紙片擴(kuò)散藥敏檢測(cè)方法介紹在臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，準(zhǔn)確而快速地測(cè)定病原菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥、控制感染擴(kuò)散以及監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性變遷具有至關(guān)重要的意義。紙片擴(kuò)散法，作為一種經(jīng)典且廣泛應(yīng)用的藥敏檢測(cè)手段，以其操作簡(jiǎn)便、成本相對(duì)低廉、結(jié)果判讀直觀等特點(diǎn)，至今仍在各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的微生物實(shí)驗(yàn)室中扮演著重要角色。本文將對(duì)紙片擴(kuò)散藥敏檢測(cè)方法的基本原理、主要步驟、結(jié)果判讀、方法學(xué)特性及注意事項(xiàng)進(jìn)行系統(tǒng)性介紹，旨在為相關(guān)檢驗(yàn)人員提供一份實(shí)用的技術(shù)參考。一、基本原理紙片擴(kuò)散法的核心原理基于抗菌藥物在固體培養(yǎng)基中的擴(kuò)散特性以及細(xì)菌生長(zhǎng)受抑制的規(guī)律。將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種特定測(cè)試菌的瓊脂培養(yǎng)基表面，抗菌藥物會(huì)隨著時(shí)間的推移，從紙片中心向四周瓊脂中逐漸擴(kuò)散，形成一個(gè)以紙片為中心的藥物濃度梯度。在擴(kuò)散過(guò)程中，藥物濃度從高到低遞減。當(dāng)瓊脂平板經(jīng)適宜溫度培養(yǎng)一定時(shí)間后，若細(xì)菌對(duì)該抗菌藥物敏感，則在紙片周圍會(huì)形成一個(gè)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的透明區(qū)域，即“抑菌圈”。抑菌圈的大小與細(xì)菌對(duì)該抗菌藥物的敏感性程度相關(guān)：通常情況下，抑菌圈越大，表明細(xì)菌對(duì)該藥物越敏感；反之，若抑菌圈越小或無(wú)抑菌圈形成，則提示細(xì)菌對(duì)該藥物敏感性較低或耐藥。這一方法的理論基礎(chǔ)是，在一定范圍內(nèi)，抗菌藥物在瓊脂中的擴(kuò)散速率相對(duì)恒定，因此抑菌圈直徑可以間接反映細(xì)菌對(duì)藥物的最低抑菌濃度（MIC）。二、主要試劑與材料開展紙片擴(kuò)散藥敏檢測(cè)，需配備一系列專用的試劑與材料，確保實(shí)驗(yàn)的規(guī)范性和結(jié)果的可靠性。1.培養(yǎng)基：最常用的是Mueller-Hinton（MH）瓊脂。MH瓊脂具有pH值穩(wěn)定（通常為7.2-7.4）、成分均一、對(duì)大多數(shù)抗菌藥物無(wú)拮抗作用等優(yōu)點(diǎn)，能較好地支持常見病原菌的生長(zhǎng)并保證藥物的擴(kuò)散效果。對(duì)于某些特殊細(xì)菌，如嗜血桿菌屬、鏈球菌屬等，則需在MH瓊脂的基礎(chǔ)上添加特定營(yíng)養(yǎng)成分（如補(bǔ)充生長(zhǎng)因子、血液等）。2.抗菌藥物紙片：為直徑約6毫米的圓形濾紙片，內(nèi)含定量的特定抗菌藥物。藥物種類、含量需符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（如CLSI標(biāo)準(zhǔn)）。紙片應(yīng)妥善儲(chǔ)存于低溫干燥環(huán)境，防止藥物失效或降解。3.菌液制備相關(guān)材料：包括無(wú)菌生理鹽水或肉湯、麥?zhǔn)媳葷峁埽ɑ虮葷醿x）、無(wú)菌試管、接種環(huán)等。4.其他器材：無(wú)菌培養(yǎng)皿、涂布棒（L型玻璃棒或棉拭子）、恒溫培養(yǎng)箱、游標(biāo)卡尺或抑菌圈測(cè)量?jī)x、酒精燈、超凈工作臺(tái)等。三、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程紙片擴(kuò)散法的操作流程雖不復(fù)雜，但每一步的規(guī)范化操作對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。1.培養(yǎng)基制備與質(zhì)量控制：嚴(yán)格按照培養(yǎng)基說(shuō)明書配制MH瓊脂，滅菌后傾注平板，確保瓊脂厚度均勻（通常為4mm-6mm，直徑90mm的平皿約需25-30ml培養(yǎng)基）。待瓊脂凝固后，置于2-8℃冰箱保存，一般不超過(guò)一周。使用前需平衡至室溫。2.菌懸液制備：從新鮮（通常為18-24小時(shí)）的純培養(yǎng)菌落平板上，挑取3-5個(gè)形態(tài)相似的單個(gè)菌落，接種于無(wú)菌生理鹽水或肉湯中，充分混勻，調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（約相當(dāng)于1.5×10^8CFU/ml）。菌液制備后應(yīng)在15分鐘內(nèi)使用。3.接種平板：用無(wú)菌棉拭子蘸取制備好的菌懸液，在試管內(nèi)壁輕輕擠壓以去除多余液體，然后在MH瓊脂平板表面均勻涂布3次，每次涂布后將平板旋轉(zhuǎn)60度，最后沿平板邊緣涂抹一周，以確保菌液均勻分布。接種后將平板水平放置數(shù)分鐘（約3-5分鐘），待瓊脂表面干燥，避免后續(xù)操作時(shí)紙片移位或藥物擴(kuò)散不均。4.貼放藥敏紙片：使用無(wú)菌鑷子或?qū)Ｓ眉埰峙淦?，將選定的抗菌藥物紙片貼在已接種細(xì)菌的瓊脂表面。紙片間距應(yīng)不少于24mm（中心至中心），紙片中心距平板邊緣應(yīng)不少于15mm，以避免相鄰抑菌圈的重疊和邊緣效應(yīng)。貼好后輕壓紙片，確保其與瓊脂表面完全接觸。5.培養(yǎng)：將貼好紙片的平板立即（或在15分鐘內(nèi)）倒置放入35±2℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。一般需培養(yǎng)16-18小時(shí)。對(duì)于某些苛養(yǎng)菌或特定藥物，培養(yǎng)時(shí)間和溫度可能有所調(diào)整，需遵循標(biāo)準(zhǔn)要求。6.