)。

7.8.2支原體支原體應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照《中華人民共和國(guó)

藥典（四部）》“3301

支原體檢測(cè)法”項(xiàng)檢

測(cè)。

7.8.3外源病毒因外源病毒因子應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照《中華人民共和國(guó)

子藥典》中“3302外源病

毒因子檢查法”項(xiàng)檢

測(cè)。

7.9STR體外培養(yǎng)的類器官，應(yīng)進(jìn)行STR檢推薦按照附錄B檢測(cè)。

測(cè)及分型鑒定，無(wú)樣品間的交叉污

染。

受檢類器官STR位點(diǎn)的基因分型數(shù)

據(jù)與其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系（其原始

組織或衍生細(xì)胞系）STR基因分型

數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，兩者的匹配度應(yīng)

≥80%。

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附錄A

（資料性）

肝臟類器官培養(yǎng)用主要試劑材料與操作要點(diǎn)

A.1主要試劑材料

A.1.1培養(yǎng)基主要構(gòu)成

表A.1肝臟類器官培養(yǎng)基的主要成份表

中文名稱英文名稱

培養(yǎng)基AdvancedDMEM/F12

谷氨酰胺GlutaMAX

4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液HEPES

青霉素/鏈霉素penicillin/streptomycin

N-乙酰半胱氨酸N-acetylcysteine

尼可酰胺Niacinamide

無(wú)血清添加劑B27

表皮生長(zhǎng)因子EGF

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10FGF10

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF

Wnt-3aWnt-3a

胃泌素IGastrinI

R-Spondin-1重組蛋白R(shí)-Spondin-1

頭蛋白Noggin

TGFβ抑制劑A83-01

ROCK抑制劑*Y-27632

*分離培養(yǎng)前三天加。

A.1.2類器官培養(yǎng)3D支架材料

3D基質(zhì)膠提取自基底膜的基質(zhì)，主要組成成分包括但不限于層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫

酸肝素糖蛋白，還包含生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等。基質(zhì)膠在室溫條件下聚合形成具有生物學(xué)活性的

三維支架，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能。該結(jié)構(gòu)不僅有利于體外細(xì)胞的培養(yǎng)和

分化，而且能夠?yàn)楦闻K上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支架?；|(zhì)膠在零度以下低溫環(huán)境呈液態(tài)，故凡是涉及基質(zhì)

膠的試驗(yàn)操作皆應(yīng)置冰盒操作。

A.1.3組織消化酶

肝臟組織消化中涉及的消化酶主要有IV型膠原酶（collagenaseIV）與DNaseI。其作用是水解肝臟

ECM中的膠原蛋白和細(xì)胞釋放的核酸成分，從而使肝臟細(xì)胞從組織中充分分離出來，以利于制備為單

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細(xì)胞懸液。

A.1.4類器官凍存液

類器官凍存液為無(wú)血清凍存液，一般宜含有10%的二甲基亞砜(DMSO)。

A.2肝臟類器官培養(yǎng)操作要點(diǎn)

A.2.1類器官污染的處置

肝臟類器官培養(yǎng)過程中應(yīng)定期觀察、拍照，每3-5天更換一次類器官培養(yǎng)基。一般在第4-10天于倒

置顯微鏡下可以觀察到少量40-60μm的類器官小球，到第10-14天可觀察到250-500μm的肝臟類器官。

定期觀察有利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染。如果在培養(yǎng)3天內(nèi)出現(xiàn)基質(zhì)膠渾濁，提示可能有霉菌和細(xì)菌污染，需及

時(shí)采取丟棄處理。在類器官培養(yǎng)過程中也有可能出現(xiàn)支原體污染，被污染的類器官生長(zhǎng)會(huì)變得緩慢，此

時(shí)需進(jìn)行支原體檢測(cè)確認(rèn)，若無(wú)法恢復(fù)類器官生長(zhǎng)狀態(tài)及時(shí)采取丟棄處理。

A.2.2類器官培養(yǎng)物接種注意事項(xiàng)

