基于分子模擬技術(shù)的抗CD47抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測與人源化改造：從理論到實踐的深度探索一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新發(fā)癌癥病例1929萬例，癌癥死亡病例996萬例。從數(shù)據(jù)可以看出，癌癥對人類生命健康造成了巨大的危害，給社會和家庭帶來了沉重的負擔(dān)。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在癌癥治療領(lǐng)域取得了顯著進展，如手術(shù)、化療、放療以及近年來興起的免疫治療等，但許多癌癥患者的預(yù)后仍然不容樂觀，尤其是對于晚期癌癥患者，治療手段的局限性更為明顯。因此，開發(fā)更為有效的癌癥治療方法和藥物，成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。在癌癥免疫治療的眾多靶點中，CD47備受關(guān)注。CD47，即整合素相關(guān)蛋白，是一種廣泛表達于各種細胞膜表面的跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。在機體正常生理狀態(tài)下，CD47可維持自身細胞的免疫耐受，起到“別吃我”（“don’teatme”）信號的作用。然而，在病理狀態(tài)下，大量研究表明，CD47在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體瘤細胞表面呈高表達狀態(tài)。例如，在急性髓系白血病（AML）患者中，白血病細胞通過高表達CD47，與吞噬細胞（巨噬細胞、樹突狀細胞等）上的受體如SIRPα結(jié)合，進而啟動一系列抑制性信號，抑制吞噬細胞對腫瘤細胞的吞噬清除功能，使得腫瘤細胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視，得以持續(xù)增殖和擴散。這種免疫逃逸機制是癌癥難以被有效治療的重要原因之一。因此，阻斷CD47-SIRPα通路，成為了癌癥免疫治療的一個極具潛力的策略?？笴D47抗體作為一種能夠特異性阻斷CD47-SIRPα相互作用的生物制劑，在癌癥治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。通過與腫瘤細胞表面的CD47結(jié)合，抗CD47抗體可以阻斷“別吃我”信號的傳遞，從而激活巨噬細胞等吞噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。多項臨床前研究和早期臨床試驗已經(jīng)證實了抗CD47抗體在多種癌癥類型中的有效性。在非霍奇金淋巴瘤的治療中，抗CD47抗體聯(lián)合利妥昔單抗的治療方案顯示出了顯著的協(xié)同抗腫瘤效果；在急性髓系白血病的研究中，抗CD47抗體能夠重新激活機體固有免疫系統(tǒng)，達到清除腫瘤細胞的效果。然而，目前抗CD47抗體的臨床應(yīng)用仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，其中最為突出的問題是其免疫原性和潛在的副作用。由于抗CD47抗體通常來源于非人類物種，如小鼠，當(dāng)應(yīng)用于人體時，可能會引發(fā)人體免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，產(chǎn)生人抗小鼠抗體（HAMA）反應(yīng)，不僅降低了抗體的治療效果，還可能導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用的安全性和有效性。為了克服抗CD47抗體的免疫原性問題，人源化改造成為了關(guān)鍵的研究方向。人源化抗體是指將源自非人類（如小鼠）的抗體轉(zhuǎn)化為對人類免疫系統(tǒng)更加友好的形式，通過將抗體的互補決定區(qū)（CDRs），即直接與抗原結(jié)合的部分，移植到人類抗體的框架區(qū)（FRs）上，在保持抗體特異性和親和力的同時，降低其免疫原性。然而，傳統(tǒng)的人源化改造方法存在一定的局限性，如改造過程復(fù)雜、成本高、周期長，且難以保證改造后的抗體在親和力和特異性方面的穩(wěn)定性。隨著計算機技術(shù)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，分子模擬技術(shù)應(yīng)運而生，并在抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測和人源化改造中發(fā)揮著日益重要的作用。分子模擬技術(shù)是一種利用計算機以原子水平的分子模型來模擬分子結(jié)構(gòu)與運動，進而模擬分子體系的各種物理、化學(xué)性質(zhì)的方法。在抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測方面，分子模擬技術(shù)可以通過計算機程序，根據(jù)抗體的氨基酸序列，預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)和動態(tài)行為，以及與抗原之間的相互作用和反應(yīng)。這種預(yù)測能力有助于深入理解抗體的作用機制，為抗體的優(yōu)化和改造提供重要的理論依據(jù)。在人源化改造中，分子模擬技術(shù)可以利用計算工具和算法，預(yù)測哪些氨基酸殘基的變化對于降低免疫原性最有效，同時保持抗體的功能。通過虛擬篩選和模擬實驗，可以在短時間內(nèi)評估大量的改造方案，篩選出最具潛力的人源化抗體，從而大大提高人源化改造的效率和成功率，降低研發(fā)成本和周期。綜上所述，基于分子模擬技術(shù)的抗CD47抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測與人源化改造研究具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。一方面，通過深入研究抗CD47抗體的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，利用分子模擬技術(shù)實現(xiàn)精準的人源化改造，有望開發(fā)出更安全、更有效的抗CD47抗體藥物，為癌癥患者提供新的治療選擇，提高癌癥治療的效果和患者的生存率；另一方面，本研究也將為抗體藥物的研發(fā)提供新的思路和方法，推動分子模擬技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，促進癌癥免疫治療技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1國外研究進展在國外，抗CD47抗體的研究起步較早，取得了一系列重要成果。自2009年斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院著名癌癥干細胞專家IrvingWeissman教授在Cell發(fā)表論文，明確腫瘤細胞高表達CD47與巨噬細胞表面的信號調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）結(jié)合釋放“別吃我”信號以逃避巨噬細胞吞噬的機制后，CD47迅速成為癌癥免疫治療的熱門靶點。此后，眾多科研機構(gòu)和藥企圍繞抗CD47抗體展開了深入研究和藥物開發(fā)。在藥物研發(fā)方面，F(xiàn)ortySeven公司開發(fā)的magrolimab是第一代抗CD47抗體的代表。早期臨床試驗表明，magrolimab單藥或與其他藥物聯(lián)合使用，在治療急性髓系白血?。ˋML）、骨髓增生異常綜合征（MDS）等血液系統(tǒng)惡性腫瘤中顯示出一定的療效信號。在與阿扎胞苷聯(lián)合治療AML的臨床試驗中，部分患者的病情得到緩解，生存期有所延長。然而，magrolimab存在明顯的局限性，它可引起紅細胞凝集，與紅細胞結(jié)合力較強，易引發(fā)貧血等副作用，這在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。為了克服第一代抗CD47抗體的缺陷，第二代抗CD47抗體應(yīng)運而生，以CC9002、IBI188等為代表。這些抗體在研發(fā)過程中進行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，避免了體外紅細胞凝集的問題。但它們?nèi)匀慌c紅細胞有一定程度的結(jié)合，臨床上通常需要采用預(yù)激給藥策略，先給予小劑量抗體，使機體適應(yīng)后再逐漸增加劑量，以降低紅細胞毒性。盡管如此，這種給藥方式增加了治療的復(fù)雜性和患者的負擔(dān)，且無法完全消除紅細胞毒性帶來的潛在風(fēng)險。隨著研究的不斷深入，第三代抗CD47抗體，如TJC4（lemzoparlimab，來佐利單抗）、AK117等，展現(xiàn)出了更優(yōu)越的性能。它們最大的特點是不引起紅細胞凝集，且與紅細胞的結(jié)合低。天境生物在TJC4研發(fā)過程中采用了獨特的兩步篩選策略：首先通過人源天然噬菌體展示技術(shù)篩選出可以結(jié)合在稀有表位上的CD47抗體；隨后通過負向篩選，找到與紅細胞低親和力的抗體。晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，來佐利單抗以更加筆直的方式結(jié)合在CD47表面，其結(jié)合表位除常見的FGloop外，還可結(jié)合至獨特的BCloop。進一步研究表明，紅細胞表面CD47的糖基化修飾在BCloop上存在2個N糖基化修飾位點，與來佐利單抗的結(jié)合抗原表位非常接近，這些糖基化修飾恰好減弱了來佐利單抗與紅細胞的結(jié)合，從而降低了紅細胞毒性，提高了藥物的安全性。在分子模擬技術(shù)應(yīng)用方面，國外的研究也處于前沿水平。一些研究團隊利用分子動力學(xué)模擬方法，深入研究抗CD47抗體與CD47蛋白的相互作用機制，從原子層面揭示抗體與抗原結(jié)合的動態(tài)過程，為抗體的優(yōu)化設(shè)計提供了重要的理論依據(jù)。通過模擬抗體與CD47蛋白結(jié)合前后的構(gòu)象變化，分析關(guān)鍵氨基酸殘基之間的相互作用，研究人員可以預(yù)測不同突變對抗體親和力和特異性的影響，從而指導(dǎo)抗體的改造和優(yōu)化。美國的一個研究小組通過分子動力學(xué)模擬，成功預(yù)測了CD47抗體的關(guān)鍵氨基酸突變，經(jīng)過實驗驗證，這些突變能夠顯著提高抗體與CD47的結(jié)合親和力，增強其抗腫瘤活性。1.2.2國內(nèi)研究進展國內(nèi)在抗CD47抗體研究和分子模擬技術(shù)應(yīng)用方面也取得了顯著進展。在抗CD47抗體研發(fā)領(lǐng)域，眾多科研機構(gòu)和藥企積極布局，多個項目進入臨床試驗階段。信達生物的letaplimab（IBI188）在國內(nèi)開展了多項臨床試驗，針對多種癌癥類型進行探索。