附件2化妝品防腐劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)技術(shù)指南（征求意見(jiàn)稿）1.范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化妝品防腐效能的評(píng)價(jià)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于含水的（AW≥0.7）乳液類和膏霜類等常見(jiàn)化妝品防腐體系效能評(píng)價(jià)。2.術(shù)語(yǔ)和定義2.1防腐效能評(píng)價(jià)試驗(yàn)將一定量的微生物人工污染到化妝品中，模擬化妝品可能出現(xiàn)的污染情況，每隔一定時(shí)間檢測(cè)其中的存活菌量，根據(jù)存活菌量的變化評(píng)價(jià)化妝品防腐體系效能的試驗(yàn)方法。2.2中和劑可添加至化妝品和微生物混和物中，消除化妝品對(duì)微生物抑制或殺滅作用的試劑。2.3淋洗類化妝品在人體表面（皮膚、毛發(fā)、甲、口唇等）使用后及時(shí)清洗的化妝品。2.4駐留類化妝品除淋洗類產(chǎn)品外的化妝品。3.設(shè)備和材料3.1生物安全柜。3.2高壓蒸汽滅菌器。3.3天平：感量為0.1g。3.4恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃、28℃±2℃。3.5均質(zhì)器。3.6無(wú)菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。3.7顯微鏡。3.8酸度計(jì)。3.9滅菌平皿：直徑90mm。4.培養(yǎng)基和試劑4.10.85%生理鹽水。4.2含0.05%(v/v)聚山梨酯80的生理鹽水，見(jiàn)附錄A.1。4.3含0.05%(v/v)聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，見(jiàn)附錄A.2。4.4胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），見(jiàn)附錄A.3。4.5沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)，見(jiàn)附錄A.4。4.6SCDLP液體培養(yǎng)基，見(jiàn)附錄A.5。4.7改良EugonLT100肉湯，見(jiàn)附錄A.6。4.8D/E肉湯，見(jiàn)附錄A.7。4.9改良Letheen肉湯，見(jiàn)附錄A.8。5.實(shí)驗(yàn)菌株5.1細(xì)菌：金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003大腸埃希氏菌CMCC（B）44102銅綠假單胞菌CMCC（B）10104表皮葡萄球菌CMCC（B）266295.2真菌：黑曲霉CMCC（F）98003白色念珠菌CMCC（F）98001在進(jìn)行化妝品防腐效能評(píng)價(jià)試驗(yàn)時(shí)，可根據(jù)需要增加其他相關(guān)細(xì)菌或真菌作為測(cè)試菌株。如不采用本指南推薦的菌株，需說(shuō)明菌株與指南中載明的菌株開(kāi)展過(guò)驗(yàn)證，并且結(jié)果一致。6.實(shí)驗(yàn)方法6.1供試品微生物檢測(cè)取不少于2份包裝完好的供試化妝品樣品，依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第五章微生物檢驗(yàn)方法中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌檢驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。供試品微生物檢測(cè)的結(jié)果可記為Nf。6.2微生物懸液制備6.2.1細(xì)菌懸液制備用接種環(huán)從菌種保存管中（或試管斜面上）取適量菌體，分區(qū)劃線接種于TSA平板上，36℃±1℃，培養(yǎng)18h?24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)物，分區(qū)劃線接種于TSA平板，36℃±1℃，培養(yǎng)18h?24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，分區(qū)劃線接種于TSA平板，36℃±1℃，培養(yǎng)18h?24h，即為第3代培養(yǎng)物。用無(wú)菌棉簽取菌苔加入無(wú)菌生理鹽水中，渦旋混勻。用無(wú)菌生理鹽水將其稀釋成約1×107CFU/mL?1×108CFU/mL的菌懸液。制備好的菌懸液應(yīng)在2h內(nèi)使用，或在2℃?8℃保存不超過(guò)24h。6.2.2白色念珠菌菌懸液的制備用接種環(huán)從菌種保存管中（或試管斜面上）取適量菌體，分區(qū)劃線接種于SDA平板上，28℃±2℃，培養(yǎng)48h?72h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)物，分區(qū)劃線接種于SDA平板，28℃±2℃，培養(yǎng)48h?72h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，分區(qū)劃線接種于SDA平板，28℃±2℃培養(yǎng)48h?72h，即為第3代培養(yǎng)物。