1引言1.1研究背景磷酸奧司他韋，作為廣泛用于治療和預(yù)防流感的抗病毒藥物，其安全性和有效性至關(guān)重要。鑒于此，藥品的純凈度監(jiān)控成為保障公共健康的一項(xiàng)重要任務(wù)。隨著新的生產(chǎn)工藝和雜質(zhì)控制標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展，現(xiàn)有的檢測(cè)方法需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格驗(yàn)證以適應(yīng)新的要求。有效的雜質(zhì)分析方法對(duì)于確保藥品質(zhì)量、優(yōu)化生產(chǎn)流程、降低藥物副作用風(fēng)險(xiǎn)及維護(hù)患者安全至關(guān)重要[1]。因此，本研究不僅對(duì)藥學(xué)領(lǐng)域的科研人員具有重要的理論價(jià)值，對(duì)于提升藥品監(jiān)管水平、指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐也具有實(shí)際的應(yīng)用意義。通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀的深入分析，本研究旨在彌補(bǔ)現(xiàn)有研究的不足，并推動(dòng)藥品質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。隨著藥品市場(chǎng)的全球化，藥品質(zhì)量的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化也變得越發(fā)重要。作為一個(gè)在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛使用的藥物，磷酸奧司他韋膠囊必須符合國(guó)際上的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這不僅要求制藥廠商遵循嚴(yán)格的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，還要求他們使用可靠的方法對(duì)藥品進(jìn)行質(zhì)量控制[2]。它的輝煌歷史可以追溯到2003年的非典疫情，當(dāng)時(shí)奧司他韋作為最新的抗病毒藥物之一脫穎而出[3]，它對(duì)非典病毒表現(xiàn)出極強(qiáng)的敏感性和有效性，在眾多藥物中被國(guó)家作為戰(zhàn)備物資而受到高度重視。隨后，在2009年H1N1禽流感和隨后的H7N9禽流感期間[4]，奧司他韋兩次被官方認(rèn)可并被媒體報(bào)道為“官方儲(chǔ)備藥物”和“指定預(yù)防治療藥物”。它是流感準(zhǔn)備工作中的一種合適的通用藥物。由于在流感大流行中取得的巨大成就，奧司他韋一度成為中國(guó)最受歡迎的藥品之一，甚至被老百姓稱為“神藥”[5]！總的來(lái)說(shuō)，磷酸奧司他韋膠囊的質(zhì)量控制不僅關(guān)乎單個(gè)廠商的生產(chǎn)質(zhì)量，更是一個(gè)涉及公共健康、醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際合作的重要議題。這為我們的研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的背景，也是推動(dòng)我們進(jìn)行這項(xiàng)研究的主要?jiǎng)恿χ?。通過(guò)這項(xiàng)研究，我們旨在為磷酸奧司他韋膠囊的質(zhì)量控制提供更為科學(xué)、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法，從而確保藥品的質(zhì)量和安全性，保護(hù)公共健康。1.1.1流感流行性感冒是一種由流感病毒引發(fā)的急性呼吸道感染。主要影響鼻腔、鼻竇、中耳、肺部和咽喉，導(dǎo)致高度的傳染性和傳播性[6]。臨床上典型癥狀包括突然發(fā)病、高熱、頭痛、肌肉疼痛，呼吸道癥狀相對(duì)較輕。流感的傳播途徑主要是接觸和飛沫，輕度通常短暫且自行恢復(fù)[7]。2009年，甲型H1N1流感在墨西哥爆發(fā)[8]，并迅速擴(kuò)散至全球，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成重大威脅。其病毒基因包括豬流感、禽流感和人流感的基因片段。流感病毒具有高度變異性、傳染性和致病性，普通感冒藥和流感藥無(wú)法有效控制其發(fā)展，而且可能導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生。1.1.2磷酸奧司他韋概述它是于1996年由著名的吉利德（Gilead)公司研制成功，后來(lái)轉(zhuǎn)讓給羅氏公司（Roche）聯(lián)合開(kāi)發(fā)。