在治療晚期惡性腫瘤的1a期臨床研究中，初步顯示出了一定的安全性和耐受性，雖然整體貧血發(fā)生率為15%，但3級及以上不良反應(yīng)較少，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。康方生物的ligufalimab（AK117）也在積極推進臨床試驗，其在澳洲開展的臨床試驗結(jié)果顯示，受試者對藥物耐受性良好，無劑量限制性毒性（DLT）事件發(fā)生，所有劑量爬坡隊列中均未發(fā)生藥物相關(guān)的貧血癥狀，顯示出良好的應(yīng)用前景。中山大學(xué)腫瘤防治中心張翼鷟教授團隊進行了一項關(guān)于新型全人源化CD47單抗在AML中抗白血病效應(yīng)的研究。研究表明，CD47在AML細胞中呈高表達水平，該團隊使用信達生物制藥（蘇州）有限公司自主知識產(chǎn)權(quán)研發(fā)的3種批號的CD47靶點單克隆抗體，證實其可競爭性拮抗原研CD47單克隆抗體B6H12。通過阻斷AML細胞表面高表達的CD47分子與巨噬細胞表面SIRPα配體的相互結(jié)合，重新激活巨噬細胞對AML細胞的吞噬清除，在體內(nèi)外實驗中均表現(xiàn)出良好的抗白血病效應(yīng)，為國產(chǎn)新型全人源化CD47靶點單抗的臨床應(yīng)用提供了重要的前期研究基礎(chǔ)。在分子模擬技術(shù)應(yīng)用方面，國內(nèi)研究團隊也在不斷探索。一些高校和科研機構(gòu)利用分子模擬技術(shù)研究抗CD47抗體的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，通過構(gòu)建抗體的三維結(jié)構(gòu)模型，模擬其與CD47蛋白的結(jié)合過程，分析影響抗體活性的關(guān)鍵因素。清華大學(xué)的研究團隊運用分子模擬技術(shù)，對CD47抗體的框架區(qū)進行優(yōu)化設(shè)計，通過虛擬篩選大量的氨基酸突變組合，預(yù)測出可能降低免疫原性且保持抗體活性的改造方案，為抗體的人源化改造提供了新的思路和方法。此外，國內(nèi)還在不斷加強分子模擬技術(shù)與實驗研究的結(jié)合，通過實驗驗證模擬結(jié)果，進一步提高研究的可靠性和準確性，加速抗CD47抗體藥物的研發(fā)進程。1.2.3當(dāng)前研究的不足和空白盡管國內(nèi)外在抗CD47抗體研究和分子模擬技術(shù)應(yīng)用方面取得了諸多成果，但仍存在一些不足之處和空白領(lǐng)域。在抗CD47抗體研究方面，雖然第三代抗CD47抗體在降低紅細胞毒性方面取得了顯著進展，但目前仍缺乏長期的臨床數(shù)據(jù)來評估其安全性和有效性，尤其是在大規(guī)模人群中的應(yīng)用效果尚待驗證。此外，抗CD47抗體與其他藥物聯(lián)合治療的最佳方案尚未明確，不同藥物之間的協(xié)同作用機制以及聯(lián)合治療可能帶來的副作用等問題仍需深入研究。在實體瘤治療中，抗CD47抗體的療效仍有待提高，如何克服實體瘤的免疫抑制微環(huán)境，增強抗CD47抗體的抗腫瘤效果，是當(dāng)前研究面臨的一大挑戰(zhàn)。在分子模擬技術(shù)應(yīng)用方面，雖然該技術(shù)為抗體的結(jié)構(gòu)預(yù)測和人源化改造提供了有力工具，但目前的模擬方法仍存在一定的局限性。分子模擬過程中所采用的力場和算法對模擬結(jié)果的準確性有較大影響，如何進一步優(yōu)化力場和算法，提高模擬的精度和可靠性，是需要解決的關(guān)鍵問題。此外，分子模擬技術(shù)與實驗技術(shù)的結(jié)合還不夠緊密，模擬結(jié)果與實際實驗數(shù)據(jù)之間可能存在一定偏差，如何更好地整合兩者的數(shù)據(jù)，實現(xiàn)優(yōu)勢互補，也是未來研究的重點方向之一。目前針對抗CD47抗體的分子模擬研究主要集中在抗體與CD47蛋白的結(jié)合機制和結(jié)構(gòu)優(yōu)化方面，對于抗體在體內(nèi)的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)過程的模擬研究相對較少，這方面的研究空白限制了對抗體藥物體內(nèi)行為的深入理解，需要進一步加強探索。1.3研究目的與方法本研究旨在借助分子模擬技術(shù)，實現(xiàn)對抗CD47抗體結(jié)構(gòu)的精準預(yù)測，并在此基礎(chǔ)上進行高效、合理的人源化改造，從而獲得具有低免疫原性、高親和力和特異性的人源化抗CD47抗體，為癌癥免疫治療提供更具潛力的候選藥物。具體研究方法如下：抗CD47抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測：運用生物信息學(xué)方法收集和整理已有的抗CD47抗體氨基酸序列及相關(guān)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，構(gòu)建抗體序列數(shù)據(jù)庫。利用同源建模技術(shù)，以已知結(jié)構(gòu)的抗體為模板，構(gòu)建抗CD47抗體的初始三維結(jié)構(gòu)模型。采用分子動力學(xué)模擬方法，對構(gòu)建的抗體結(jié)構(gòu)模型進行優(yōu)化和動態(tài)分析，模擬抗體在生理環(huán)境中的構(gòu)象變化，深入研究抗體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和動力學(xué)特性。通過結(jié)合自由能計算等方法，評估抗體與CD47抗原的結(jié)合親和力，預(yù)測抗體-抗原相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基和結(jié)合模式?？笴D47抗體人源化改造：基于結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，運用計算機輔助設(shè)計工具，分析抗體的免疫原性區(qū)域，確定需要進行人源化改造的位點。采用CDR移植技術(shù)，將鼠源抗CD47抗體的互補決定區(qū)（CDRs）移植到人源抗體框架區(qū)（FRs）上，構(gòu)建初步的人源化抗體模型。通過分子模擬技術(shù)，對人源化抗體模型進行優(yōu)化，預(yù)測不同氨基酸突變對抗體親和力、特異性和免疫原性的影響，篩選出最佳的人源化改造方案。利用基因工程技術(shù)，合成優(yōu)化后的人源化抗CD47抗體基因，并在合適的表達系統(tǒng)中進行表達和純化，獲得重組人源化抗CD47抗體。實驗驗證：運用多種實驗技術(shù)，如表面等離子共振（SPR）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、細胞流式術(shù)等，對人源化抗CD47抗體的親和力、特異性和免疫原性進行實驗驗證，與分子模擬預(yù)測結(jié)果進行對比分析，評估分子模擬技術(shù)在抗CD47抗體人源化改造中的準確性和可靠性。通過細胞實驗和動物實驗，研究人源化抗CD47抗體對腫瘤細胞的抑制作用和體內(nèi)抗腫瘤效果，評價其作為癌癥治療藥物的潛力和安全性。二、抗CD47抗體概述2.1CD47蛋白結(jié)構(gòu)與功能CD47，作為整合素相關(guān)蛋白，在細胞生命活動和機體生理病理過程中扮演著關(guān)鍵角色。從結(jié)構(gòu)上看，CD47是一種高度糖基化的跨膜蛋白，其分子量約為50kDa。它由N末端的細胞外可變區(qū)域、5個疏水的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)以及一個非常短的C末端的細胞內(nèi)信號序列構(gòu)成。細胞外可變區(qū)域包含一個IgV樣結(jié)構(gòu)域，這是CD47與配體相互作用的關(guān)鍵部位；跨膜螺旋結(jié)構(gòu)使CD47能夠穩(wěn)定地錨定在細胞膜上；而C末端的細胞內(nèi)信號序列則參與細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)過程，將細胞外的信號傳遞到細胞內(nèi)部，從而調(diào)節(jié)細胞的功能。CD47在機體中的分布極為廣泛，幾乎存在于所有人類細胞類型的表面，包括紅細胞、血小板、造血干細胞以及各種腫瘤細胞等。在正常生理狀態(tài)下，CD47起著維持免疫耐受的重要作用。其主要機制是通過與吞噬細胞（如巨噬細胞、樹突狀細胞等）表面的信號調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）相互作用，發(fā)出“別吃我”（“don’teatme”）信號。具體而言，CD47的細胞外IgV樣結(jié)構(gòu)域與SIRPα的N末端V型結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，這種結(jié)合會引發(fā)SIRPα胞內(nèi)段免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）的酪氨酸磷酸化，進而招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP-1和SHP-2），激活一系列抑制性信號通路，抑制吞噬細胞的吞噬活性，使得正常細胞能夠逃避巨噬細胞等免疫細胞的清除，維持機體自身細胞的穩(wěn)定狀態(tài)。例如，正常紅細胞表面的CD47與巨噬細胞表面的SIRPα結(jié)合，有效地阻止了巨噬細胞對紅細胞的吞噬，保證了紅細胞在血液循環(huán)中的正常壽命和功能。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，CD47卻成為了腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視的重要“幫兇”。大量研究表明，多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體瘤細胞表面存在CD47的高表達現(xiàn)象。在急性髓系白血?。ˋML）患者的白血病細胞表面，CD47的表達水平顯著高于正常造血干細胞；在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等實體瘤組織中，CD47的表達量也明顯上調(diào)。腫瘤細胞高表達的CD47與巨噬細胞表面的SIRPα結(jié)合，激活“別吃我”信號，使巨噬細胞無法有效地識別和吞噬腫瘤細胞，從而導(dǎo)致腫瘤細胞能夠在體內(nèi)持續(xù)增殖、擴散，實現(xiàn)免疫逃逸。這種免疫逃逸機制嚴重削弱了機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，使得腫瘤細胞能夠逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊，進而導(dǎo)致腫瘤的惡化和轉(zhuǎn)移。