ICS65.020.30

CCSB43

52

貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB52/T1869—2025

豬體細(xì)胞培養(yǎng)與冷凍保存技術(shù)規(guī)程

Technicalregulationofpigcellcultureandcryopreservation

2025-03-06發(fā)布2025-06-01實(shí)施

貴州省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB52/T1869—2025

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義.........................................................................1

4縮略語.............................................................................1

5基本要求...........................................................................2

6體細(xì)胞采集.........................................................................2

7體細(xì)胞體外培養(yǎng).....................................................................3

8冷凍保存...........................................................................4

9復(fù)蘇和活力鑒定.....................................................................4

附錄A（資料性）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備.............................................................5

附錄B（資料性）試劑與要求...........................................................6

附錄C（資料性）細(xì)胞凍存和復(fù)蘇登記表.................................................7

I

DB52/T1869—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所提出。

本文件由貴州省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。

本文件起草單位：貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州省畜禽遺傳資源管理站、貴州省種畜禽種質(zhì)測定中

心、松桃苗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、貴州省動物疫病預(yù)防控制中心、黔西市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、道真縣畜牧漁業(yè)

發(fā)展服務(wù)中心、萬山區(qū)畜牧技術(shù)推廣站。

本文件主要起草人：譚婭、楊齊心、吳玙彤、黃智宇、李晨、熊力、齊婧、石麗娟、楊阿明、邱家

俊、裴國海、張正群、張靜、盧昱希、趙春萍、杜春林、姚敏、龍清孟、李平、楊紅文、申李、何潤霞、

姚建軍。

II

DB52/T1869—2025

豬體細(xì)胞培養(yǎng)與冷凍保存技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了基本要求、體細(xì)胞采集、體細(xì)胞體外培養(yǎng)、體細(xì)胞鑒定、冷凍保存、復(fù)蘇和活力鑒定

的內(nèi)容與方法。

本文件適用于豬耳組織、脂肪組織、肌肉組織的體細(xì)胞采集、體外培養(yǎng)、冷凍保存及復(fù)蘇和活力鑒

定方法。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T5458液氮生物容器

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

原代細(xì)胞primarycells

直接從動物的組織或器官，將其分散成為單個細(xì)胞后，在人工條件下培養(yǎng)使其存活、生長、增殖并

開始體外培養(yǎng)的細(xì)胞。

體細(xì)胞somaticcells

來源于受精卵，并攜帶生物個體全部遺傳信息的一類細(xì)胞。

細(xì)胞冷凍保存cellscryopreservation

將體外培養(yǎng)的細(xì)胞與細(xì)胞凍存液按一定的比例混合后，按照設(shè)定的降溫程序降溫，最后浸入液氮中

進(jìn)行長期保存的方法。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSaline），主要成分為磷酸鹽酸二氫鈉、磷酸鹽氫二鈉、

氯化鈉，主要用來洗滌細(xì)胞。

消化Buffer：消化緩沖液，多為濃度為20g/L的牛血清白蛋白，對細(xì)胞主要起到機(jī)械保護(hù)作用。

1

DB52/T1869—2025

IF：免疫熒光染色（Immunofluorescence），基于抗原-抗體特異性反應(yīng)，將熒光物質(zhì)（最常用的

是熒光素）標(biāo)記于抗原或抗體上，當(dāng)其與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合后，就會在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性的熒

光反應(yīng)。

qPCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timeQuantitativePCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物

質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。

5基本要求

實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室符合GB19489要求。工作區(qū)應(yīng)設(shè)置準(zhǔn)備室、緩沖間、無菌間、細(xì)胞保存室等。其中，緩沖間

面積不得小于3m2，應(yīng)設(shè)置更衣柜和紫外燈，紫外燈強(qiáng)度不得低于1.5W/m3。紫外燈管距地面不應(yīng)超過

2.5m，每次照射時(shí)間不少于30min。無菌室的無菌等級最低標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到C級，操作區(qū)應(yīng)達(dá)到B級，溫度應(yīng)

控制在20℃～24℃，濕度應(yīng)控制在45%～60%為宜。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