將獲取的細(xì)胞懸液與3D基質(zhì)膠按照1:1混勻吹打，吹打過程中切忌產(chǎn)生大量氣泡，以免影響后續(xù)培

養(yǎng)物接種。24孔板可提前于37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱30min，以加速3D基質(zhì)膠的凝固。

A.2.3類器官傳代注意事項(xiàng)

肝臟類器官可以連續(xù)傳代超過10代或持續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月以上。與類器官有關(guān)的試驗(yàn)研究宜在連續(xù)傳代

10代以內(nèi)或者持續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行。

A.3類器官凍存注意事項(xiàng)

凍存前每孔加入500μL的類器官收集液，將類器官吸至試管內(nèi)，按照50μL膠加500μL的類器官收

集液，置于冰上60min，去除基質(zhì)膠，離心清洗后，加入細(xì)胞消化酶消化3-5min，使其消化成單細(xì)胞懸

液，1000r/min離心5min。棄上清后加入適量類器官凍存液混勻，分裝于1mL低溫凍存管中，放入程序

性凍存盒內(nèi)于-80℃深低溫冰箱過夜保存，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中長(zhǎng)期保存。

A.4類器官?gòu)?fù)蘇注意事項(xiàng)

從液氮罐中取出的類器官凍存管要快速放入37℃水浴鍋中令其盡快融化。吸出類器官凍存物移至

15mL無(wú)菌離心管中，再加入10倍體積的AdvancedDMEM/F12培養(yǎng)基混勻。之后操作同前述的類器官傳

代培養(yǎng)過程。

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附錄B

（資料性）

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測(cè)

STR檢測(cè)流程詳見圖B.1，先提取細(xì)胞DNA,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，最后進(jìn)行結(jié)果分析。

圖B.1STR檢測(cè)流程

人源類器官STR鑒定結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：

受檢類器官STR位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)與其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系（其原始組織或衍生細(xì)胞系）STR基因

分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)：

B.1若兩者的匹配度≥80%，則判定受檢細(xì)胞系為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系或?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的衍生細(xì)胞系。

B.2若兩者的匹配度在56%-80%之間，建議結(jié)合細(xì)胞系形態(tài)、細(xì)胞系特異性標(biāo)記物等輔助分析進(jìn)行綜合

判斷。

B.3若兩者的匹配度≤56%，則判定受檢細(xì)胞樣本與其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系不相關(guān)。

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附錄C

（資料性）

染色體核型檢測(cè)

C.1試驗(yàn)當(dāng)天保證細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，一般一個(gè)6cm的培養(yǎng)皿細(xì)胞長(zhǎng)到80%的密度能做一次試驗(yàn)。

C.2將待測(cè)細(xì)胞從37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中拿出，添加秋水仙素（終濃度為0.2μg/mL），搖勻后37℃孵

育1-2h。

C.3等待的同時(shí)，配制低滲溶液0.075MKCl(配制:8mL無(wú)菌水+44.7mgKCl)，放入37℃水浴預(yù)熱。

C.4孵育后的細(xì)胞用胰酶消化，1200r/min，離心5min，收集于離心管中，去除上清液，用8mL低滲液

重懸，打勻后放37℃水浴箱40min。

C.5加入新鮮配制的固定液（甲醇/冰乙酸=2/1~3/1）2mL混勻，室溫下放10min后，1000r/min離心10min，

去上清液（留500μL,先將底部細(xì)胞吹勻），新加入8mL固定液，1200r/min，離心10min，重復(fù)三次后，

滴片，放入80℃烘箱老化3h。

C.6再將烤干的玻片放入新鮮配制的胰酶（0.25%）中消化1min（嚴(yán)格控制時(shí)間）后，再放入吉姆薩染

液中染色5-10min（先用1片染5min,根據(jù)顏色調(diào)整后面的染色時(shí)間），取出用流水沖去染液后，在顯

微鏡下觀察結(jié)果。

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附錄D

（資料性）

肝臟類器官鑒定

D.1類器官形態(tài)學(xué)鑒定

D.1.1顯微鏡下培養(yǎng)形態(tài)評(píng)估

將類器官培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下，在20倍視野下計(jì)數(shù)類器官數(shù)目。類器官數(shù)目不少于60個(gè)/視野