此外，CD47還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、遷移和凋亡等過程，直接促進腫瘤的生長和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，CD47與整合素等細胞表面分子相互作用，能夠激活下游的PI3K/AKT、MAPK等信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活；同時，CD47還可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，使其更容易突破基底膜，進入周圍組織和血管，導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。2.2抗CD47抗體的治療潛力抗CD47抗體作為一種新興的癌癥治療藥物，其治療潛力主要源于其獨特的作用機制，即通過阻斷CD47-SIRPα信號通路，激活巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，從而實現(xiàn)對腫瘤的免疫治療。在正常生理狀態(tài)下，巨噬細胞作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有強大的吞噬能力，能夠識別和清除體內(nèi)的病原體、衰老細胞以及異常細胞。然而，腫瘤細胞通過高表達CD47，與巨噬細胞表面的SIRPα結(jié)合，發(fā)出“別吃我”信號，抑制巨噬細胞的吞噬活性，從而逃避機體的免疫監(jiān)視?？笴D47抗體的出現(xiàn)，打破了這種免疫逃逸的平衡?？笴D47抗體能夠特異性地與腫瘤細胞表面的CD47結(jié)合，阻斷CD47與SIRPα的相互作用，使得“別吃我”信號無法傳遞，從而解除對巨噬細胞吞噬活性的抑制。被激活的巨噬細胞能夠重新識別并吞噬腫瘤細胞，將腫瘤細胞內(nèi)化后，通過溶酶體等機制進行降解，有效地清除腫瘤細胞。巨噬細胞還可以將腫瘤抗原呈遞給T細胞，激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)，進一步增強機體對腫瘤的免疫攻擊。這種先天免疫和適應(yīng)性免疫的協(xié)同作用，使得抗CD47抗體在癌癥治療中展現(xiàn)出巨大的潛力?？笴D47抗體在多種癌癥類型的治療中都顯示出了良好的效果。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面，急性髓系白血?。ˋML）是一種常見且嚴重的血液腫瘤，患者的白血病細胞表面高表達CD47，導(dǎo)致免疫逃逸。臨床前研究表明，抗CD47抗體能夠顯著增強巨噬細胞對AML細胞的吞噬作用，抑制白血病細胞的增殖和存活。在一些臨床試驗中，抗CD47抗體聯(lián)合阿扎胞苷等傳統(tǒng)化療藥物，用于治療初治或復(fù)發(fā)/難治性AML患者，部分患者獲得了完全緩解或部分緩解，生存期得到延長，顯示出了較好的治療前景。在骨髓增生異常綜合征（MDS）的治療中，抗CD47抗體也表現(xiàn)出了一定的療效，能夠改善患者的血細胞減少癥狀，提高生活質(zhì)量。在實體瘤治療領(lǐng)域，抗CD47抗體同樣展現(xiàn)出了潛力。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞表面的CD47表達與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)?？笴D47抗體可以通過阻斷CD47-SIRPα信號通路，激活巨噬細胞對乳腺癌細胞的吞噬作用，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在小鼠乳腺癌模型中，給予抗CD47抗體治療后，腫瘤體積明顯縮小，肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量減少。肺癌作為全球癌癥死亡的主要原因之一，抗CD47抗體也為其治療帶來了新的希望。在非小細胞肺癌（NSCLC）的研究中，抗CD47抗體聯(lián)合免疫檢查點抑制劑（如PD-1/PD-L1抑制劑），能夠增強免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的殺傷作用，提高治療效果。臨床前實驗顯示，聯(lián)合治療組的腫瘤生長抑制率明顯高于單藥治療組，且未增加明顯的毒副作用?？笴D47抗體還具有與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用的潛力。與化療藥物聯(lián)合使用時，抗CD47抗體可以增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提高化療的療效?；熕幬锟梢灾苯託[瘤細胞，而抗CD47抗體則通過激活免疫系統(tǒng)，增強機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和清除能力，兩者相互協(xié)同，發(fā)揮更好的治療效果?？笴D47抗體與放療聯(lián)合應(yīng)用也具有協(xié)同作用。放療可以通過電離輻射直接損傷腫瘤細胞的DNA，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡；同時，放療還可以誘導(dǎo)腫瘤細胞釋放腫瘤相關(guān)抗原，激活免疫系統(tǒng)?？笴D47抗體則可以進一步增強免疫系統(tǒng)對放療后腫瘤細胞的識別和清除能力，提高放療的局部控制率和整體療效。盡管抗CD47抗體在癌癥治療中展現(xiàn)出了巨大的治療潛力，但目前仍面臨一些挑戰(zhàn)。如前文所述，抗CD47抗體可能會引起紅細胞凝集、貧血等副作用，限制了其臨床應(yīng)用。此外，部分患者對抗CD47抗體治療可能存在耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳。如何進一步優(yōu)化抗CD47抗體的結(jié)構(gòu)和性能，降低副作用，提高治療效果，克服耐藥性，是未來研究的重點方向。隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進步，相信抗CD47抗體將為癌癥患者帶來更多的治療選擇和更好的治療前景。2.3抗CD47抗體臨床應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)盡管抗CD47抗體在癌癥治療中展現(xiàn)出了巨大的潛力，但其臨床應(yīng)用仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。從安全性角度來看，紅細胞凝集和貧血是抗CD47抗體臨床應(yīng)用中最為突出的副作用問題。CD47在紅細胞表面廣泛表達，抗CD47抗體與紅細胞表面的CD47結(jié)合后，可能會引發(fā)紅細胞凝集現(xiàn)象。紅細胞凝集會導(dǎo)致紅細胞聚集在一起，影響血液的正常流動，嚴重時可能會阻塞血管，引發(fā)一系列嚴重的并發(fā)癥?？笴D47抗體還可能導(dǎo)致貧血癥狀的出現(xiàn)。這是因為抗CD47抗體與紅細胞結(jié)合后，可能會干擾紅細胞的正常代謝和功能，導(dǎo)致紅細胞壽命縮短，從而引起貧血。貧血會使患者出現(xiàn)疲勞、乏力、氣短、頭暈等癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。在一些早期的抗CD47抗體臨床試驗中，就有患者因紅細胞凝集和貧血等副作用而不得不中斷治療，這也限制了抗CD47抗體的進一步推廣和應(yīng)用。除了上述副作用，抗CD47抗體在親和力和穩(wěn)定性方面也存在不足。親和力是指抗體與抗原結(jié)合的強度，高親和力的抗體能夠更有效地與腫瘤細胞表面的CD47結(jié)合，阻斷“別吃我”信號，從而增強免疫治療效果。然而，目前部分抗CD47抗體的親和力還不夠理想，無法充分發(fā)揮其抗腫瘤作用。一些抗CD47抗體在與CD47結(jié)合時，存在結(jié)合不緊密、易解離的問題，導(dǎo)致其在體內(nèi)的作用時間較短，無法持續(xù)有效地激活免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的吞噬作用?？贵w的穩(wěn)定性也是影響其臨床應(yīng)用的重要因素。穩(wěn)定性差的抗體在體內(nèi)容易發(fā)生降解、聚集等現(xiàn)象，不僅會降低抗體的活性，還可能引發(fā)免疫原性反應(yīng)，增加患者的不良反應(yīng)風(fēng)險。在儲存和運輸過程中，抗體的穩(wěn)定性也會受到溫度、pH值等因素的影響，如果抗體不能保持良好的穩(wěn)定性，就會影響其質(zhì)量和療效?？笴D47抗體在腫瘤微環(huán)境中的作用效果也受到多種因素的制約。腫瘤微環(huán)境是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，包含腫瘤細胞、免疫細胞、間質(zhì)細胞以及細胞外基質(zhì)等多種成分，其中存在的免疫抑制因子和細胞因子等會干擾抗CD47抗體的作用。腫瘤微環(huán)境中存在的TGF-β、IL-10等免疫抑制因子，它們能夠抑制巨噬細胞等免疫細胞的活性，降低抗CD47抗體激活免疫細胞的效果。腫瘤細胞表面的其他免疫調(diào)節(jié)分子，如PD-L1等，也可能與抗CD47抗體產(chǎn)生相互作用，影響抗CD47抗體的治療效果。腫瘤微環(huán)境中的缺氧、低pH值等特殊條件，也可能影響抗CD47抗體的穩(wěn)定性和活性，限制其在腫瘤組織中的分布和作用。部分患者對抗CD47抗體治療還可能產(chǎn)生耐藥性。隨著治療的進行，一些腫瘤細胞可能會通過上調(diào)其他免疫逃逸分子的表達、改變CD47的結(jié)構(gòu)或表達水平等方式，來逃避抗CD47抗體的作用，導(dǎo)致治療效果逐漸減弱。腫瘤細胞可能會上調(diào)PD-L1的表達，通過PD-1/PD-L1通路來抑制T細胞的活性，從而削弱抗CD47抗體激活的免疫反應(yīng)；腫瘤細胞也可能改變CD47的糖基化修飾，影響抗CD47抗體與CD47的結(jié)合，導(dǎo)致抗體無法有效阻斷“別吃我”信號。耐藥性的出現(xiàn)不僅增加了治療的難度，也降低了患者的生存希望，成為抗CD47抗體臨床應(yīng)用中的一大難題。三、分子模擬技術(shù)在抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測中的應(yīng)用原理3.1分子模擬技術(shù)簡介分子模擬技術(shù)是一門借助計算機，以原子水平的分子模型來模擬分子結(jié)構(gòu)與行為，進而模擬分子體系各種物理、化學(xué)性質(zhì)的方法。它在眾多學(xué)科領(lǐng)域中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，已成為現(xiàn)代科學(xué)研究不可或缺的工具之一。其核心在于通過構(gòu)建合理的模型和算法，將分子的微觀結(jié)構(gòu)與宏觀性質(zhì)相關(guān)聯(lián)，從而在計算機虛擬環(huán)境中對分子體系進行深入研究。分子模擬技術(shù)涵蓋多種類型，從不同角度可進行不同的分類。按照模擬對象的尺度范圍，可分為量子力學(xué)模擬、分子力學(xué)模擬和粗?；M等。