5.2.1儀器設(shè)備

儀器設(shè)備見附錄A.1。

5.2.2耗材

耗材見附錄A.2。

5.2.3試劑與培養(yǎng)液

試劑、藥品、培養(yǎng)液配置及要求見附錄B。

6體細(xì)胞采集

供體選擇

選取生長發(fā)育良好的健康豬只。

采集

6.2.1耳組織采集

用75%酒精擦洗耳組織邊緣部位，用消毒后的手術(shù)刀刮凈采樣部位的耳毛，再用75%的酒精消毒后用

剪耳鉗采樣。

6.2.2脂肪組織采集

用75%酒精擦洗豬胴體后頸部皮下脂肪部位，用消毒后的手術(shù)刀刮凈皮膚上的毛發(fā)，取適量皮下組

織，立即用生理鹽水沖洗干凈。

6.2.3肌肉組織采集

采集適量的豬胴體背最長肌部位，立即用生理鹽水沖洗干凈。

2

DB52/T1869—2025

組織處理

將采集的肌肉組織樣品浸泡在盛有PBS的離心管中，封樣、標(biāo)記并記錄樣本信息。

保存

組織樣品保存至4℃采樣箱，并在12h內(nèi)帶回至實(shí)驗(yàn)室分離原代細(xì)胞。

7體細(xì)胞體外培養(yǎng)

培養(yǎng)條件

在37.0℃、5%的CO2及100%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

原代細(xì)胞制作及培養(yǎng)

7.2.1清洗：將采集的組織加入含有1%三抗的冷PBS中清洗3次，除去血管或結(jié)締組織，用眼科剪剪

成1mm3左右的碎塊。

7.2.2消化：將碎塊移入離心管，加入膠原酶（2g/L）和消化Buffer（20g/L），在37℃恒溫水浴鍋

內(nèi)消化1h，消化期間，每隔2min～3min進(jìn)行搖勻，半小時(shí)進(jìn)行一次吹打。

7.2.3過篩和離心：消化結(jié)束后，用100μm濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，50ml離心管收集，經(jīng)離心8min

（500g/min），棄上清，收集底部細(xì)胞。

7.2.4裂解紅細(xì)胞（選做）：在底部細(xì)胞中加入5ml紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解10min，經(jīng)離心5min

（1000g/min），棄上清，收集底部細(xì)胞。

7.2.5細(xì)胞培養(yǎng)：用20%完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，鋪瓶后放入培養(yǎng)箱。

傳代培養(yǎng)

7.3.1清洗：待細(xì)胞增殖至培養(yǎng)瓶底面積的80%左右時(shí)，棄除原先的培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的PBS清洗

細(xì)胞。

7.3.2消化：再加0.25%胰酶消化細(xì)胞，在顯微鏡觀察瓶底的細(xì)胞狀態(tài)，貼壁細(xì)胞變圓時(shí)立即添加完

全培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。

7.3.3離心：將細(xì)胞懸液移至離心管中，經(jīng)離心5min（1000g/min）后棄上清，保留底部細(xì)胞。

7.3.4鋪瓶：用10%完全培養(yǎng)基重懸底部細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度約1.0×105個/mL鋪入

新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

體細(xì)胞鑒定

7.4.1成纖維細(xì)胞

從耳組織主要獲得成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)的形態(tài)為梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，

胞質(zhì)突起，生長時(shí)呈放射狀或漩渦狀；可利用IF或qPCR檢測鑒定成纖維細(xì)胞。

7.4.2脂肪細(xì)胞

從脂肪組織主要獲得基質(zhì)血管成分細(xì)胞（含有脂肪來源干細(xì)胞），其生長形態(tài)為長梭形，分化期逐

漸變圓，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生脂滴，形成“脂環(huán)”，可利用油紅染色、IF或qPCR檢測鑒定脂肪細(xì)胞。

3

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7.4.3肌衛(wèi)星細(xì)胞

從肌肉組織獲得肌衛(wèi)星細(xì)胞，其形態(tài)為長梭形，在分化期排列整齊，各肌細(xì)胞融合成“肌管”；可利

用IF或qPCR檢測鑒定肌衛(wèi)星細(xì)胞。

8冷凍保存

制作懸液

用細(xì)胞凍存液將培養(yǎng)的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)，密度為1.0×106/mL～3.0×106/mL。

分裝

按1mL/每管分裝在凍存管中，標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存管編號、性別、凍存日期、代次。

凍存

按照細(xì)胞凍存程序（4℃10分鐘—-20℃1h～2h—-80℃過夜）或凍存盒處理后，投入符合

GB/T5458規(guī)定的液氮罐（-196℃）中長久保存。

登記

做好相應(yīng)登記，細(xì)胞凍存登記表詳見附錄C.1。

9復(fù)蘇和活力鑒定

細(xì)胞復(fù)蘇

9.1.1水?。簭囊旱腥〕黾?xì)胞凍存管，立即放入37℃水浴中不斷搖動1min取出，用75%酒精消毒

凍存管外壁。

9.1.2重懸和離心：吸出細(xì)胞懸液，放入離心管中，加入10倍體積的細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻后離心5min

