綿羊胚胎玻璃化冷凍保存技術(shù)操作規(guī)程2019-08-01實(shí)施2019-08-01實(shí)施新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的要求編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局歸口并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會技術(shù)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所(新疆畜牧科學(xué)院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心)、新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站、新疆華牛天俊種畜繁育工程有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施應(yīng)用中的疑問，請咨詢新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所(新疆畜牧科學(xué)院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心)/新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站。對本標(biāo)準(zhǔn)的修改意見建議，請反饋至新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局(烏魯木齊市新華南路167號)、新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局(烏魯木齊市新華南路408號)、新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所(烏魯木齊市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)阿里山街468號)、新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站(烏魯木齊市新華南路408號)。新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局聯(lián)系電話傳真郵編：830004新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局聯(lián)系電話傳真郵編：830004新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所聯(lián)系電話傳真郵編：830000新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站聯(lián)系電話傳真郵編：830004DB65/T4203—20191綿羊胚胎玻璃化冷凍保存技術(shù)操作規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了綿羊胚胎來源、玻璃化冷凍解凍操作所需液體的配制、胚胎玻璃化冷凍和胚胎解凍等技術(shù)操作規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于綿羊體內(nèi)或體外胚胎玻璃化冷凍解凍技術(shù)操作。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T5458液氮生物容器NY/T1571羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程DB65/T4073成年綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)操作規(guī)程DB65/T4120綿羊冷凍胚胎3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。玻璃化冷凍vitrification將需要保存的細(xì)胞樣品，依次置于濃度梯度升高的冷凍保護(hù)劑中，置換出細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的水分，引起內(nèi)源性胞質(zhì)大分子如蛋白質(zhì)及滲透到胞內(nèi)的冷凍保護(hù)劑濃縮，通過將載有細(xì)胞的高濃度冷凍保護(hù)劑，在超低溫環(huán)境下凝固，形成不規(guī)則的玻璃化樣固體，保存了液態(tài)時(shí)正常分子和離子分布，因而使細(xì)胞在劇烈的快速降溫中不會因胞質(zhì)內(nèi)的水分凝結(jié)為冰晶而破壞質(zhì)膜，從而起到保護(hù)作用的方法。4綿羊幼羔供體的選擇4.1體內(nèi)胚胎按照NY/T1571的規(guī)定，選擇遺傳性能穩(wěn)定、系譜清楚、體質(zhì)健壯、繁殖機(jī)能正常的優(yōu)良品種供體用來生產(chǎn)胚胎。應(yīng)用超數(shù)排卵、人工輸精、手術(shù)沖胚的方法采集處于囊胚期至孵化期發(fā)育階段的胚胎，用玻璃化冷凍方法進(jìn)行冷凍保存。4.2體外胚胎按照DB65/T4073的規(guī)定，通過腹腔鏡、手術(shù)等方式對綿羊卵巢進(jìn)行活體采卵，或者摘取屠宰后的綿羊卵巢進(jìn)行離體采卵，將回收到的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟、體外受精、體外培養(yǎng)，得到處于囊胚期至孵化期發(fā)育階段的體外胚胎，用玻璃化冷凍方法進(jìn)行冷凍保存。25玻璃化冷凍保存液和解凍液的配制5.1所需試劑貨號胎牛血清(FBS)乙二醇(EG)二甲基亞砜(DMSO)5.2冷凍液、解凍液配方5.2.1玻璃化冷凍操作過程中使用的工作液分別是HM、VS1、VS2,配方如下：a)HM:90%M199+10%FBS;b)VS1:80%HM+10%EG+10%DMSO;c)VS2:50%HM+20%EG+20%DMSO+105.2.2玻璃化冷凍胚胎解凍操作過程中使用的工作液分別是HM、0.5mol/L蔗糖、0.25mol/L蔗糖，配方如下：a)HM:90%M199+10%FBS;c)0.25mol/L蔗糖：HM+0.0856g/mL蔗糖。5.3冷凍液、解凍液配方4℃冰箱保存。6胚胎玻璃化冷凍操作過程整個(gè)冷凍過程在25℃~30℃環(huán)境下進(jìn)行，胚胎置于冷凍液之前應(yīng)保證液體充分預(yù)熱且不過度蒸發(fā)。6.1基礎(chǔ)液(HM)中胚胎平衡再進(jìn)行下步操作。6.2冷凍液1(VS1)中胚胎細(xì)胞內(nèi)失水用VS1液體，在培養(yǎng)皿內(nèi)做1mL的液滴；取出平衡好的胚胎5枚～8枚，放入液滴內(nèi)，從放入液滴開始計(jì)時(shí)3min。6.3冷凍液2(VS2)中胚胎冷凍3用VS2液體，在培養(yǎng)皿內(nèi)做1個(gè)1mL的液滴；將在VS1中放置3min的胚胎，迅速移至VS2液滴中，并洗滌吸卵針2次，在25s內(nèi)吸取胚胎連同VS2液約4μL,滴入裝有液氮的冷凍盒內(nèi)，液滴在液氮表面運(yùn)動，形成直徑約2mm左右的顆粒，30s后墜入裝有液氮的冷凍盒底部。6.4胚胎保存預(yù)先制作帶有4個(gè)~5個(gè)直徑1.5mm小孔的細(xì)胞凍存管，預(yù)留小孔方便液氮進(jìn)入。然后用預(yù)冷過的鑷子將沉入液氮底部的顆粒，移至帶有小孔的凍存管內(nèi)，并迅速投入液氮中。使用前，在凍存管上用馬克筆標(biāo)注胚胎生產(chǎn)日期、品種、供體耳號、胚胎數(shù)量、發(fā)育階段等信息。待胚胎裝入凍存管后，將凍存管放入凍存管盒內(nèi)，置于液氮罐中保存，按照GB/T5458的規(guī)定，在相應(yīng)提漏標(biāo)簽上標(biāo)注冷凍日期，凍胚品種，凍存管數(shù)等信息。及時(shí)將冷凍胚胎、存放位置等信息在表A.1中進(jìn)行登記并妥善保存。7胚胎解凍操作過程7.1胚胎解凍準(zhǔn)備整個(gè)胚胎解凍過程在38.6℃加熱臺上進(jìn)行。分別在3個(gè)35mm的小皿內(nèi)加入3mL0.5mol/L蔗糖溶液、3mL0.25mol/L蔗糖溶液、3mLHM溶液，在加熱臺上預(yù)熱7.20.5mol/L蔗糖溶液中胚胎復(fù)蘇用在液氮內(nèi)預(yù)冷過的鑷子，從凍存管內(nèi)取出1個(gè)含有胚胎的玻璃化冷凍顆粒，迅速放入0.5mol/L蔗糖溶液的小皿內(nèi)搖晃，使得顆粒迅速融化，計(jì)時(shí)5min,在體視鏡下尋找胚胎，與冷凍記錄核對胚胎數(shù)量，在表A.1中做好記錄。每解凍10個(gè)顆粒，需更換1次0.5mol/L的蔗糖溶液。7.30.25mol/L蔗糖溶液中胚胎復(fù)蘇待胚胎在0.5mol/L蔗糖溶液中放置5min后，將胚胎移至0.25mol