量子力學(xué)模擬主要用于研究分子的電子結(jié)構(gòu)和化學(xué)反應(yīng)過程，它基于量子力學(xué)原理，考慮電子的波動性和量子效應(yīng)，能夠精確描述分子中電子的分布和運動狀態(tài)，但計算量較大，通常適用于研究小分子體系或分子中的局部微觀結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；分子力學(xué)模擬則是在原子水平上對分子進行建模，將分子視為由原子通過化學(xué)鍵和非鍵相互作用連接而成的體系，通過經(jīng)驗力場來描述原子間的相互作用，計算分子的能量、結(jié)構(gòu)和動力學(xué)性質(zhì)，這種方法計算效率較高，可用于模擬較大的分子體系，如蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子；粗?；M則是將多個原子或基團視為一個粗?；Ｗ樱瑢Ψ肿芋w系進行簡化處理，以降低計算復(fù)雜度，提高模擬效率，適用于研究分子聚集體、生物膜、高分子材料等大尺度體系的結(jié)構(gòu)和動態(tài)行為。從模擬方法的角度來看，分子模擬技術(shù)主要包括分子動力學(xué)模擬（MolecularDynamics，MD）和蒙特卡羅模擬（MonteCarlo，MC）。分子動力學(xué)模擬是基于牛頓運動定律，通過數(shù)值求解分子體系中每個原子的運動方程，來模擬分子的動態(tài)行為。在模擬過程中，給定分子體系的初始條件（包括原子的位置和速度），根據(jù)力場計算每個原子所受的力，進而更新原子的位置和速度，得到分子體系隨時間的演化軌跡。通過對軌跡的分析，可以獲取分子體系的各種動力學(xué)性質(zhì)，如擴散系數(shù)、粘度、熱導(dǎo)率等，以及結(jié)構(gòu)性質(zhì)，如分子構(gòu)象變化、分子間相互作用等。蒙特卡羅模擬則是基于概率統(tǒng)計原理，通過隨機抽樣的方法來模擬分子體系的狀態(tài)。在模擬過程中，隨機生成分子體系的構(gòu)型，根據(jù)玻爾茲曼分布計算構(gòu)型的概率，通過對大量構(gòu)型的統(tǒng)計平均，得到分子體系的熱力學(xué)性質(zhì)，如內(nèi)能、熵、自由能等。分子動力學(xué)模擬是一種常用的分子模擬方法，它能夠提供分子體系在時間尺度上的動態(tài)信息。在分子動力學(xué)模擬中，原子的運動遵從牛頓第二定律，質(zhì)點系整體遵從哈密頓原理。通過設(shè)定合適的初始條件，如原子的初始位置和速度，以及模擬盒子的邊界條件等，就可以開始模擬分子體系的運動。在模擬過程中，需要使用勢函數(shù)（力場）來描述分子內(nèi)相互作用和分子間相互作用。分子內(nèi)相互作用包括鍵相互作用、角相互作用、二面角相互作用和離面角相互作用等；分子間相互作用則包括范德華作用、靜電相互作用、三體相互作用和多體相互作用等。常見的力場有AMBER、CHARMM、GROMOS等，它們根據(jù)不同的經(jīng)驗參數(shù)和模型來描述原子間的相互作用，適用于不同類型的分子體系。在模擬過程中，還需要選擇合適的積分步長，積分步長過小會導(dǎo)致計算量增大，模擬時間延長；積分步長過大則會影響模擬的準確性，導(dǎo)致能量不守恒等問題。一般來說，積分步長通常在飛秒（fs）量級，需要根據(jù)具體的模擬體系和研究目的進行優(yōu)化選擇。蒙特卡羅模擬則側(cè)重于分子體系的熱力學(xué)性質(zhì)和平衡態(tài)結(jié)構(gòu)。它通過隨機生成分子體系的構(gòu)型，并根據(jù)一定的接受準則來判斷構(gòu)型是否被接受，從而實現(xiàn)對分子體系的采樣。在蒙特卡羅模擬中，常用的接受準則是Metropolis準則，即如果新構(gòu)型的能量低于當(dāng)前構(gòu)型的能量，則新構(gòu)型被接受；如果新構(gòu)型的能量高于當(dāng)前構(gòu)型的能量，則以一定的概率接受新構(gòu)型，概率大小由玻爾茲曼因子決定。通過對大量接受構(gòu)型的統(tǒng)計平均，可以得到分子體系的各種熱力學(xué)性質(zhì)，如內(nèi)能、熵、自由能等，以及平衡態(tài)結(jié)構(gòu)。蒙特卡羅模擬不受分子動力學(xué)模擬中時間步長的限制，可以更靈活地探索分子體系的構(gòu)型空間，但它無法提供分子體系的動態(tài)信息。除了分子動力學(xué)模擬和蒙特卡羅模擬外，還有一些其他的分子模擬方法，如量子力學(xué)/分子力學(xué)（QM/MM）混合方法、布朗運動模擬、模擬退火法等。QM/MM混合方法結(jié)合了量子力學(xué)和分子力學(xué)的優(yōu)點，在研究化學(xué)反應(yīng)或分子體系中局部區(qū)域的電子結(jié)構(gòu)和化學(xué)反應(yīng)活性時，將反應(yīng)中心或關(guān)鍵區(qū)域用量子力學(xué)方法描述，而將其余部分用分子力學(xué)方法描述，這樣既可以保證計算的準確性，又能降低計算量；布朗運動模擬主要用于研究分子在溶液中的擴散和輸運現(xiàn)象，它考慮了分子與溶劑分子之間的相互作用以及熱運動的影響；模擬退火法是一種用于優(yōu)化分子結(jié)構(gòu)和尋找全局最優(yōu)解的方法，它通過模擬固體退火過程中的降溫方式，在搜索過程中逐漸降低溫度，以一定的概率接受能量較高的構(gòu)型，從而避免陷入局部最優(yōu)解，找到分子體系的全局最低能量構(gòu)型。這些模擬方法各有特點和適用范圍，在實際研究中，需要根據(jù)具體的研究問題和體系特點，選擇合適的分子模擬方法或多種方法相結(jié)合，以獲得準確、全面的研究結(jié)果。3.2分子模擬技術(shù)預(yù)測抗體結(jié)構(gòu)的流程利用分子模擬技術(shù)預(yù)測抗體結(jié)構(gòu)是一個系統(tǒng)且復(fù)雜的過程，涉及多個關(guān)鍵步驟，每個步驟都對最終預(yù)測結(jié)果的準確性和可靠性起著重要作用。首先是抗體序列的獲取與整理。準確的抗體氨基酸序列是結(jié)構(gòu)預(yù)測的基礎(chǔ)，通?？梢詮亩鄠€渠道獲取，如國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)（IMGT）數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫是目前最全面的免疫球蛋白和T細胞受體序列數(shù)據(jù)庫，包含了大量來自不同物種、不同來源的抗體序列信息，為研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源；也可以通過高通量測序技術(shù)對抗體進行測序獲得。在獲取序列后，需要對其進行仔細的整理和預(yù)處理，去除可能存在的錯誤或冗余信息，確保序列的準確性和完整性。例如，在從實驗測序得到的抗體序列中，可能會由于測序誤差出現(xiàn)堿基錯配或缺失的情況，這就需要通過生物信息學(xué)工具，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）等進行比對和校正，將測序得到的序列與已知的高質(zhì)量抗體序列進行比對，找出差異并進行修正，從而得到準確可靠的抗體氨基酸序列。接下來是模板搜索與選擇。由于抗體結(jié)構(gòu)具有一定的保守性，利用同源建模技術(shù)，找到與目標抗體序列具有較高同源性且結(jié)構(gòu)已知的抗體作為模板，是構(gòu)建初始結(jié)構(gòu)模型的關(guān)鍵。在這一過程中，常用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行（PDB）發(fā)揮著重要作用。PDB數(shù)據(jù)庫中存儲了大量通過X射線晶體學(xué)、核磁共振等實驗技術(shù)測定的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息。使用序列比對工具，如FASTA（Fast-All）或PSI-BLAST（Position-SpecificIteratedBLAST），將目標抗體序列與PDB數(shù)據(jù)庫中的已知結(jié)構(gòu)序列進行比對，計算序列相似性得分，通常以序列同一性百分比來衡量。一般來說，選擇序列同一性高于30%的結(jié)構(gòu)作為模板，能夠獲得較為可靠的初始模型。例如，對于某一目標抗CD47抗體，通過序列比對在PDB數(shù)據(jù)庫中找到一個序列同一性為35%的已知抗體結(jié)構(gòu)作為模板，該模板在后續(xù)的同源建模中為構(gòu)建目標抗體的初始結(jié)構(gòu)提供了重要的參考框架。在確定模板后，便進入同源建模階段，構(gòu)建抗體的初始三維結(jié)構(gòu)模型。同源建模的基本原理是基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的保守性，假設(shè)目標抗體與模板抗體在結(jié)構(gòu)上具有相似性，通過將目標抗體的氨基酸序列與模板抗體的結(jié)構(gòu)進行匹配，從而構(gòu)建出目標抗體的初始結(jié)構(gòu)。常用的同源建模軟件有MODELLER、SWISS-MODEL等。以MODELLER軟件為例，它通過優(yōu)化目標函數(shù)來調(diào)整模型的原子坐標，使得模型與模板結(jié)構(gòu)以及目標序列的約束條件相匹配。在建模過程中，需要設(shè)置一些參數(shù)，如序列比對文件、模板結(jié)構(gòu)文件、模型構(gòu)建的原子力場等。通過這些參數(shù)的合理設(shè)置，MODELLER軟件能夠根據(jù)目標抗體序列和選定的模板，生成一系列可能的初始結(jié)構(gòu)模型。這些初始模型雖然基于模板構(gòu)建，但由于目標抗體與模板之間存在一定的序列差異，可能存在一些不合理的構(gòu)象，需要進一步優(yōu)化。為了優(yōu)化初始模型，分子動力學(xué)模擬發(fā)揮著關(guān)鍵作用。分子動力學(xué)模擬基于牛頓運動定律，通過數(shù)值求解分子體系中每個原子的運動方程，來模擬分子在一段時間內(nèi)的動態(tài)行為，從而對抗體結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化和動態(tài)分析。在分子動力學(xué)模擬中，首先要構(gòu)建模擬體系，將抗體分子置于一個合適的模擬盒子中，并添加溶劑分子和離子，以模擬抗體在生理環(huán)境中的真實狀態(tài)。接著，選擇合適的力場，如AMBER、CHARMM、GROMOS等，力場參數(shù)用于描述分子內(nèi)和分子間的相互作用，包括鍵相互作用、角相互作用、二面角相互作用、范德華作用和靜電相互作用等。確定初始條件，如原子的初始位置和速度，以及模擬的溫度、壓強等條件。然后，開始進行模擬，在模擬過程中，原子的位置和速度會根據(jù)運動方程不斷更新，通過長時間的模擬，抗體分子會逐漸達到一個相對穩(wěn)定的構(gòu)象狀態(tài)。例如，在對初始抗CD47抗體結(jié)構(gòu)模型進行分子動力學(xué)模擬時，設(shè)置模擬時間為100納秒，溫度為310K（接近人體體溫），壓強為1個標準大氣壓，采用AMBER力場進行模擬。在模擬過程中，觀察抗體分子的構(gòu)象變化，如CDR環(huán)的擺動、抗體整體的柔性變化等，通過對這些動態(tài)過程的分析，優(yōu)化抗體結(jié)構(gòu)，使其更加接近真實的生理構(gòu)象。