表明類器官生長(zhǎng)狀態(tài)良好。生長(zhǎng)活力好的類器官平均直徑約為160μm-200μm。若個(gè)別類器官體積過大

（可達(dá)1000μm）則提示類器官趨向衰老，應(yīng)盡早傳代，以防止衰老的類器官影響類器官傳代。

D.1.2類器官的病理形態(tài)學(xué)及免疫染色鑒定

肝臟組織或者肝臟類器官成功構(gòu)建后，通過制備冰凍切片或者石蠟包埋切片，進(jìn)行蘇木素/伊紅染

色（H&E）進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，通過免疫熒光或者免疫組化染色進(jìn)行生物標(biāo)志物檢測(cè)。肝細(xì)胞標(biāo)志物

HNF4α，早期肝系細(xì)胞標(biāo)志物SOX9、LGR5、EpCAM，成熟肝臟標(biāo)志物ALB和CYP3A4，緊密連接蛋

白ZO-1。

同時(shí)進(jìn)行類器官整體染色：培養(yǎng)大小約100-200μm的類器官，加入類器官收集液，置于冰上放置1h

以溶解基質(zhì)膠，預(yù)冷PBS漂洗類器官，低速離心（600r/min）2次。加入0.125%TritonX-100破膜液，室

溫作用10min，室溫PBS漂洗3次后封閉用血清（10%二抗血清）封閉1h。將類器官分別放置相應(yīng)染色

組別的共聚焦小室中，10%二抗血清作為配制一抗的稀釋液，根據(jù)不同稀釋比配制一抗抗體組合，滴加

一抗，4℃孵育過夜后PBS漂洗3次。不同組別分別滴加各種熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光作用1h。PBS

漂洗3次后加入DAPI染核液，室溫作用10min后PBS漂洗3次。加入水性封片劑，避光濕盒保存，共聚焦

顯微鏡下觀察采集圖像并三維重建類器官結(jié)構(gòu)。

D.2類器官存活率評(píng)估

D.2.1原代組織消化

肝臟組織酶解后獲得單細(xì)胞懸液，采用臺(tái)盼藍(lán)(Trypanblue)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。將離心后的細(xì)胞

沉淀用AdvancedDMEM/F12培養(yǎng)基重懸（約100μL），經(jīng)吹打均勻后吸取18μL置于1.5mL的EP管，向

EP（eppendorf）管中加入2μL的0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液充分混勻，染色3min，取10μL細(xì)胞懸液加入血細(xì)胞

計(jì)數(shù)板，在倒置顯微鏡10倍物鏡下計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)四大格中未染成藍(lán)色和染成藍(lán)色的細(xì)胞總數(shù)。利用如

下公式計(jì)算每100μL體積中細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞存活率：

細(xì)胞總數(shù)按照公式D.1進(jìn)行計(jì)算：

3

N總=((N活+N死)/4)×10×1.11×100……………………（D.1）

式中：

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N總：細(xì)胞總數(shù)；

N活：未染成藍(lán)色細(xì)胞數(shù)；

N死：染成藍(lán)色細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞存活率按照公式D.2進(jìn)行計(jì)算：

X=N活/(N總)×100%………………………（D.2）

式中：

X：細(xì)胞存活率；

N活：未染成藍(lán)色細(xì)胞數(shù)；

N總：細(xì)胞總數(shù)。

注：活細(xì)胞比率應(yīng)>90%可用于類器官細(xì)胞培養(yǎng)。

D.2.2類器官傳代及凍存復(fù)蘇

類器官傳代前、酶解為5-20個(gè)細(xì)胞的小細(xì)胞團(tuán)后以及類器官?gòu)?fù)蘇后，應(yīng)使用D.2.1中方法進(jìn)行類器

官存活率計(jì)算。如果要利用類器官進(jìn)行藥物篩選或者化合物安全性評(píng)價(jià)，則使用商品化的CellTiter-Glo?