在2001年10月首次進(jìn)入中國(guó)醫(yī)藥領(lǐng)域的舞臺(tái)。迄今為止，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上主要存在羅氏公司的“達(dá)菲”和“國(guó)產(chǎn)達(dá)菲”（磷酸奧司他韋膠囊）兩個(gè)小品種[9]。磷酸奧司他韋可減少并發(fā)癥的發(fā)生和抗生素的使用，對(duì)于流感病毒具有很好的療效是防治甲型H1N1流感和禽流感的公認(rèn)最有效藥物之一[10]。另一方面，奧司他韋也是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局唯一批準(zhǔn)用于治療14天以上新生兒流感的藥物[11-12]。它的輝煌歷史可以追溯到2003年的非典疫情，當(dāng)時(shí)最新的抗病毒藥物之一的奧司他韋脫穎而出，它對(duì)非典病毒表現(xiàn)出非常強(qiáng)的敏感性和有效性，在眾多藥物中被國(guó)家作為戰(zhàn)備物資而受到高度重視。1.1.3奧司他韋的化學(xué)結(jié)構(gòu)及物化性質(zhì)磷酸奧司他韋，商品名達(dá)菲，化學(xué)名稱：(3R，4R，5S)-4-乙酰氨基-5-氨基-3-(1-乙基丙氧基)-1-環(huán)己烯-1-羧酸乙酯磷酸鹽，它主要由三種基本官能團(tuán)構(gòu)成，包括:一個(gè)環(huán)磷酰胺配體(R)，一個(gè)磺胺衍生分子(S)和一個(gè)CH2-O-結(jié)構(gòu)(CHO)。環(huán)磷酰胺配體(R)和磺胺衍生分子(S)結(jié)合在一起形成了一個(gè)雙環(huán)結(jié)構(gòu)，這個(gè)雙環(huán)結(jié)構(gòu)是藥物主體的主要部分，可以通過(guò)作用于宿主細(xì)胞發(fā)揮抗炎藥物的作用。分子式：C16H28N2O4·H3PO4，其分子量為：410.40，于1999年首先在瑞士上市，2001年10月在我國(guó)上市。性狀：白色至淺黃色顆粒狀粉末，可含有塊狀物。圖1磷酸奧司他韋1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀研究磷酸奧司他韋膠囊的國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀揭示了這一領(lǐng)域的多元化進(jìn)展和不同的研究重點(diǎn)。在全球范圍內(nèi)，磷酸奧司他韋作為一種有效的抗流感藥物，其研究主要集中在藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)以及安全性評(píng)估上。多項(xiàng)臨床研究和實(shí)驗(yàn)室分析強(qiáng)調(diào)了磷酸奧司他韋在流感治療和預(yù)防中的關(guān)鍵作用，同時(shí)也指出了其潛在的副作用和耐藥性問(wèn)題[13]。在藥品質(zhì)量控制方面，國(guó)際上的研究正在不斷深入。制藥企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)致力于開(kāi)發(fā)更加精準(zhǔn)和高效的檢測(cè)方法，以確保藥品的安全性和一致性。特別是在美國(guó)、歐洲和日本等地，磷酸奧司他韋的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)非常嚴(yán)格，相關(guān)研究不斷推進(jìn)分析技術(shù)的創(chuàng)新，如利用高效液相色譜法（HPLC）、質(zhì)譜法、熒光分析法、拉曼光譜法等先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行雜質(zhì)分析和含量測(cè)定。高效液相色譜法，以其“三高一廣一快”的鮮明特點(diǎn)，在現(xiàn)代分析化學(xué)領(lǐng)域占據(jù)重要地位。這里的“三高”是指其分離效能高、靈敏度高和分析速度快。由于流動(dòng)相在流經(jīng)色譜柱時(shí)會(huì)受到較大的阻力，為了確保其能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。這種方法允許我們通過(guò)精心選擇固定相和流動(dòng)相的組合，以實(shí)現(xiàn)最佳的分離效果。此外，高效液相色譜法的載液流速也相對(duì)較快，這進(jìn)一步提高了分析的效率。這些優(yōu)勢(shì)使得高效液相色譜法在化學(xué)分析、藥物研發(fā)、生物檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[14]。在中國(guó)，隨著醫(yī)藥行業(yè)的快速發(fā)展，磷酸奧司他韋的研究和生產(chǎn)也得到了顯著的提升。