北京市中醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)技術(shù)（如ELISA、分子生物學(xué)）操作考核一、選擇題（每題2分，共20題）1.ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板的清洗主要目的是什么？A.去除未結(jié)合的酶標(biāo)記物B.增強(qiáng)抗體與抗原的結(jié)合C.提高孵育溫度D.減少背景噪聲2.在進(jìn)行WesternBlot實(shí)驗(yàn)時(shí)，SDS電泳結(jié)束后，凝膠應(yīng)立即進(jìn)行什么操作？A.染色B.脫色C.固定D.封閉3.實(shí)驗(yàn)室常用的PCR引物設(shè)計(jì)原則不包括以下哪項(xiàng)？A.引物長度一般為18-25bpB.引物GC含量應(yīng)控制在40%-60%C.引物二級(jí)結(jié)構(gòu)應(yīng)避免形成發(fā)夾環(huán)D.引物序列應(yīng)與人類基因組高度同源4.下列哪種試劑常用于ELISA實(shí)驗(yàn)中封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)？A.Tris-HClB.BSA（牛血清白蛋白）C.SDSD.HCl5.PCR實(shí)驗(yàn)中，DNA聚合酶最適工作溫度通常在多少℃？A.25℃B.37℃C.55℃D.75℃6.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)膜后，膜進(jìn)行封閉操作時(shí)常用的封閉劑是？A.TBS緩沖液B.TBST緩沖液C.5%脫脂奶粉D.0.1%Tween-207.ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)儀檢測波長通常選擇多少nm？A.450nmB.600nmC.750nmD.900nm8.在進(jìn)行Real-timePCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，熒光信號(hào)的檢測通常在哪個(gè)階段？A.變性階段B.退火階段C.延伸階段D.循環(huán)初期9.下列哪種方法常用于DNA的提??？A.液體閃爍計(jì)數(shù)法B.離子交換色譜法C.毛細(xì)管電泳法D.流式細(xì)胞術(shù)10.ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板孵育時(shí)間通常為多久？A.10分鐘B.30分鐘C.60分鐘D.90分鐘二、判斷題（每題2分，共10題）1.PCR實(shí)驗(yàn)中，退火溫度越高，PCR產(chǎn)物特異性越好。（×）2.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，一抗和二抗不能同時(shí)使用。（×）3.ELISA實(shí)驗(yàn)中，洗滌酶標(biāo)板時(shí)，洗滌次數(shù)越多越好。（×）4.Real-timePCR實(shí)驗(yàn)中，需要設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。（√）5.DNA提取過程中，氯仿-異戊醇抽提法常用于去除蛋白質(zhì)。（√）6.PCR實(shí)驗(yàn)中，引物二聚體過多會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低。（√）7.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，封閉不充分會(huì)導(dǎo)致背景過高。（√）8.ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板需用蒸餾水潤洗三次。（×）9.Real-timePCR實(shí)驗(yàn)中，熒光染料法只能檢測雙鏈DNA。（×）10.DNA凝膠電泳時(shí)，溴化乙錠（EB）用于染色DNA片段。（√）三、簡答題（每題5分，共5題）1.簡述ELISA實(shí)驗(yàn)的基本步驟。2.解釋SDS電泳的原理。3.說明PCR實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計(jì)的基本原則。4.描述WesternBlot實(shí)驗(yàn)中一抗和二抗的作用。5.比較Real-timePCR和普通PCR的優(yōu)缺點(diǎn)。四、操作題（每題10分，共2題）1.請(qǐng)簡述ELISA實(shí)驗(yàn)中酶標(biāo)板洗滌的操作步驟及注意事項(xiàng)。2.請(qǐng)描述WesternBlot實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)膜的操作步驟及關(guān)鍵控制點(diǎn)。答案與解析一、選擇題答案與解析1.A解析：ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板的清洗主要目的是去除未結(jié)合的酶標(biāo)記物，減少背景噪聲，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.C解析：SDS電泳結(jié)束后，凝膠需立即進(jìn)行固定，以穩(wěn)定蛋白質(zhì)條帶，便于后續(xù)的轉(zhuǎn)膜或染色操作。3.D解析：PCR引物設(shè)計(jì)原則包括引物長度、GC含量、避免二級(jí)結(jié)構(gòu)、特異性等，但引物序列應(yīng)與目標(biāo)基因同源，而非人類基因組。4.B解析：BSA（牛血清白蛋白）是常用的封閉劑，能有效封閉酶標(biāo)板非特異性結(jié)合位點(diǎn)，提高實(shí)驗(yàn)特異性。5.B解析：DNA聚合酶的最適工作溫度通常在37℃，以保證高效擴(kuò)增。6.C解析：5%脫脂奶粉是常用的封閉劑，能封閉膜的非特異性位點(diǎn)，提高抗體結(jié)合效率。7.A解析：ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)儀檢測波長通常選擇450nm，因該波長下酶標(biāo)板的背景噪聲較低。