模型驗證也是分子模擬技術(shù)預(yù)測抗體結(jié)構(gòu)流程中不可或缺的一步。構(gòu)建和優(yōu)化后的抗體結(jié)構(gòu)模型需要進行驗證，以評估其準確性和可靠性。常用的驗證方法包括結(jié)構(gòu)合理性分析和與實驗數(shù)據(jù)的對比驗證。在結(jié)構(gòu)合理性分析方面，使用PROCHECK、WHAT_CHECK等工具對模型進行分析，檢查模型的立體化學(xué)質(zhì)量，如鍵長、鍵角、二面角等是否在合理范圍內(nèi)，以及蛋白質(zhì)骨架的構(gòu)象是否合理。對于一個優(yōu)化后的抗CD47抗體結(jié)構(gòu)模型，通過PROCHECK分析發(fā)現(xiàn)，模型中98%以上的鍵長和鍵角都在合理的標準偏差范圍內(nèi)，表明該模型的立體化學(xué)質(zhì)量較好。還可以將模型與已知的實驗數(shù)據(jù)進行對比驗證，如果有相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)，如抗體與抗原結(jié)合的親和力數(shù)據(jù)、晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)或核磁共振數(shù)據(jù)等，可以將模型預(yù)測的結(jié)果與這些實驗數(shù)據(jù)進行比較，評估模型的準確性。如果模型預(yù)測的抗體與抗原結(jié)合模式和親和力與實驗數(shù)據(jù)相符，說明模型具有較高的可靠性；反之，如果模型與實驗數(shù)據(jù)存在較大偏差，則需要進一步分析原因，對模型進行優(yōu)化或重新構(gòu)建。3.3相關(guān)算法與軟件工具在抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測領(lǐng)域，隨著計算技術(shù)的不斷進步，涌現(xiàn)出了多種強大的算法與軟件工具，它們各自具有獨特的優(yōu)勢和特點，為研究人員深入探索抗體結(jié)構(gòu)提供了有力支持。RosettaAntibody是一款基于華盛頓大學(xué)DavidBaker博士實驗室開發(fā)的Rosetta軟件的特異性抗體開發(fā)算法。該算法框架基于嚴格的生物信息學(xué)分析，使用North/DunbrackCDR來定義，旨在對抗體-抗原復(fù)合物的不同序列、結(jié)構(gòu)和結(jié)合空間進行采樣，可廣泛應(yīng)用于從重新設(shè)計到改進結(jié)合親和力、優(yōu)化穩(wěn)定性等多種項目類型。其算法主要分為三個部分：首先，運用Kabat定義識別CDR，并采用Chothia方案對殘基重新進行編號，這一步驟能夠準確地確定抗體中與抗原結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域；接著，對所有框架和六個CDR中的五個進行模板選擇，通過與已知結(jié)構(gòu)的模板進行比對，為構(gòu)建抗體結(jié)構(gòu)提供參考；然后，利用同源建模創(chuàng)建初步模型；最后，進行CDRH3從頭循環(huán)建模完成模型預(yù)測，同時優(yōu)化VH-VL界面。在一項對抗體建模評估II（AMA-II）中11個未發(fā)表抗體結(jié)構(gòu)的基準測試中，RosettaAntibody為其中的4個靶標生成了所有測評工具中表現(xiàn)最好的結(jié)構(gòu)模型，有2個的預(yù)測精度低于1?，所有框架區(qū)域和55個非CDRH3環(huán)中的42個預(yù)測精度低于1?。然而，RosettaAntibody也存在一定的局限性，例如對于單鏈抗體的效率較低，盡管對loop定義進行特定調(diào)整可以更好地考慮CDR3的特異性，但在處理某些特殊結(jié)構(gòu)的抗體時仍可能面臨挑戰(zhàn)。DeepAb是約翰?霍普金斯大學(xué)的JeffreyJ.Gray教授基于深度學(xué)習(xí)預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)方法開發(fā)的抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測算法?？贵w的特異性主要受Fv區(qū)中補充決定區(qū)CDRs的影響，大多數(shù)傳統(tǒng)的抗體Fv結(jié)構(gòu)預(yù)測方法在預(yù)測H3環(huán)結(jié)構(gòu)時精度較差，而DeepAb在這方面取得了顯著突破。該算法由兩個主要階段組成，第一個階段是一個深度殘差卷積網(wǎng)絡(luò)，用于預(yù)測Fv結(jié)構(gòu)，用殘差對之間的相對距離和方向表示，網(wǎng)絡(luò)僅需輕重鏈序列作為輸入，并設(shè)計了可解釋組件，以提供對模型預(yù)測的洞察，其中結(jié)構(gòu)預(yù)測模塊最重要的組件是2DResNet，DeepAb將2DResNet中的輸出通過Attention層轉(zhuǎn)化到6個輸出分支，用以表示Fv結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵參數(shù)；第二階段基于fastRosetta，利用網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測來實現(xiàn)結(jié)構(gòu)設(shè)計。與另外三種基于嫁接的抗體特異性結(jié)構(gòu)預(yù)測算法RosettaAntibody-G、RepertoireBuilder和ABodyBuilder相比，DeepAb在重鏈框架和輕鏈框架上實現(xiàn)了分別相對于次佳方法14%-18%和16%-17%的平均RMSD改進。在預(yù)測H3環(huán)結(jié)構(gòu)這一具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)中，DeepAb平均RMSD為2.33?，比次佳方法提高了16%，且隨著H3循環(huán)長度的增加，其他方法的性能都會下降，只有DeepAb幾乎不受此因素影響，會為每個循環(huán)長度生成最準確的模型。不過，DeepAb也存在一些不足，由于其基于深度學(xué)習(xí)算法，需要大量的訓(xùn)練數(shù)據(jù)和強大的計算資源來支持模型的訓(xùn)練和運行，這在一定程度上限制了其應(yīng)用范圍。IgFold是約翰?霍普金斯大學(xué)發(fā)表的可以快速預(yù)測抗體結(jié)構(gòu)的深度學(xué)習(xí)方法。盡管一些深度學(xué)習(xí)方法顯著提高了包括H3環(huán)在內(nèi)的CDR區(qū)的建模精度，但仍存在預(yù)測時間太長、不能直接合并模板數(shù)據(jù)等限制算法實用性的因素，IgFold很好地解決了這些問題。該算法先從一個在558M自然抗體序列上預(yù)訓(xùn)練的語言模型AntiBERTy提取序列表征，然后通過圖網(wǎng)絡(luò)直接預(yù)測骨架原子坐標。IgFold的預(yù)測結(jié)構(gòu)質(zhì)量與其他工具類似或更好（包括AlphaFold），且預(yù)測所需時間不到1分鐘。在4個被測的抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測算法（ABodyBuilder、DeepAb、ABlooper和AlphaFold）中，IgFold預(yù)測速度不超過1分鐘而且能夠預(yù)測全原子結(jié)構(gòu)，在CDRH3預(yù)測準確率層面，IgFold精度好于其他算法，平均RMSD為2.99?。IgFold與Alphafold-Multimer使用類似的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，性能上較為接近。預(yù)測納米抗體時，Igfold對CDR3預(yù)測的準確性往往不如Alphafold（平均RMSD為3.85?），但速度明顯更快（Igfold少于30秒，Alphafold則是30分鐘）。除了快速準確的結(jié)構(gòu)預(yù)測外，IgFold還能產(chǎn)生很多靶點的不同構(gòu)象，這有助于優(yōu)化現(xiàn)有抗原抗體對接算法的計算速度和準確率。然而，IgFold在處理一些特殊的抗體結(jié)構(gòu)或與特定抗原結(jié)合的抗體時，可能由于其訓(xùn)練數(shù)據(jù)的局限性，導(dǎo)致預(yù)測的準確性有所下降。除了上述算法和軟件工具外，還有AlphaFold2、AbodyBuilder、RaptorX、AbPredict2、RoseTTAFold、NanoNet以及商業(yè)軟件MOE和薛定諤BIoLuminate等。AlphaFold2是由DeepMind開發(fā)的基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測工具，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測領(lǐng)域取得了重大突破，其在預(yù)測抗體結(jié)構(gòu)時也具有較高的準確性，但計算成本較高，預(yù)測時間較長。AbodyBuilder采用結(jié)構(gòu)預(yù)測的webserver，速度較快，但在準確性方面可能相對較弱。RaptorX、AbPredict2、RoseTTAFold、NanoNet等也各自具有不同的特點和適用場景。商業(yè)軟件MOE和薛定諤BIoLuminate則提供了更為全面和專業(yè)的分子模擬功能，包括抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測、分子對接、藥物設(shè)計等，但通常需要購買許可證，成本較高。在實際應(yīng)用中，研究人員需要根據(jù)具體的研究需求、數(shù)據(jù)資源和計算條件，選擇合適的算法和軟件工具，以實現(xiàn)對抗體結(jié)構(gòu)的準確預(yù)測和深入分析。四、基于分子模擬技術(shù)的抗CD47抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測案例分析4.1實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)獲取在本次基于分子模擬技術(shù)的抗CD47抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測研究中，首要任務(wù)是獲取高質(zhì)量、準確的抗CD47抗體序列數(shù)據(jù)。本研究主要從國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)（IMGT）數(shù)據(jù)庫中收集抗CD47抗體的氨基酸序列。IMGT數(shù)據(jù)庫作為全球最權(quán)威的免疫球蛋白和T細胞受體序列數(shù)據(jù)庫之一，具有數(shù)據(jù)全面、更新及時、注釋詳細等特點。