國(guó)內(nèi)研究不僅關(guān)注藥物的臨床應(yīng)用，還在不斷探索和改進(jìn)藥品質(zhì)量檢測(cè)的方法。近年來(lái)，中國(guó)在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)技術(shù)方面取得了顯著進(jìn)步，磷酸奧司他韋的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也越來(lái)越接近國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。磷酸奧司他韋膠囊的國(guó)內(nèi)外研究顯示了該藥物在全球范圍內(nèi)的重要地位。不同國(guó)家和地區(qū)在保證藥品質(zhì)量、提升藥品安全性以及優(yōu)化臨床應(yīng)用方面都有各自的研究重點(diǎn)和進(jìn)展。這些研究成果不僅對(duì)磷酸奧司他韋膠囊的質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義，也為全球范圍內(nèi)的藥品質(zhì)量管理提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)支持。1.2.1國(guó)外研究現(xiàn)狀抗流藥物磷酸奧司他韋在治療流感病毒方面表現(xiàn)出卓越效果，但近年來(lái)其使用過(guò)多引發(fā)了一系列問(wèn)題。研究人員發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物對(duì)環(huán)境造成一定負(fù)面影響，同時(shí)磷酸奧司他韋可能會(huì)產(chǎn)生毒副作用對(duì)人體造成危害并對(duì)環(huán)境帶來(lái)不利影響，這促使科研人員對(duì)其藥物及代謝產(chǎn)物進(jìn)行更為深入的分析檢驗(yàn)[15]。有報(bào)道顯示這種藥物的廣泛應(yīng)用過(guò)程中也揭示出一些潛在危險(xiǎn)。比如有兒童在服用后出現(xiàn)精神混亂、器官功能衰竭、幻覺(jué)等嚴(yán)重副作用[16]。磷酸奧司他韋是一種常用的治療流感藥物，在日常生活中應(yīng)用頻繁。為了確保藥物研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)量，有必要開(kāi)發(fā)一種準(zhǔn)確有效的分析測(cè)定方法來(lái)測(cè)定磷酸奧司他韋中的雜質(zhì)，這對(duì)藥物產(chǎn)品的質(zhì)量控制至關(guān)重要。磷酸奧司他韋制備工藝較長(zhǎng)，而且有多個(gè)手性中心，合成過(guò)程中可能產(chǎn)生雜質(zhì)I、II、III、IV、V、以及三個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體、兩個(gè)同分異構(gòu)體雜質(zhì)[17]。在合成過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)如果不進(jìn)行控制，會(huì)影響最終藥物的純度和質(zhì)量。因此，實(shí)現(xiàn)磷酸奧司他韋及其特定雜質(zhì)的分離和測(cè)定對(duì)磷酸奧司他韋的質(zhì)量控制顯得非常重要。目前，美國(guó)藥典發(fā)布的磷酸奧司他韋質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含有II、III及其它兩個(gè)工藝雜質(zhì)，不能對(duì)上述雜質(zhì)同時(shí)進(jìn)行分離控制，因此，通過(guò)改變高效液相色譜條件，使流速為1.1~1.3ml/min，流動(dòng)相為0.04mol/L~0.06mol/L磷酸二氫鉀緩沖-甲醇-乙腈(620:235:145)~(620:255:125)，其他依照進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，此實(shí)驗(yàn)的有益效果主要體現(xiàn)在方法簡(jiǎn)單方便、重現(xiàn)性好、靈敏度高，能同時(shí)分離測(cè)定磷酸奧司他韋及其特定雜質(zhì)、可用于磷酸奧司他韋生產(chǎn)過(guò)程中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)監(jiān)控。1.2.2國(guó)內(nèi)研究現(xiàn)狀目前國(guó)內(nèi)上市的磷酸奧司他韋膠囊有許多廠家生產(chǎn)上市，例如宜昌東陽(yáng)光長(zhǎng)江藥業(yè)、上海中西三維藥業(yè)、諾泰生物、成都倍特、國(guó)藥集團(tuán)、博瑞制藥等，規(guī)格均為75mg。