用無(wú)菌棉簽取菌苔加入無(wú)菌生理鹽水中，渦旋混勻。用無(wú)菌生理鹽水將其稀釋成約1×106CFU/mL?1×107CFU/mL的菌懸液。制備好的菌懸液應(yīng)在2h內(nèi)使用，或在2℃?8℃保存不超過(guò)24h。6.2.3黑曲霉孢子懸液的制備用接種環(huán)從菌種保存管中（或試管斜面上）取適量的菌體，分區(qū)劃線接種于SDA平板上，28℃±2℃培養(yǎng)3d～5d。用無(wú)菌棉簽取菌苔加入含0.05%(v/v)聚山梨酯80無(wú)菌生理鹽水中，制備孢子懸液，輕輕振搖1min后，用無(wú)菌玻璃棉過(guò)濾除去菌絲。用含0.05%(v/v)聚山梨酯80無(wú)菌生理鹽水將其稀釋成約1×106CFU/mL?1×107CFU/mL的孢子懸液。制備好的孢子懸液應(yīng)當(dāng)天使用或在2℃?8℃保存不超過(guò)7d，使用前混合均勻，并在顯微鏡下觀察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，則棄之不用。表1實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003TSA36℃±1℃18h?24h大腸埃希氏菌CMCC（B）44102TSA36℃±1℃18h?24h銅綠假單胞菌CMCC（B）10104TSA36℃±1℃18h?24h表皮葡萄球菌CMCC（B）26629TSA36℃±1℃18h?24h黑曲霉CMCC（F）98003SDA28℃±2℃3d?5d白色念珠菌CMCC（F）98001SDA28℃±2℃48h?72h注：實(shí)驗(yàn)室增加的其他測(cè)試菌株可參考以上細(xì)菌及真菌的培養(yǎng)溫度和時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。6.3中和劑效果驗(yàn)證試驗(yàn)6.3.1工作菌懸液制備用稀釋液將上述菌懸液10倍系列稀釋至103CFU/mL，用于中和劑效果驗(yàn)證。6.3.2驗(yàn)證試驗(yàn)分組每種試驗(yàn)菌株的中和劑效果驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)分別進(jìn)行。試驗(yàn)分為以下三組，按如下方法進(jìn)行供試液染菌。試驗(yàn)組：將1g(mL)供試品加入9mL中和劑中混勻，室溫放置30min±15min，使其充分作用；中和劑對(duì)照組：將1mL稀釋液加入9mL中和劑中，室溫放置30min±15min；菌液對(duì)照組：10mL稀釋液。在以上三組中，分別加入6.3.1中制備的工作菌懸液各1mL。6.3.3培養(yǎng)與計(jì)數(shù)分別對(duì)試驗(yàn)組、中和劑對(duì)照組和菌液對(duì)照組進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每組接種兩個(gè)平皿。各組計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值，試驗(yàn)組計(jì)數(shù)結(jié)果記作Nvf，中和劑對(duì)照組計(jì)數(shù)結(jié)果記作Nvn，菌液對(duì)照組計(jì)數(shù)結(jié)果記作Nv，6.1中供試品微生物檢測(cè)組結(jié)果記作Nf。6.3.4結(jié)果判定當(dāng)Nvn/Nv接近（如0.5≤Nvn/Nv≤2），并且（Nvf-Nf）/Nvn≥0.5時(shí)，判定中和劑有良好的中和效果，通過(guò)中和效果驗(yàn)證。若供試樣品測(cè)試未能通過(guò)中和效果驗(yàn)證，可以更換中和劑或增加中和劑用量?？蛇x用的中和劑請(qǐng)參考附錄A.5～A.8，或根據(jù)需求選擇適宜的中和劑進(jìn)行中和效果驗(yàn)證。6.4供試品防腐效能測(cè)試6.4.1供試品染菌防腐效能測(cè)試實(shí)驗(yàn)采用單一菌種染菌的測(cè)試方式，即分別用每種測(cè)試菌株的菌懸液人工污染供試化妝品，每隔一定時(shí)間檢測(cè)其中的存活菌量，根據(jù)存活菌量的變化判斷化妝品防腐體系效能。分別取6.2中制備的菌液，加入裝有不少于20g(mL)供試化妝品原包裝中，或加入裝有20g(mL)供試化妝品的適宜容器中，充分混勻，菌液的接種體積不得超過(guò)供試化妝品體積的1%。細(xì)菌的染菌濃度為1×105CFU/g(mL)?1×106CFU/g(mL)，黑曲霉和白色念珠菌的染菌濃度為1×104CFU/g(mL)?1×105CFU/g(mL)。染菌后的樣品放置于25℃±1℃培養(yǎng)箱中，分別在1、7、14和28天檢測(cè)其中的存活菌量，分別計(jì)作Nx（X=1，7，14，28）。