截至2023年，該數(shù)據(jù)庫已收錄了來自不同物種、不同研究的大量抗CD47抗體序列，為本研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。在數(shù)據(jù)收集過程中，運用Python編程語言結(jié)合Biopython庫編寫數(shù)據(jù)獲取腳本，通過該腳本可以實現(xiàn)對IMGT數(shù)據(jù)庫中抗CD47抗體序列的快速檢索和下載，確保數(shù)據(jù)獲取的高效性和準確性。除了IMGT數(shù)據(jù)庫，還通過對相關(guān)文獻的梳理和分析，進一步補充和驗證抗體序列數(shù)據(jù)。在PubMed數(shù)據(jù)庫中，以“anti-CD47antibodysequence”為關(guān)鍵詞進行檢索，篩選出近5年發(fā)表的相關(guān)研究論文。從這些論文中提取出實驗測定的抗CD47抗體序列，這些序列經(jīng)過嚴格的實驗驗證，具有較高的可信度。通過對不同來源數(shù)據(jù)的整合和比對，最終獲得了包含100條不同抗CD47抗體的氨基酸序列數(shù)據(jù)集，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)預(yù)測研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。在實驗中，還需要獲取CD47蛋白的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。CD47蛋白的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行（PDB）中獲取。PDB數(shù)據(jù)庫存儲了大量通過X射線晶體學(xué)、核磁共振等實驗技術(shù)測定的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息。以“CD47”為關(guān)鍵詞在PDB數(shù)據(jù)庫中進行搜索，篩選出分辨率較高、結(jié)構(gòu)完整的CD47蛋白晶體結(jié)構(gòu)。最終選取了PDBID為6Z5V的CD47蛋白晶體結(jié)構(gòu)作為研究對象，該結(jié)構(gòu)的分辨率達到2.5?，能夠清晰地展示CD47蛋白的原子坐標和空間構(gòu)象。為了模擬抗CD47抗體在生理環(huán)境中的真實狀態(tài)，還需要獲取一些相關(guān)的參數(shù)和條件。在模擬過程中，需要設(shè)置合適的力場參數(shù)來描述分子內(nèi)和分子間的相互作用。本研究選擇了AMBER力場，AMBER力場是一種廣泛應(yīng)用于生物分子模擬的力場，具有較高的準確性和可靠性。它能夠精確地描述蛋白質(zhì)分子中原子之間的共價鍵、非共價鍵相互作用，以及分子與溶劑分子之間的相互作用。在模擬體系中，需要添加溶劑分子和離子來模擬生理環(huán)境。通常采用TIP3P水模型來描述水分子，該模型能夠較好地模擬水分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；添加鈉離子（Na?）和氯離子（Cl?）來維持體系的電中性，離子濃度設(shè)置為0.15M，接近人體生理環(huán)境中的離子濃度。模擬的溫度設(shè)置為310K，接近人體體溫；壓強設(shè)置為1個標準大氣壓，以模擬生理條件下的壓力環(huán)境。通過合理設(shè)置這些參數(shù)和條件，能夠更真實地模擬抗CD47抗體在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和動態(tài)行為，為結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果的準確性提供保障。4.2分子模擬過程與結(jié)果分析在獲取了抗CD47抗體序列和CD47蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)后，利用分子模擬技術(shù)對抗體結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。選用RosettaAntibody算法，該算法基于嚴格的生物信息學(xué)分析，能對抗體-抗原復(fù)合物的不同序列、結(jié)構(gòu)和結(jié)合空間進行采樣，在抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測領(lǐng)域具有較高的準確性和可靠性。首先，運用Kabat定義識別抗CD47抗體的互補決定區(qū)（CDRs），并采用Chothia方案對殘基重新進行編號，準確確定抗體中與抗原結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。在對某一特定抗CD47抗體進行分析時，通過Kabat定義明確了其重鏈和輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域，這些區(qū)域的氨基酸序列對于抗體與CD47抗原的特異性結(jié)合起著關(guān)鍵作用。接著，對所有框架和六個CDR中的五個進行模板選擇。通過與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行（PDB）中已知結(jié)構(gòu)的模板進行比對，為構(gòu)建抗體結(jié)構(gòu)提供參考。在模板選擇過程中，使用FASTA序列比對工具，將目標抗CD47抗體序列與PDB數(shù)據(jù)庫中的大量抗體結(jié)構(gòu)序列進行比對，根據(jù)序列相似性得分，篩選出與目標抗體序列同源性較高的結(jié)構(gòu)作為模板。然后，利用同源建模創(chuàng)建初步模型。在這一步驟中，使用RosettaAntibody軟件，根據(jù)選定的模板和目標抗體序列，通過優(yōu)化目標函數(shù)來調(diào)整模型的原子坐標，使得模型與模板結(jié)構(gòu)以及目標序列的約束條件相匹配，從而生成初步的抗CD47抗體結(jié)構(gòu)模型。最后，進行CDRH3從頭循環(huán)建模完成模型預(yù)測，同時優(yōu)化VH-VL界面。由于CDRH3區(qū)域在抗體與抗原結(jié)合過程中具有重要作用，其結(jié)構(gòu)的準確性對于抗體功能的預(yù)測至關(guān)重要。RosettaAntibody通過從頭循環(huán)建模的方式，對CDRH3區(qū)域進行精細建模，同時優(yōu)化VH-VL界面，以提高模型的準確性和可靠性。在分子動力學(xué)模擬階段，首先構(gòu)建模擬體系。將抗CD47抗體分子置于一個合適的模擬盒子中，模擬盒子的大小根據(jù)抗體分子的尺寸進行合理設(shè)置，以確?？贵w分子在模擬過程中有足夠的空間進行自由運動。向模擬盒子中添加溶劑分子和離子，以模擬抗體在生理環(huán)境中的真實狀態(tài)。本研究采用TIP3P水模型來描述水分子，添加鈉離子（Na?）和氯離子（Cl?）來維持體系的電中性，離子濃度設(shè)置為0.15M，接近人體生理環(huán)境中的離子濃度。接著，選擇AMBER力場來描述分子內(nèi)和分子間的相互作用。AMBER力場能夠精確地描述蛋白質(zhì)分子中原子之間的共價鍵、非共價鍵相互作用，以及分子與溶劑分子之間的相互作用，為模擬提供了可靠的基礎(chǔ)。確定初始條件，包括原子的初始位置和速度，以及模擬的溫度、壓強等條件。模擬的溫度設(shè)置為310K，接近人體體溫；壓強設(shè)置為1個標準大氣壓，以模擬生理條件下的壓力環(huán)境。然后，開始進行分子動力學(xué)模擬，模擬時間設(shè)置為100納秒。在模擬過程中，原子的位置和速度會根據(jù)牛頓運動定律不斷更新，通過長時間的模擬，抗體分子會逐漸達到一個相對穩(wěn)定的構(gòu)象狀態(tài)。通過分子模擬得到抗CD47抗體的結(jié)構(gòu)模型后，對結(jié)果進行分析。從抗體的整體結(jié)構(gòu)來看，抗體呈現(xiàn)出典型的Y型結(jié)構(gòu)，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，通過二硫鍵相互連接。重鏈和輕鏈的可變區(qū)位于抗體的頂部，形成抗原結(jié)合位點，與CD47抗原特異性結(jié)合；恒定區(qū)則位于抗體的底部，參與抗體的效應(yīng)功能。對抗體與CD47抗原的結(jié)合模式進行分析，通過計算結(jié)合自由能等方法，確定了抗體與CD47抗原結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。在某一抗CD47抗體與CD47抗原的結(jié)合模型中，發(fā)現(xiàn)抗體重鏈的HCDR3區(qū)域中的幾個氨基酸殘基，如酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）等，與CD47抗原表面的特定氨基酸殘基形成了氫鍵和疏水相互作用，這些相互作用對于抗體與CD47抗原的高親和力結(jié)合至關(guān)重要。還分析了抗體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和動力學(xué)特性。通過計算均方根偏差（RMSD）、均方根漲落（RMSF）等參數(shù)，評估抗體在模擬過程中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在100納秒的模擬時間內(nèi)，抗體的RMSD值在初始階段有較大波動，但隨著模擬的進行，逐漸趨于穩(wěn)定，表明抗體在模擬過程中逐漸達到了一個相對穩(wěn)定的構(gòu)象狀態(tài)。RMSF分析結(jié)果表明，抗體的CDR區(qū)域的柔性較大，這與CDR區(qū)域在抗體與抗原結(jié)合過程中需要發(fā)生構(gòu)象變化以適應(yīng)抗原的結(jié)構(gòu)相符合；而抗體的框架區(qū)和恒定區(qū)的柔性較小，結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，保證了抗體的整體結(jié)構(gòu)完整性和功能穩(wěn)定性。4.3預(yù)測結(jié)果的驗證與評估為了確?；诜肿幽M技術(shù)得到的抗CD47抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果的可靠性和準確性，需要對其進行全面的驗證與評估。將分子模擬預(yù)測得到的抗CD47抗體結(jié)構(gòu)與實驗測定的抗體結(jié)構(gòu)進行詳細對比。目前，實驗測定抗體結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)包括X射線晶體學(xué)和核磁共振（NMR）技術(shù)。雖然通過X射線晶體學(xué)技術(shù)測定的CD47抗體結(jié)構(gòu)數(shù)量相對有限，但這些結(jié)構(gòu)具有較高的分辨率，能夠精確地展示抗體的原子坐標和空間構(gòu)象，為驗證分子模擬結(jié)果提供了重要的參考依據(jù)。