在中國(guó)，隨著醫(yī)藥行業(yè)的快速發(fā)展，磷酸奧司他韋的研究和生產(chǎn)也得到了顯著的提升。國(guó)內(nèi)研究不僅關(guān)注藥物的臨床應(yīng)用，還在不斷探索和改進(jìn)藥品質(zhì)量檢測(cè)的方法。近年來(lái)，中國(guó)在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)技術(shù)方面取得了顯著進(jìn)步，磷酸奧司他韋的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也越來(lái)越接近國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。磷酸奧司他韋是治療流感的常用藥物，可減少并發(fā)癥和抗生素使用，對(duì)抗禽流感和甲型H1N1流感有效。自2002年下半年在中國(guó)上市后,已廣泛用于臨床治療。研究表明，相比較利巴韋林和金剛烷胺，磷酸奧司他韋對(duì)甲型H1N1流感病毒的抑制作用更強(qiáng)，具有更高的治療指數(shù)和安全性[18]，學(xué)者也發(fā)現(xiàn)其在預(yù)防流感方面的安全性良好。在《甲型H1N1流感診療方案》中，磷酸奧司他韋的抗病毒效果被明確指出，并被推薦使用，國(guó)家和地方政府都將其作為重點(diǎn)控制的儲(chǔ)備藥品。面對(duì)21世紀(jì)初的嚴(yán)峻流感疫情，中國(guó)與其他國(guó)家加大了對(duì)抗流感藥物的研究和戰(zhàn)略儲(chǔ)備，同時(shí)關(guān)注相關(guān)藥品的穩(wěn)定性。藥品穩(wěn)定性涉及生化、物化等方面的變化，當(dāng)前的藥檢工作主要評(píng)價(jià)藥品的化學(xué)質(zhì)量，通過(guò)分析藥品的物化參數(shù)，來(lái)反映其內(nèi)在屬性，或者進(jìn)一步預(yù)測(cè)其藥效。國(guó)內(nèi)對(duì)兩家企業(yè)生產(chǎn)的16個(gè)磷酸奧司他韋膠囊樣本進(jìn)行了質(zhì)量穩(wěn)定性研究,旨在為國(guó)家儲(chǔ)備藥品提供技術(shù)支持,促進(jìn)國(guó)內(nèi)該藥品質(zhì)量。在其他國(guó)家對(duì)流感治療藥物的研究和戰(zhàn)略儲(chǔ)備也在加強(qiáng)，同時(shí)這些藥品的穩(wěn)定性問(wèn)題也受到了重視。穩(wěn)定性涵蓋了藥品的生化、物化變化，當(dāng)前的藥品檢驗(yàn)工作主要關(guān)注于化學(xué)質(zhì)量得評(píng)估[19-21]。通過(guò)已有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或建立新的合理方法來(lái)分析藥品的物化參數(shù)，這有助于揭示藥品的本質(zhì)特性，甚至預(yù)測(cè)其藥效表現(xiàn)。1.3研究目的及意義1.3.1研究目的本實(shí)驗(yàn)按照高效液相色譜法對(duì)磷酸奧司他韋膠囊進(jìn)行雜質(zhì)檢查方法學(xué)驗(yàn)證，通過(guò)系統(tǒng)適用性、準(zhǔn)確度、精密度、專(zhuān)屬性、檢測(cè)限、定量限、線性及范圍、相對(duì)校正因子、耐用性等數(shù)據(jù)，對(duì)此判定所使用的方法是否符合規(guī)定的檢查標(biāo)準(zhǔn)。為制定更嚴(yán)格的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供重要參考，從而確保藥物的安全性和有效性。1.3.2研究意義研究磷酸奧司他韋膠囊的雜質(zhì)檢查方法學(xué)驗(yàn)證具有深遠(yuǎn)的意義，這不僅反映在對(duì)藥品質(zhì)量控制的直接貢獻(xiàn)上，更在于其對(duì)于整個(gè)醫(yī)藥行業(yè)和公共健康領(lǐng)域的影響。雜質(zhì)的控制對(duì)于任何藥品來(lái)說(shuō)都是一個(gè)重要的質(zhì)量指標(biāo)，特別是對(duì)于廣泛使用的抗病毒藥物而言，其重要性更是不言而喻。通過(guò)開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證先進(jìn)的檢測(cè)方法，可以為其他藥品的質(zhì)量檢測(cè)提供借鑒和參考。所以我們應(yīng)用了高效液相色譜法通過(guò)工藝重現(xiàn)對(duì)磷酸奧司他韋膠囊雜質(zhì)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。此藥物的膠囊劑型在歐洲藥典、日本藥典、英國(guó)藥典中均未收藏，此研究意義在于確保產(chǎn)品的質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)，保證安全有效，確定方法的有效性、準(zhǔn)確性，促進(jìn)研究成果的發(fā)展。