6.4.2計(jì)數(shù)方法放置至規(guī)定時(shí)間后，取1g（mL）染菌樣品，加入9mL經(jīng)6.3驗(yàn)證有效的中和劑中（樣品的稀釋倍數(shù)應(yīng)與6.3中和劑中和樣品的稀釋倍數(shù)保持一致，保證樣品中的抑菌成分可以有效中和），充分混勻。室溫中和30min±15min后，吸取2mL樣液，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL，將45℃?50℃的相應(yīng)培養(yǎng)基15mL注入平板，混勻，凝固后按要求進(jìn)行倒置培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。如平板上預(yù)期生長(zhǎng)菌落數(shù)較多，可進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇適宜的稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果報(bào)告方式可參考《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第五章2.菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法和6.霉菌和酵母菌檢驗(yàn)方法。6.4.3計(jì)算方法化妝品防腐效能評(píng)價(jià)可以用供試品中存活菌量常用對(duì)數(shù)減少值（Rx）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算方式見(jiàn)式（1）：Rx=lgN0-lgNx………（1）式中：N0——供試樣品初始染菌量的常用對(duì)數(shù)值。（即染菌菌懸液濃度的常用對(duì)數(shù)值）Nx——不同檢測(cè)時(shí)間，供試樣品中存活菌量的常用對(duì)數(shù)值。6.4.4結(jié)果判定不同取樣時(shí)間供試品中存活菌量常用對(duì)數(shù)減少值()a細(xì)菌白色念珠菌黑曲霉T1bT7T14T28T7T14T28T14T28判定標(biāo)準(zhǔn)A≤5c≥3≥3且NId≥3且NI≥1≥1且NI≥1且NI≥0f≥1且NI判定標(biāo)準(zhǔn)B≤5c-e≥3≥3且NI-≥1≥1且NI≥0≥0且NIa.在防腐效能測(cè)試中，可接受偏差范圍為±0.5log。b.T1測(cè)試時(shí)間為供試品染菌后22?24小時(shí)；c.僅駐留類供試品需在T1時(shí)間點(diǎn)測(cè)試，淋洗類供試品無(wú)需在T1時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試。T1時(shí)間點(diǎn)的測(cè)試菌株包括金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌和表皮葡萄球菌，任一細(xì)菌的測(cè)試結(jié)果滿足≤5即認(rèn)為符合T1時(shí)間點(diǎn)的評(píng)價(jià)要求；T7、T14和T28時(shí)間點(diǎn)除表皮葡萄球菌外，需所有測(cè)試菌株均滿足表中相應(yīng)要求。d.NI：與上一時(shí)間點(diǎn)的計(jì)數(shù)結(jié)果相比，差異未超過(guò)±0.5log；e.“–”表示無(wú)需進(jìn)行測(cè)試；f.Nx與初始染菌量N0相比，差異未超過(guò)±0.5log時(shí)，Rx=0。—判定標(biāo)準(zhǔn)A，適用于不考慮其它控制因素條件下，產(chǎn)品配方能有效防止可能會(huì)對(duì)消費(fèi)者構(gòu)成潛在安全風(fēng)險(xiǎn)微生物增殖的產(chǎn)品?！卸?biāo)準(zhǔn)B，適用于除產(chǎn)品組方因素外，對(duì)微生物污染采取了經(jīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有效的其他控制方式的產(chǎn)品。參考《化妝品安全評(píng)估技術(shù)導(dǎo)則》（2021年版）6.3.3部分，如屬于不易受微生物污染的產(chǎn)品，即非含水產(chǎn)品、有機(jī)溶劑為主的產(chǎn)品、含水產(chǎn)品中如水活度<0.7、乙醇含量>20％（體積）、高/低pH值（≥10或≤3）、一次性或包裝不能開(kāi)啟類型的產(chǎn)品，可不進(jìn)行防腐效能評(píng)價(jià)。附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1含0.05%(v/v)聚山梨酯80的生理鹽水成分:氯化鈉8.5g聚山梨酯800.5g水1000mL制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌20min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.0±0.2。A.2含0.05%(v/v)聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液成分:無(wú)水磷酸氫二鈉5.8g磷酸二氫鉀3.6g氯化鈉4.3g蛋白胨1.0g聚山梨酯800.5g水1000mL制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.0后的培養(yǎng)。