在對比過程中，重點關(guān)注抗體的整體結(jié)構(gòu)特征、CDR區(qū)域的構(gòu)象以及抗體與CD47抗原結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)。通過計算結(jié)構(gòu)重疊的均方根偏差（RMSD）值來量化兩者之間的差異，RMSD值越小，表明模擬結(jié)構(gòu)與實驗結(jié)構(gòu)的相似度越高。對于某一特定的抗CD47抗體，將分子模擬預(yù)測結(jié)構(gòu)與X射線晶體學(xué)測定的結(jié)構(gòu)進行對比，結(jié)果顯示其RMSD值為1.5?，表明模擬結(jié)構(gòu)與實驗結(jié)構(gòu)具有較高的相似度，分子模擬預(yù)測結(jié)果在整體結(jié)構(gòu)上具有較高的準確性。還可以將模擬結(jié)果與其他可靠的實驗數(shù)據(jù)進行對比驗證。利用表面等離子共振（SPR）技術(shù)可以精確測量抗體與CD47抗原之間的結(jié)合親和力，通過實驗測定得到的結(jié)合親和力數(shù)據(jù)，與分子模擬預(yù)測的結(jié)合自由能進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)合自由能是衡量分子間相互作用強度的重要指標，通常情況下，結(jié)合自由能越低，抗體與抗原的結(jié)合親和力越高。通過對比發(fā)現(xiàn)，分子模擬預(yù)測的結(jié)合自由能與SPR實驗測定的結(jié)合親和力具有良好的相關(guān)性，預(yù)測的結(jié)合自由能越低，對應(yīng)的實驗測定結(jié)合親和力越高，進一步驗證了分子模擬在預(yù)測抗體-抗原結(jié)合親和力方面的可靠性。利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）實驗可以檢測抗體與CD47抗原的特異性結(jié)合情況，將分子模擬預(yù)測的抗體-抗原結(jié)合模式與ELISA實驗結(jié)果進行對比，結(jié)果顯示兩者相符，表明分子模擬能夠準確預(yù)測抗體與CD47抗原的特異性結(jié)合，為后續(xù)的抗體功能研究和人源化改造提供了可靠的基礎(chǔ)。為了更全面地評估分子模擬預(yù)測結(jié)果的準確性，還可以采用一些結(jié)構(gòu)驗證工具和方法。使用PROCHECK軟件對模擬得到的抗CD47抗體結(jié)構(gòu)進行立體化學(xué)質(zhì)量評估，檢查結(jié)構(gòu)中的鍵長、鍵角、二面角等參數(shù)是否符合標準值范圍。對于一個優(yōu)化后的抗CD47抗體結(jié)構(gòu)模型，通過PROCHECK分析發(fā)現(xiàn)，模型中98%以上的鍵長和鍵角都在合理的標準偏差范圍內(nèi)，表明該模型的立體化學(xué)質(zhì)量良好，結(jié)構(gòu)具有較高的合理性。利用WHAT_CHECK工具對結(jié)構(gòu)中的原子接觸、氫鍵網(wǎng)絡(luò)等進行分析，確保結(jié)構(gòu)中原子間的相互作用合理，不存在不合理的原子重疊或氫鍵斷裂等情況。通過這些結(jié)構(gòu)驗證工具和方法的評估，進一步提高了分子模擬預(yù)測結(jié)果的可信度，為抗CD47抗體的深入研究和人源化改造提供了堅實的保障。五、抗CD47抗體人源化改造方法5.1CDR移植法CDR移植法，又稱抗體重構(gòu)，是目前單抗人源化過程中最常用的方法，其核心原理基于抗體的結(jié)構(gòu)和功能特點?？贵w的可變區(qū)包含3個互補決定區(qū)（CDR）和4個框架區(qū)（FR），其中CDR是直接與抗原結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，決定了抗體的特異性和親和力；而FR則主要起到維持抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用。CDR移植法利用基因工程技術(shù)，將鼠源單抗的CDR序列移植到人抗體可變區(qū)（V）中，替換人抗體原有的CDR序列，從而重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。在抗CD47抗體人源化改造中，CDR移植法展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。通過將鼠源抗CD47抗體的CDR移植到人源抗體框架上，可以最大限度地降低鼠單抗的異源性，減少人體免疫系統(tǒng)對抗體的識別和攻擊，從而降低免疫原性。在一項研究中，科研人員將鼠源抗CD47抗體的CDR區(qū)域準確地移植到人源抗體框架區(qū)，構(gòu)建了人源化抗CD47抗體。實驗結(jié)果表明，該人源化抗體能夠特異性地與CD47抗原結(jié)合，且結(jié)合親和力與鼠源抗體相當(dāng)，同時在動物實驗中，人源化抗體引發(fā)的免疫反應(yīng)明顯低于鼠源抗體，顯示出良好的應(yīng)用前景。然而，CDR移植法并非完美無缺，在實際應(yīng)用中可能會出現(xiàn)一些問題。由于鼠源CDR與人類框架區(qū)之間存在一定的不兼容性，這種不匹配可能會導(dǎo)致抗體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而影響抗體的親和力和穩(wěn)定性。鼠源CDR的氨基酸序列與人類框架區(qū)的氨基酸序列在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上存在差異，當(dāng)將鼠源CDR移植到人源框架區(qū)后，可能會破壞框架區(qū)原有的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，導(dǎo)致抗體分子的構(gòu)象發(fā)生改變，使得抗體與抗原的結(jié)合能力下降，親和力降低。CDR移植后還可能會引發(fā)免疫原性問題。盡管CDR移植法的初衷是降低免疫原性，但在某些情況下，移植后的CDR可能會暴露新的抗原表位，被人體免疫系統(tǒng)識別為外來抗原，從而引發(fā)免疫反應(yīng)。這種免疫反應(yīng)不僅會降低抗體的治療效果，還可能導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)，限制了人源化抗體的臨床應(yīng)用。為了克服CDR移植法在抗CD47抗體人源化改造中出現(xiàn)的問題，研究人員采取了一系列優(yōu)化策略。對人源框架區(qū)進行篩選和優(yōu)化，選擇與鼠源CDR兼容性更好的人源框架區(qū)，以提高抗體的親和力和穩(wěn)定性。通過生物信息學(xué)分析，篩選出與鼠源CDR序列具有較高同源性和結(jié)構(gòu)互補性的人源框架區(qū)，然后將鼠源CDR移植到這些優(yōu)化后的框架區(qū)上，構(gòu)建人源化抗體。實驗結(jié)果表明，經(jīng)過框架區(qū)優(yōu)化后的人源化抗CD47抗體，其親和力和穩(wěn)定性得到了顯著提高。還可以對CDR區(qū)域進行微調(diào)，通過定點突變等技術(shù)，調(diào)整CDR區(qū)域中關(guān)鍵氨基酸殘基的序列，使其更好地適應(yīng)人源框架區(qū)，進一步提高抗體的性能。5.2表面重塑法表面重塑法是一種通過對抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造，從而降低抗體免疫原性的重要方法。其核心原理基于對抗體分子結(jié)構(gòu)和免疫原性機制的深入理解。在抗體分子中，表面氨基酸殘基在免疫應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵作用，這些殘基的差異可能導(dǎo)致抗體被人體免疫系統(tǒng)識別為外來抗原，從而引發(fā)免疫反應(yīng)。表面重塑法的目標就是在維持抗體活性的前提下，對抗體表面與人抗體差異明顯的區(qū)域進行改造，使其更接近人抗體的特征。在具體操作步驟上，首先需要對抗體可變區(qū)序列進行全面分析。通過將目標抗體可變區(qū)序列與鼠源、人源抗體可變區(qū)序列庫進行細致比對，利用生物信息學(xué)工具，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）等，獲取抗體序列中的差異和異常殘基信息。在對某一鼠源抗CD47抗體進行分析時，通過序列比對發(fā)現(xiàn)其重鏈可變區(qū)的某些氨基酸殘基在人源抗體中出現(xiàn)的頻率極低，這些殘基被初步確定為可能需要改造的位點。在確定可能的改造位點后，進行三維模建和結(jié)構(gòu)分析。運用專業(yè)的分子模擬軟件，如SWISS-MODEL，對抗體可變區(qū)進行同源模建，構(gòu)建出抗體的三維結(jié)構(gòu)模型。利用Swiss-PdbViewer等工具，在特定力場（如Gromos96力場）下對模型進行優(yōu)化，使其結(jié)構(gòu)更加合理。通過計算抗體分子內(nèi)與分子間氫鍵作用位點和表面可及性，進一步分析抗體的結(jié)構(gòu)特征。在對該鼠源抗CD47抗體進行三維模建和結(jié)構(gòu)分析時，發(fā)現(xiàn)某些可能的改造位點參與了分子內(nèi)氫鍵的形成，這些位點在改造過程中需要謹慎處理，以避免影響抗體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和活性?；谏鲜龇治鼋Y(jié)果，確定候選突變位點。在選擇突變位點時，遵循一系列嚴格的原則，僅替換與人抗體表面殘基差異明顯的區(qū)域，對于影響側(cè)鏈大小、電荷、疏水性，或可能形成氫鍵從而影響到抗體互補決定區(qū)（CDR）構(gòu)象的殘基盡量不替換。根據(jù)這些原則，在該鼠源抗CD47抗體中確定了若干候選突變位點，這些位點既能夠降低抗體的異源性，又能最大程度地保持抗體的活性。對人源化抗體進行模建與分析。將候選突變位點引入抗體序列，構(gòu)建人源化抗體模型，并對該模型進行全面分析，包括結(jié)構(gòu)合理性評估、結(jié)合親和力預(yù)測等。使用PROCHECK等工具檢查人源化抗體模型的立體化學(xué)質(zhì)量，確保模型的鍵長、鍵角、二面角等參數(shù)符合標準；利用分子對接技術(shù)預(yù)測人源化抗體與CD47抗原的結(jié)合親和力，評估改造后的抗體是否仍能有效地與抗原結(jié)合。在抗CD47抗體的人源化改造中，表面重塑法具有重要作用。通過對抗體表面氨基酸殘基的改造，能夠顯著降低抗體的免疫原性。研究表明，經(jīng)過表面重塑法改造的抗CD47抗體，在動物實驗中引發(fā)的免疫反應(yīng)明顯低于未改造的抗體，這表明表面重塑法能夠有效地降低抗體的異源性，減少人體免疫系統(tǒng)對抗體的識別和攻擊。表面重塑法還能夠在一定程度上優(yōu)化抗體的結(jié)構(gòu)和性能。通過合理選擇突變位點，調(diào)整抗體表面的電荷分布和疏水性，可能會改善抗體與抗原的結(jié)合模式，提高抗體的親和力和特異性。然而，表面重塑法也存在一定的局限性。在確定突變位點時，雖然有一定的原則和方法，但仍然存在一定的不確定性。