（1000g/min），棄上清，再重復(fù)清洗一次。

9.1.3接種和登記：將復(fù)蘇后的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，并做好相應(yīng)登記，細(xì)胞復(fù)蘇登記表詳見

附錄C.2。

細(xì)胞活力鑒定

9.2.1準(zhǔn)備：每毫升細(xì)胞懸液中加入100μL0.4%臺盼藍(lán)溶液，濃度為0.04%。

9.2.2觀察：混勻后靜置10min～15min，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

9.2.3計(jì)數(shù)：折光率強(qiáng)且未被染色的為活細(xì)胞，染成藍(lán)色的為死細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

9.2.4重復(fù)：取3次計(jì)數(shù)的平均值即得到細(xì)胞活力。

4

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A

A

附錄A

（資料性）

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

A.1儀器設(shè)備

如下：

——超凈工作臺；

——CO2培養(yǎng)箱；

——高壓蒸汽滅菌鍋；

——鼓風(fēng)干燥箱；

——液氮罐；

——離心機(jī)；

——電子分析天平；

——超純水制備系統(tǒng)；

——熒光倒置顯微鏡；

——冰箱（-20℃、-80℃）：

——恒溫采樣箱；

——電熱恒溫水浴鍋；

——移液器（2μL，10μL，100μL，200μL，1000μL）；

——酒精燈；

——血細(xì)胞計(jì)數(shù)器/細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；

——眼科剪；

——凍存盒。

A.2耗材

如下：

——培養(yǎng)瓶（25mm，75mm）；

——培養(yǎng)皿；

——濾網(wǎng)（100μm）；

——過濾器（0.22μm）：

——移液器槍頭；

——移液器槍頭盒；

——巴氏吸管（10ml，20ml）：

——脫脂棉；

——封口膜；

——標(biāo)簽紙；

——記號筆；

——一次性乳膠手套或PE手套。

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B

B

附錄B

（資料性）

試劑與要求

B.1試劑名稱

生理鹽水、磷酸緩沖鹽溶液（Phosphatebufferedsaline,PBS）（pH=7.2～7.4）、胎牛血清（Fetal

bovineserum,FBS）、馬血清、基礎(chǔ)培養(yǎng)基（推薦使用DMEM/F12）、三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素

B）、胰酶（0.25%）、二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）、膠原酶、牛血清白蛋白（Bovineserum

albumin，BSA）、地塞米松（DEX）、胰島素（Insulin）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-Isobutyl-1-

methylxanthine，IBMX）。

B.2試劑要求

所有試劑除特殊規(guī)定外，均為分析純及以上純度的化學(xué)試劑，符合組織細(xì)胞的培養(yǎng)要求；試驗(yàn)用水

符合GB/T6682規(guī)定；基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清建議選用細(xì)胞培養(yǎng)測試的產(chǎn)品。

B.3血清的滅活

新購的胎牛血清，已注明滅活處理的，用0.22μm濾器過濾滅菌后，可以直接使用；未注明滅活處

理的，需56℃水浴滅活30min，用0.22μm濾器過濾滅菌后使用。血清經(jīng)滅活及過濾滅菌后，分裝并于

-20℃或-80℃超低溫冰箱中長期保存?zhèn)溆谩?/p>

B.4細(xì)胞培養(yǎng)液

B.4.120%細(xì)胞完全培養(yǎng)基推薦使用79%DMEM/F12（含15mMHEPES緩沖液、L-谷氨酰胺和酚紅）+20%

FBS+1%三抗（100U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素+0.25μg/ml兩性霉素B)；10%細(xì)胞完全培養(yǎng)基推薦使用

89%DMEM/F12（含15mMHEPES緩沖液、L-谷氨酰胺和酚紅）+10%FBS+1%三抗（100U/ml青霉素+

100μg/ml鏈霉素+0.25μg/ml兩性霉素B)。

B.4.2肌衛(wèi)星細(xì)胞分化培養(yǎng)基推薦使用98%DMEM/F12+2%馬血清。

B.4.3脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基推薦使用完全培養(yǎng)基+1μM地塞米松+0.5mMIBMX+10μg/ml胰島素。

B.4.4細(xì)胞凍存液推薦使用70%DMEM/F12+20%FBS+10%DMSO。

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C

C

附錄C

（資料性）

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇登記表

見表C.1、表C.2。

表C.1細(xì)胞凍存登記表

序號品種個體編號性別來源組織細(xì)胞名稱凍存日期密度代次備注