抑菌圈測(cè)量：培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板，在黑色背景下利用反射光，用游標(biāo)卡尺或抑菌圈測(cè)量?jī)x精確測(cè)量每個(gè)抑菌圈的直徑（以毫米為單位）。測(cè)量時(shí)應(yīng)取抑菌圈邊緣至邊緣的直徑，不包括紙片本身的直徑。對(duì)于有明顯抑菌圈但圈內(nèi)出現(xiàn)少量菌落（個(gè)別菌落或薄霧狀生長(zhǎng)）的情況，需按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定判斷是否忽略或判為耐藥。四、結(jié)果判讀與解釋抑菌圈直徑的測(cè)量完成后，需參照最新的臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）或其他權(quán)威機(jī)構(gòu)（如EUCAST）發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)判讀表，將測(cè)量得到的抑菌圈直徑數(shù)值轉(zhuǎn)化為“敏感（S）”、“中介（I）”或“耐藥（R）”的定性結(jié)果。*敏感（S）：表示測(cè)試菌能被該抗菌藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的血藥濃度所抑制或殺滅。*中介（I）：包含多種意義，可能是指該菌株對(duì)常規(guī)劑量藥物在體內(nèi)達(dá)到的濃度僅中度敏感，通常提示在藥物濃度較高的部位（如尿液）或使用高劑量藥物時(shí)可能有效；也可能是為了防止微小的技術(shù)因素導(dǎo)致判斷錯(cuò)誤，作為“緩沖帶”存在。*耐藥（R）：表示測(cè)試菌不能被該抗菌藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的血藥濃度所抑制，或提示存在特定的耐藥機(jī)制，臨床治療效果不佳。結(jié)果報(bào)告時(shí)，應(yīng)同時(shí)注明所采用的標(biāo)準(zhǔn)版本及藥物名稱、劑量。五、方法優(yōu)勢(shì)與局限性紙片擴(kuò)散法作為一種成熟的藥敏檢測(cè)技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于：操作簡(jiǎn)便易行，無(wú)需特殊昂貴設(shè)備，成本較低；結(jié)果直觀，判讀相對(duì)容易；可同時(shí)對(duì)一種細(xì)菌進(jìn)行多種抗菌藥物的敏感性檢測(cè)；適合基層實(shí)驗(yàn)室開展。然而，該方法也存在一定的局限性：首先，其結(jié)果是定性或半定量的，無(wú)法直接獲得MIC值；其次，對(duì)某些緩慢生長(zhǎng)菌、苛養(yǎng)菌或特殊耐藥機(jī)制的檢測(cè)敏感性可能不足；藥敏紙片的質(zhì)量、培養(yǎng)基質(zhì)量、菌液濃度、培養(yǎng)條件等多種因素均可影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；對(duì)于抑菌圈大小處于判斷臨界點(diǎn)的菌株，結(jié)果可能存在不確定性，需要復(fù)核或采用其他方法確認(rèn)。六、注意事項(xiàng)與質(zhì)量控制為確保紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，必須嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)量控制程序并注意以下事項(xiàng)：1.標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用：定期使用CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株（如金黃色葡萄球菌ATCC____、大腸埃希菌ATCC____、銅綠假單胞菌ATCC____等）進(jìn)行平行試驗(yàn)，以驗(yàn)證培養(yǎng)基、藥敏紙片、培養(yǎng)條件及操作者技術(shù)的可靠性。質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。2.試劑質(zhì)量控制：確保所用培養(yǎng)基、藥敏紙片、生理鹽水等均在有效期內(nèi)，并按規(guī)定條件儲(chǔ)存和處理。3.操作規(guī)范化：嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，特別是菌液濃度的標(biāo)準(zhǔn)化、平板接種的均勻性、紙片貼放的位置和數(shù)量、培養(yǎng)時(shí)間和溫度的準(zhǔn)確性等。4.環(huán)境控制：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持清潔、無(wú)菌操作區(qū)域符合要求，避免交叉污染。5.人員培訓(xùn)：操作人員需經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)，熟悉方法原理、操作步驟及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，具備識(shí)別異常結(jié)果的能力。6.記錄與報(bào)告：完整記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的關(guān)鍵信息（如菌株編號(hào)、培養(yǎng)基批次、紙片批次、培養(yǎng)條件、質(zhì)控結(jié)果等），結(jié)果報(bào)告應(yīng)準(zhǔn)確、及時(shí)，并符合臨床要求。七、結(jié)語(yǔ)紙片擴(kuò)散藥敏檢測(cè)方法以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)中歷經(jīng)數(shù)十年而不衰，至今仍是許多實(shí)驗(yàn)室，特別是資源有限地區(qū)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抗菌藥物敏感性檢測(cè)的首選方法。盡管自動(dòng)化藥敏檢測(cè)系統(tǒng)日益普及，但紙片擴(kuò)散法在方法學(xué)驗(yàn)證、教學(xué)科研以及特定情況下的