某些位點的突變可能會對抗體的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生意想不到的影響，導(dǎo)致抗體活性下降或穩(wěn)定性降低。表面重塑法對抗體序列和結(jié)構(gòu)的分析要求較高，需要準確的序列數(shù)據(jù)和可靠的分子模擬工具。如果數(shù)據(jù)不準確或模擬方法不當(dāng)，可能會導(dǎo)致改造方案的失敗。5.3基于胚系基因的改造法基于胚系基因的改造法是抗CD47抗體人源化改造的重要策略之一，其原理基于對抗體基因進化和遺傳信息的深入理解?？贵w的胚系基因是指在生殖細胞中存在的抗體基因，它們是抗體多樣性的遺傳基礎(chǔ)。在抗體的產(chǎn)生過程中，胚系基因通過重排、突變等機制，形成了多種多樣的抗體可變區(qū)基因，從而賦予抗體特異性結(jié)合不同抗原的能力?；谂呦祷虻母脑旆ň褪抢眠@些天然的胚系基因資源，通過基因工程技術(shù)，將鼠源抗CD47抗體的可變區(qū)基因與人類胚系基因進行比對和分析，找出與鼠源抗體可變區(qū)基因同源性較高的人類胚系基因，然后對這些胚系基因進行修飾和改造，使其能夠表達出具有鼠源抗體特異性和親和力的人源化抗體。這種改造方法具有獨特的優(yōu)勢。由于胚系基因是天然存在的，具有良好的生物兼容性和穩(wěn)定性，基于胚系基因改造得到的人源化抗體，其免疫原性通常較低，在人體中引發(fā)免疫反應(yīng)的風(fēng)險較小。這是因為這些胚系基因在人類進化過程中經(jīng)過了長期的選擇和優(yōu)化，與人體免疫系統(tǒng)具有較好的適應(yīng)性。利用胚系基因進行改造，能夠更好地保留抗體的天然結(jié)構(gòu)和功能。胚系基因編碼的抗體框架區(qū)具有特定的結(jié)構(gòu)和功能特征，這些特征對于維持抗體的穩(wěn)定性和活性至關(guān)重要。通過基于胚系基因的改造，可以確保人源化抗體的框架區(qū)結(jié)構(gòu)更加合理，從而提高抗體的親和力和特異性?；谂呦祷虻母脑旆ㄟ€可以充分利用生物信息學(xué)和分子模擬技術(shù)的優(yōu)勢。通過對大量胚系基因序列和結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)合分子模擬技術(shù)預(yù)測抗體的結(jié)構(gòu)和功能，能夠更準確地選擇合適的胚系基因進行改造，提高改造的成功率和效率。在實際應(yīng)用中，基于胚系基因的改造法已經(jīng)取得了一些成功的案例。在一項研究中，科研人員針對鼠源抗CD47抗體進行人源化改造，通過對人類胚系基因數(shù)據(jù)庫的搜索和分析，找到了與鼠源抗體可變區(qū)基因同源性較高的胚系基因。然后，利用基因編輯技術(shù)，對這些胚系基因進行了精確的修飾和改造，將鼠源抗體的CDR區(qū)域嫁接到人胚系基因的框架區(qū)上，成功構(gòu)建了人源化抗CD47抗體。實驗結(jié)果表明，該人源化抗體不僅能夠特異性地與CD47抗原結(jié)合，而且在親和力和穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出色，在動物實驗中顯示出良好的抗腫瘤效果，且免疫原性明顯低于鼠源抗體。然而，基于胚系基因的改造法也面臨一些挑戰(zhàn)。人類胚系基因數(shù)據(jù)庫雖然龐大，但要從中找到與鼠源抗體可變區(qū)基因高度匹配的胚系基因并非易事，需要進行大量的生物信息學(xué)分析和篩選工作。胚系基因的修飾和改造過程較為復(fù)雜，需要精確的基因編輯技術(shù)和嚴格的質(zhì)量控制，以確保改造后的基因能夠正確表達和折疊，形成具有活性的人源化抗體。不同個體的胚系基因存在一定的遺傳多態(tài)性，這可能會影響基于胚系基因改造的人源化抗體的通用性和有效性，需要進一步研究如何解決這一問題。5.4其他改造方法除了上述幾種主要的人源化改造方法外，還有一些其他的技術(shù)和策略也在抗CD47抗體人源化改造中得到應(yīng)用。噬菌體展示技術(shù)是一種強大的分子生物學(xué)技術(shù)，在抗體人源化改造中具有獨特的優(yōu)勢。該技術(shù)將抗體基因與噬菌體的外殼蛋白基因融合，使抗體以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面。通過構(gòu)建大容量的噬菌體抗體文庫，其中包含了各種不同序列的抗體，然后利用抗原進行篩選，能夠從文庫中篩選出與抗原特異性結(jié)合的抗體。在抗CD47抗體人源化改造中，利用噬菌體展示技術(shù)可以篩選出具有高親和力和特異性的人源化抗體。通過將人源抗體基因片段構(gòu)建到噬菌體文庫中，然后用CD47抗原對文庫進行篩選，能夠獲得與CD47特異性結(jié)合的人源化抗體。這種方法的優(yōu)點在于可以在體外快速篩選大量的抗體，大大提高了篩選效率，且能夠獲得天然存在的人源抗體序列，減少免疫原性問題。不過，噬菌體展示技術(shù)也存在一些局限性，如構(gòu)建高質(zhì)量的噬菌體文庫需要較高的技術(shù)水平和成本，篩選過程中可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，需要進行進一步的驗證和篩選。特異性決定殘基（SDR）移植也是一種人源化改造策略。通過CDR移植獲得的人源化抗體仍可能在患者中引發(fā)免疫性抗獨特型（anti-Id）反應(yīng)。為了最大限度地減少抗V區(qū)免疫反應(yīng)，可以通過僅將CDR序列中抗原結(jié)合活性所必需的特異性決定殘基（SDR）移植到人源抗體框架區(qū)上來實現(xiàn)抗體人源化。SDR移植的方法更進一步地提升了抗體人源化程度，并盡可能地減少了鼠源CDR中效應(yīng)T細胞表位的數(shù)量，從而將抗體可變區(qū)潛在的免疫原性風(fēng)險做到最小化。然而，確定哪些氨基酸殘基是SDR并非易事，需要進行大量的結(jié)構(gòu)和功能研究，而且這種方法對抗體的親和力和穩(wěn)定性可能會產(chǎn)生一定的影響，需要謹慎評估和優(yōu)化。還有一些新興的技術(shù)和方法正在不斷探索和發(fā)展中。隨著人工智能和深度學(xué)習(xí)技術(shù)的不斷進步，利用這些技術(shù)對抗體序列和結(jié)構(gòu)進行分析和預(yù)測，為抗體人源化改造提供了新的思路和方法。通過深度學(xué)習(xí)算法，可以快速分析大量的抗體序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，預(yù)測抗體的免疫原性和親和力等關(guān)鍵參數(shù)，從而指導(dǎo)抗體的人源化改造?；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展也為抗體人源化改造帶來了新的機遇。利用CRISPR/Cas9等基因編輯工具，可以對抗體基因進行精確的編輯和修飾，實現(xiàn)對抗體結(jié)構(gòu)和功能的精準調(diào)控，為開發(fā)更高效、更安全的人源化抗CD47抗體提供了可能。六、抗CD47抗體人源化改造實踐與優(yōu)化6.1人源化改造實驗方案設(shè)計本實驗旨在通過分子模擬技術(shù)輔助，對鼠源抗CD47抗體進行人源化改造，以獲得具有低免疫原性、高親和力和特異性的人源化抗CD47抗體。實驗設(shè)計思路緊密圍繞人源化改造的核心目標，充分考慮抗體結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及分子模擬技術(shù)在其中的應(yīng)用優(yōu)勢。首先，運用分子模擬技術(shù)對鼠源抗CD47抗體進行結(jié)構(gòu)分析。通過分子動力學(xué)模擬，深入研究抗體的動態(tài)行為和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，明確抗體與CD47抗原相互作用的關(guān)鍵區(qū)域和氨基酸殘基。在模擬過程中，設(shè)置模擬時間為100納秒，溫度為310K，壓強為1個標準大氣壓，采用AMBER力場描述分子間相互作用。通過分析模擬軌跡，確定抗體的互補決定區(qū)（CDR）和框架區(qū)（FR）的結(jié)構(gòu)特征，以及CDR區(qū)域中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的氨基酸殘基?；诮Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果，采用CDR移植法進行初步的人源化改造。選擇合適的人源抗體框架，將鼠源抗CD47抗體的CDR序列移植到人源框架上，構(gòu)建初步的人源化抗體模型。在人源框架選擇上，通過生物信息學(xué)分析，從人源抗體數(shù)據(jù)庫中篩選出與鼠源抗體框架具有較高同源性和結(jié)構(gòu)兼容性的人源框架，以提高人源化抗體的親和力和穩(wěn)定性。例如，通過序列比對和結(jié)構(gòu)預(yù)測，選擇人源IgG1抗體框架作為基礎(chǔ)，將鼠源抗CD47抗體的CDR1、CDR2和CDR3序列分別移植到該框架的相應(yīng)位置，構(gòu)建出人源化抗體的初始模型。為了進一步優(yōu)化人源化抗體的性能，利用分子模擬技術(shù)對初步改造后的抗體模型進行評估和優(yōu)化。通過計算抗體與CD47抗原的結(jié)合自由能，預(yù)測不同氨基酸突變對抗體親和力的影響；分析抗體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，評估突變對抗體整體結(jié)構(gòu)的影響。在結(jié)合自由能計算中，采用分子力學(xué)/泊松-玻爾茲曼表面積（MM/PBSA）方法，對抗體-抗原復(fù)合物進行能量計算，分析不同氨基酸殘基對結(jié)合自由能的貢獻。根據(jù)模擬結(jié)果，對人源化抗體模型進行定點突變，調(diào)整關(guān)鍵氨基酸殘基的序列，以優(yōu)化抗體的親和力和穩(wěn)定性。例如，通過模擬預(yù)測發(fā)現(xiàn)，將人源化抗體框架區(qū)中的某個氨基酸殘基從丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，可以增強抗體與抗原之間的氫鍵相互作用，從而提高抗體的結(jié)合親和力?；诖祟A(yù)測結(jié)果，在抗體基因序列中進行相應(yīng)的定點突變，構(gòu)建優(yōu)化后的人源化抗體模型。利用基因工程技術(shù)合成優(yōu)化后的人源化抗CD47抗體基因，并在合適的表達系統(tǒng)中進行表達和純化。本實驗選擇中國倉鼠卵巢細胞（CHO）作為表達系統(tǒng)，該細胞具有表達效率高、糖基化修飾能力強等優(yōu)點，能夠保證抗體的正確折疊和修飾，提高抗體的質(zhì)量和活性。將合成的人源化抗體基因克隆到合適的表達載體中，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入CHO細胞中，在含有合適抗生素的培養(yǎng)基中進行篩選和培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達人源化抗CD47抗體的細胞株。采用親和層析、離子交換層析等方法對表達的抗體進行純化，去除雜質(zhì)和未折疊的蛋白，獲得高純度的人源化