A.3胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）成分:胰酪胨15.0g大豆蛋白胨5.0g氯化鈉5.0g瓊脂15.0g水1000mL制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.3后的培養(yǎng)。A.4沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)成分:蛋白胨10.0g葡萄糖40.0g瓊脂15.0g水1000mL制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為5.6后的培養(yǎng)。A.5SCDLP液體培養(yǎng)基成分:胰酪胨17.0g大豆蛋白胨3.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1.0g吐溫807.0g水1000mL制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌20min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.2后的培養(yǎng)。A.6EugonLT100肉湯成分:胰蛋白胨15.0g大豆蛋白胨5.0g氯化鈉4.0gL-胱氨酸0.7g亞硫酸鈉0.2g葡萄糖5.5g卵磷脂1.0g吐溫805.0g辛基酚聚醚-91.0g水1000mL制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.0后的培養(yǎng)。A.7D/E肉湯成分:酵母浸粉2.5g胰蛋白胨5.0g葡萄糖10.0g亞硫酸氫鈉2.5g卵磷脂7.0g硫代硫酸鈉6.0g溴甲酚紫0.02g硫乙醇酸鈉1.0g吐溫805.0g水1000mL制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.6后的培養(yǎng)。A.8改良Letheen肉湯成分:牛肉浸粉5.0g氯化鈉5.0g卵磷脂0.7g吐溫805.0g酵母浸粉2.0g亞硫酸氫鈉0.1g酪蛋白胰酶水解物5.0g肉類胃蛋白酶水解物20.0g水1000mL制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.2后的培養(yǎng)。

化妝品防腐劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)技術(shù)指南（征求意見(jiàn)稿）起草說(shuō)明為加強(qiáng)化妝品的監(jiān)督管理，進(jìn)一步提高化妝品使用安全性，中國(guó)食品藥品檢定研究院組織開(kāi)展了化妝品微生物學(xué)防腐效能評(píng)價(jià)的研究制訂工作。現(xiàn)就工作有關(guān)情況說(shuō)明如下：一、起草原則本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化妝品防腐效能的評(píng)價(jià)方法，適用于親水性的膏、霜、乳劑及水劑類等常見(jiàn)化妝品防腐體系效能評(píng)價(jià)。為保證評(píng)價(jià)方法的科學(xué)性，本次驗(yàn)證在樣品選擇上不僅涵蓋了市場(chǎng)上不同防腐體系的化妝品，而且覆蓋了不同的類別，同時(shí)組織6家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作驗(yàn)證，充分考量了實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性。二、起草過(guò)程化妝品標(biāo)準(zhǔn)專家委員會(huì)于2024年1月委托開(kāi)展了化妝品微生物學(xué)防腐效能評(píng)價(jià)方法的制定工作。由中國(guó)食品藥品檢定研究院（以下簡(jiǎn)稱中檢院）負(fù)責(zé)牽頭驗(yàn)證，廣東省藥品檢驗(yàn)所、湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院、四川省藥品檢驗(yàn)研究院（四川省醫(yī)療器械檢測(cè)中心）、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院、江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院6家外部實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證工作，同時(shí)組織花王（中國(guó)）研究開(kāi)發(fā)中心有限公司、北京寶潔技術(shù)有限公司、資生堂（中國(guó)）投資有限公司、華熙生物科技股份有限公司、上海家化聯(lián)合股份有限公司、聯(lián)合利華（中國(guó)）有限公司上海分公司、皮爾法伯(上海)化妝品貿(mào)易有限公司、袋鼠媽媽:廣州天然國(guó)度生物科技有限公司、諾斯貝爾化妝品股份有限公司、養(yǎng)生堂(安吉)化妝品有限公司參與項(xiàng)目調(diào)研、文本討論及驗(yàn)證工作。