1.3.3研究技術(shù)路線圖2技術(shù)路線圖2材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)試劑試劑信息見(jiàn)表1。表1實(shí)驗(yàn)試劑名稱型號(hào)廠家甲醇色譜純MREDA乙腈色譜純MRDEA磷酸分析純天津大茂化學(xué)試劑有限公司磷酸二氫鉀分析純國(guó)藥集團(tuán)氫氧化鉀分析純天津福晨化學(xué)試劑有限公司水超純水自制2.1.2樣品信息樣品及對(duì)照品信息見(jiàn)表2，雜質(zhì)信息見(jiàn)表3。表2樣品及對(duì)照品信息匯總表名稱批號(hào)廠家含量%磷酸奧司他韋工作對(duì)照品S20191127HeteroLabsLimited99.99%雜質(zhì)I101382-202001中國(guó)食品藥品檢定研究院99.99%雜質(zhì)II101383-202001中國(guó)食品藥品檢定研究院99.99%雜質(zhì)III101384-202002中國(guó)食品藥品檢定研究院72.6%雜質(zhì)IV201901湖北摩科化學(xué)有限公司99.05%雜質(zhì)V201907湖北摩科化學(xué)有限公司99.70%空白輔料JAS-210830-01自制/聚維酮K30輔料200105安徽山河藥用輔料股份有限公司/磷酸奧司他韋膠囊S20210501安徽九洲方圓制藥有限公司/磷酸奧司他韋膠囊M1045RocheRegistrationLtd/磷酸奧司他韋膠囊M1066RocheRegistrationLtd/磷酸奧司他韋膠囊M1069RocheRegistrationLtd/磷酸奧司他韋膠囊20211101安徽九洲方圓制藥有限公司/磷酸奧司他韋膠囊20211102安徽九洲方圓制藥有限公司/磷酸奧司他韋膠囊20211103安徽九洲方圓制藥有限公司/表3雜質(zhì)信息雜質(zhì)代號(hào)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)雜質(zhì)來(lái)源雜質(zhì)Ⅰ工藝、降解雜質(zhì)雜質(zhì)Ⅱ工藝、降解雜質(zhì)雜質(zhì)Ⅲ工藝、降解雜質(zhì)表3雜質(zhì)信息（續(xù)）雜質(zhì)代號(hào)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)雜質(zhì)來(lái)源雜質(zhì)Ⅳ工藝、降解雜質(zhì)雜質(zhì)Ⅴ工藝、降解雜質(zhì)2.2實(shí)驗(yàn)儀器儀器信息見(jiàn)表４。表4儀器設(shè)備儀器試藥名稱規(guī)格或型號(hào)廠家電子天平（十萬(wàn)分之一）AB135-S梅特勒電子天平（十萬(wàn)分之一）MS105DU梅特勒電子天平（萬(wàn)分之一）R200D賽多利斯電子天平（百萬(wàn)分之一）XPR2梅特勒高效液相色譜儀2030CPlus島津pH計(jì)BP-10賽多利斯超聲儀KH-600昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司真空抽濾泵SHB-III北京瑞成偉業(yè)儀器有限公司色譜柱色譜柱AQC8納譜分析2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1色譜條件用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（WatersSymmetryC8,250×4.6mm，5μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）；以0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（用1mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至6.0）-甲醇-乙腈（124:49:27）為流動(dòng)相；流速為每分鐘1.2ml；檢測(cè)波長(zhǎng)為207nm；柱溫為50℃；進(jìn)樣體積15μl。2.3.2溶液制備溶劑：磷酸溶液（取磷酸0.38g，用水稀釋至1000ml）-甲醇-乙腈（124:49:27）供試品溶液：將膠囊內(nèi)容物研細(xì)，精密稱量適量，放入50ml量瓶中，加溶劑約30ml，超聲10分鐘使磷酸奧司他韋溶解，冷卻后用溶劑稀釋至刻度線，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液。對(duì)照品溶液：精密稱取磷酸奧司他韋對(duì)照品適量，加溶劑溶解并定量稀釋?zhuān)瞥擅?ml含有1μg磷酸奧司他韋的溶液。