發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒對(duì)類器官的活力進(jìn)行檢測(cè)。

D.3分化成熟的肝臟類器官功能性評(píng)價(jià)

D.3.1糖原代謝

按照過碘酸-雪夫（PAS）染色方法對(duì)糖原顆粒進(jìn)行染色。

D.3.1.1分化的肝臟類器官用4%PFA室溫固定15-20min，固定結(jié)束后，用PBS洗兩遍。

D.3.1.2加入高碘酸溶液（PeriodicAcidSolution），室溫孵育5min。

D.3.1.3室溫1000r/mmin，離心4min，棄去廢液，加入PBS洗兩遍。

D.3.1.4加入希夫試劑（Schiff’sReagent），室溫孵育15min。Schiff’s試劑使用完立即放回4℃冰箱。

D.3.1.5離心收集細(xì)胞，加入PBS洗三遍，每次洗5min。

D.3.1.6加入蘇木素溶液襯核90s。

D.3.1.7用PBS洗三遍，每次洗5min，倒置相差顯微鏡下觀察并攝取圖像。

D.3.2攝取與排泌

采用靛青綠（IndocyanineGreen,ICG）試劑檢測(cè)攝取與排泌。

D.3.2.1收集分化的肝臟類器官，用PBS洗一遍。

D.3.2.2加入1mg/mL的ICG試劑，37℃培養(yǎng)箱孵育30min。

D.3.2.3結(jié)束后，用PBS洗三遍，加入PBS。

D.3.2.4倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取ICG的圖像，并拍照。

D.3.2.5攝像結(jié)束后，去除PBS，加入新鮮的肝細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，放于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)觀察。

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D.3.2.6每隔1h鏡下觀察細(xì)胞排泌ICG的現(xiàn)象，直到細(xì)胞完全排出ICG并照相。

D.3.2.7更換為新鮮的培養(yǎng)基放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

D.3.3CYP3A4酶活檢測(cè)

D.3.3.1收集分化的肝臟類器官，加入含有3μMLuciferin-IPA的培養(yǎng)基，并設(shè)置3μMLuciferin-IPA空

白對(duì)照孔。

D.3.3.237℃培養(yǎng)箱孵育1h。

D.3.3.3室溫離心1000r/min，5min收集上清，細(xì)胞用PBS洗三遍，更換為新鮮培養(yǎng)基放入37℃培養(yǎng)

箱培養(yǎng)。

D.3.3.4在不透明的96孔中每孔加入50μL的待測(cè)樣品和空白對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔。

D.3.3.5加入50μL的LuciferinDectecionReagent，輕拍板子混勻。

D.3.3.6室溫孵育20min。

D.3.3.720min以內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的熒光值。

D.3.3.8計(jì)算結(jié)果。

D.3.4白蛋白分泌

采用ELISA方法檢測(cè)白蛋白含量。

D.3.4.1提前24h把分化的肝臟類器官培養(yǎng)基更換為以無(wú)酚紅的HM培養(yǎng)基，同時(shí)做兩個(gè)空白對(duì)照孔，

放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

D.3.4.224h后離心收集細(xì)胞上清。

D.3.4.3提前配制工作液，按照試劑盒的說明書把20×BufferC稀釋成1×BufferC，20×WashBuffer

稀釋成1×WashBuffer。

D.3.4.4在已經(jīng)包被ALB抗體的96孔板內(nèi)分別加入100μL的標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品和空白對(duì)照，每個(gè)樣品

設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔。

D.3.4.5室溫孵育1h。

D.3.4.6倒盡孔中液體，每孔加入200μL的1×WashBuffer洗四遍。

D.3.4.7每孔加入100μL的Anti-albuminDetectionAntibody。

D.3.4.8室溫孵育1h。

D.3.4.9倒盡孔中液體，每孔加入200μL的1×WashBuffer洗四遍。

D.3.4.10每孔加入100μL的HRPSolutionA。

D.3.4.11倒盡孔中液體，每孔加入200μL的1×WashBuffer洗四遍。

D.3.4.12每孔加入100μL的TMBSubstrate。

D.3.4.13室溫避光孵育30min。

D.3.4.14每孔加入100μL的終止液

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D.3.4.1530min以內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm的吸光度值。