前期準(zhǔn)備工作包括查閱文獻(xiàn)、參考相關(guān)的國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、研究實(shí)驗(yàn)方案、化妝品樣品的篩選、方法驗(yàn)證用菌株的制備和中和劑的篩選等。擬定驗(yàn)證化妝品樣品和驗(yàn)證方法后，開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)室間的協(xié)作驗(yàn)證，根據(jù)項(xiàng)目中期專家及企業(yè)的意見(jiàn)，完善了評(píng)價(jià)方法，整理了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，經(jīng)整理歸納后，最終形成了化妝品防腐效能評(píng)價(jià)文本和驗(yàn)證報(bào)告。三、國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)情況目前我國(guó)用于化妝品防腐效能評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)是團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/SHRH017-2019化妝品防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)和T/GDCDC010-2019化妝品防腐挑戰(zhàn)性測(cè)試方法和《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）通則1121抑菌效力檢查法。國(guó)際上主要用于化妝品防腐效能評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)為Cosmetics—Microbiology—Evaluationoftheantimicrobialprotectionofacosmeticproduct（ISO11930-2019），CTFAmicrobiologyguidelines（2007），AOACOfficaialMethod998.10EfficacyofPreservationofNon-EyeAreaWater-MiscibleCosmeticandToiletryFormulations,USP43-NF38<51>ANTIMICROBIALEFFECTIVENESSTESTING。表1主要相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)列表序號(hào)來(lái)源國(guó)家或組織標(biāo)準(zhǔn)號(hào)/版本號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱檢測(cè)范圍/適用基質(zhì)與制修訂標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系1中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)2020版《中華人民共和國(guó)藥典》通則1121抑菌效力檢查法。藥品非等效2上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)T/SHRH017-2019化妝品防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)化妝品非等效3廣東省日化商會(huì)T/GDCDC010-2019化妝品防腐挑戰(zhàn)性測(cè)試方法化妝品非等效4國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO11930-2019Cosmetics—Microbiology—Evaluationoftheantimicrobialprotectionofacosmeticproduct化妝品非等效5美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AOAC998.10-2009EfficacyofPreservationofNon-EyeAreaWater-MiscibleCosmeticandToiletryFormulations化妝品非等效6美國(guó)藥典委員會(huì)USP43-NF38<51>ANTIMICROBIALEFFECTIVENESSTESTING化妝品非等效四、實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證情況本次評(píng)價(jià)方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)主要參考了Cosmetics—Microbiology—Evaluationoftheantimicrobialprotectionofac