8.C解析：Real-timePCR實(shí)驗(yàn)中，熒光信號(hào)的檢測通常在延伸階段，此時(shí)熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物量成正比。9.B解析：離子交換色譜法是常用的DNA提取方法，能有效分離純化DNA。10.C解析：ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板孵育時(shí)間通常為60分鐘，以保證抗體充分結(jié)合。二、判斷題答案與解析1.×解析：退火溫度越高，PCR產(chǎn)物特異性越差，容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。2.×解析：WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，一抗和二抗可同時(shí)使用，以提高檢測效率。3.×解析：洗滌酶標(biāo)板時(shí)，過多洗滌會(huì)導(dǎo)致結(jié)合的酶標(biāo)記物流失，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4.√解析：Real-timePCR實(shí)驗(yàn)中，必須設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，以排除假陽性或假陰性結(jié)果。5.√解析：氯仿-異戊醇抽提法能有效去除蛋白質(zhì)，提高DNA純度。6.√解析：引物二聚體過多會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。7.√解析：封閉不充分會(huì)導(dǎo)致背景過高，影響抗體結(jié)合效率。8.×解析：ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板需用洗滌液（如PBS-T）潤洗三次，而非蒸餾水。9.×解析：Real-timePCR實(shí)驗(yàn)中，熒光染料法（如SYBRGreen）可檢測單鏈和雙鏈DNA。10.√解析：溴化乙錠（EB）是常用的DNA染色劑，能特異性結(jié)合DNA片段，使其在凝膠電泳中顯色。三、簡答題答案與解析1.ELISA實(shí)驗(yàn)的基本步驟-包被：將抗原或抗體包被在酶標(biāo)板上，4℃過夜。-洗滌：用洗滌液洗滌酶標(biāo)板三次，去除未結(jié)合物質(zhì)。-封閉：用封閉液（如BSA）封閉酶標(biāo)板非特異性位點(diǎn)，1小時(shí)。-洗滌：同上。-加一抗：加入特異性抗體，1小時(shí)。-洗滌：同上。-加二抗：加入酶標(biāo)記的二抗，1小時(shí)。-洗滌：同上。-加底物：加入酶底物，避光反應(yīng)30分鐘。-洗滌：用洗滌液洗滌酶標(biāo)板三次，終止反應(yīng)。-讀板：用酶標(biāo)儀檢測吸光度值。2.SDS電泳的原理SDS（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）利用SDS使蛋白質(zhì)變性并帶負(fù)電荷，按分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中分離。SDS能掩蓋蛋白質(zhì)電荷，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子量，分子量越小，遷移速率越快。3.PCR實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計(jì)的基本原則-引物長度：18-25bp。-GC含量：40%-60%。-特異性：引物序列應(yīng)與目標(biāo)基因高度互補(bǔ)，避免非特異性結(jié)合。-避免二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物二級(jí)結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾環(huán)、引物二聚體）應(yīng)盡量避免。-退火溫度：引物退火溫度應(yīng)與PCR反應(yīng)溫度匹配。4.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中一抗和二抗的作用-一抗：特異性識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)蛋白，需與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。-二抗：識(shí)別并結(jié)合一抗，通常標(biāo)記有酶（如HRP），用于信號(hào)放大。5.Real-timePCR和普通PCR的優(yōu)缺點(diǎn)-Real-timePCR：優(yōu)點(diǎn)：可定量檢測PCR產(chǎn)物，實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增過程，靈敏度高。缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜。-普通PCR：優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，成本低。缺點(diǎn)：只能定性檢測，無法定量。四、操作題答案與解析1.ELISA實(shí)驗(yàn)中酶標(biāo)板洗滌的操作步驟及注意事項(xiàng)-步驟：1.用洗滌液（如PBS-T）將酶標(biāo)板充分潤洗，室溫靜置1-2分鐘。2.吸出洗滌液，用吸水紙拍干（避免氣泡）。3.重復(fù)以上步驟三次。-注意事項(xiàng)：-洗滌液需預(yù)溫至室溫，避免溫度變化影響結(jié)合效率。-洗滌時(shí)需充分拍干，避免殘留液體影響后續(xù)操作。-洗滌次數(shù)不宜過多，一般為3-4次，過多會(huì)導(dǎo)致結(jié)合物流失。2.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)膜的操作步驟及關(guān)鍵控制點(diǎn)-步驟：1.將SDS凝膠置于轉(zhuǎn)膜槽中，用轉(zhuǎn)膜緩沖液（如Tris-Glycine）平衡30分鐘。2.將PVDF膜或NC膜覆蓋在凝膠上，用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕。3.連接轉(zhuǎn)膜電泳儀，設(shè)置