D.3.4.16繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)曲線計(jì)算結(jié)果。

D.3.5尿素合成功能檢測(cè)

D.3.5.1提前24h把分化的肝臟類器官培養(yǎng)基更換為加入含10mM氯化銨的無(wú)酚紅HM培養(yǎng)基，37℃

培養(yǎng)箱孵育24h。

D.3.5.224h后離心收集細(xì)胞上清。

D.3.5.3提前配制尿素檢測(cè)的工作液，即等體積的A液加上等體積的B液。

D.3.5.4每孔加入50μL的標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品和超純水。

D.3.5.5每孔加入200μL的尿素檢測(cè)工作液，輕拍板子混勻。

D.3.5.6室溫孵育20min，若待測(cè)樣品尿素含量較低，室溫孵育50min。

D.3.5.720min以內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm的吸光度值。

D.3.5.8根據(jù)公式計(jì)算結(jié)果。

D.3.6CDFDA染色

D.3.6.1收集分化的肝臟類器官用PBS洗一遍。

D.3.6.2加入2μMCDFDA試劑在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min。

D.3.6.3離心棄去廢液，加入預(yù)冷的PBS洗三遍。

D.3.6.4激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)微膽管的染色并攝取圖像。

A

B

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附錄E

（資料性）

標(biāo)志基因檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

E.1類器官樣本制備

體外培養(yǎng)的類器官，吸掉培養(yǎng)基。加入等體積的PBS緩沖液（pH為7.4），吸掉緩沖液。重復(fù)一

次。

E.2類器官RNA提取

E.2.1收集細(xì)胞：待類器官長(zhǎng)到一定的數(shù)量后，將24孔板中的培養(yǎng)基去除，加入1mL的PBS進(jìn)行清洗

1遍。去除PBS后，加入1mL的無(wú)動(dòng)物源性重組胰酶，并用1mL量程的移液槍將基質(zhì)膠打散，以利

于消化酶與類器官進(jìn)行充分的接觸與消化。30min后，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至RNase-Free的離心管中離心

（300×g，5min），收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清；

E.2.2裂解處理：輕彈離心管底部，使細(xì)胞沉淀松散，加入適量裂解液RL（350μL），旋渦震蕩；

E.2.3將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上(過濾柱CS放在收集管中)，13,400×g離心2min，收集濾液；

E.2.4向?yàn)V液中加入1倍體積70%乙醇（通常為350μL或600μL），混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀），得

到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中（吸附柱CR3放入收集管中），13,400×g離心30-60s，倒掉

收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

E.2.5向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，13,400×g離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸

附柱CR3放回收集管中；

E.2.6DNaseI工作液的配制：取10μLDNaseI儲(chǔ)存液放入新的RNase-Free離心管中，加入70μL去除

DNA緩沖液RDD，輕柔混勻；

E.2.7向吸附柱CR3中央加入80μL的DNaseI工作液，室溫放置15min；

E.2.8向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，13,400×g離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸

附柱CR3放回收集管中；

E.2.9向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW（按照說明加入乙醇），室溫靜置2min，13,400×g離心

30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

E.2.10重復(fù)步驟2.9；

E.2.11離心（13,400×g，2min），倒掉廢液。將吸附柱CR3置于室溫放置至少2min，以徹底晾干吸附

材料中殘余的漂洗液；

E.2.12將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase-Free離心管中，加入30-100μLRNase-FreeddH2O室溫放置

2min，離心（13,400×g，2min），得到RNA溶液。

E.3類器官cDNA制備

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T/CRHA017—2023

取1μgE.2.12提取的RNA，利用水浴鍋，按照商品化RNA反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行類器官RNA反轉(zhuǎn)，操

作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

E.4基因表達(dá)情況確定

取E.3類器官cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，按照商品化應(yīng)該定量PCR擴(kuò)增試劑盒說明書及

相關(guān)基因引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，得到內(nèi)參基因及目標(biāo)基因表達(dá)值。