系統(tǒng)適用性溶液：取雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ、雜質(zhì)Ⅳ、雜質(zhì)Ⅴ、磷酸奧司他韋對(duì)照品和輔料聚維酮K30各適量，用溶劑溶解并稀釋制成每1ml中約含雜質(zhì)Ⅰ3μg、雜質(zhì)Ⅱ2μg、雜質(zhì)Ⅲ5μg、雜質(zhì)Ⅳ2μg、雜質(zhì)Ⅴ2μg、磷酸奧司他韋1mg和聚維酮K30820μg的溶液。靈敏度溶液：精密量取對(duì)照品溶液5ml，置10ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度線，搖勻。雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品貯備液：精密稱取約3mg雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品放入10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻。雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌焚A備液：精密稱取約2mg雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌贩湃?0ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻。雜質(zhì)Ⅲ對(duì)照品貯備液：精密稱取約8mg雜質(zhì)Ⅲ對(duì)照品放入10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。雜質(zhì)Ⅳ對(duì)照品貯備液：精密稱取約2mg雜質(zhì)Ⅳ對(duì)照品放入10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。雜質(zhì)Ⅴ對(duì)照品貯備液：精密稱取約2mg雜質(zhì)Ⅴ對(duì)照品放入10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。2.3.3系統(tǒng)適用性取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液、對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性溶液各15μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣5針，主成分峰保留時(shí)間及RSD值驗(yàn)證系統(tǒng)適用性精密度是否良好。2.3.4專(zhuān)屬性空白介質(zhì)、空白輔料干擾試驗(yàn)精密稱取50mg空白輔料到50ml量瓶中，加入適量溶劑使其完全溶解并稀釋至刻度線后充分搖勻，經(jīng)濾過(guò)即得空白輔料溶液。取“2.3.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液、空白溶劑及上述溶液各15μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。濾膜吸附試驗(yàn)使用表5中不同濾膜對(duì)空白溶劑進(jìn)行過(guò)濾，取第2ml、第5ml、第8ml樣品分別進(jìn)樣，得到濾材浸出物溶液。表5不同的濾膜材質(zhì)材質(zhì)規(guī)格廠家顏色尼龍0.45μm上海安譜白色聚四氟乙烯10.45μm上海安譜橙色表5不同的濾膜材質(zhì)（續(xù)）材質(zhì)規(guī)格廠家顏色聚四氟乙烯20.22μm上海安譜金色聚四氟乙烯30.45μmMREDA紅色取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液離心后使用表5中不同濾膜進(jìn)行過(guò)濾，取第2ml、5ml、8ml樣品分別進(jìn)樣，得到濾材吸附量溶液。分別取上述溶液精密量取各15μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。2.3.5強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)取用空白輔料、自制樣品、參比制劑、原料采用不同破壞條件，包括強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、光照、高溫、高濕，精密量取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液及上述破壞溶液各15μl注入液相色譜儀。表6強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)方法破壞條件制備方法未破壞精密稱取藥粉35mg，置50ml量瓶中，加溶劑30ml，超聲，放冷，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。氧化破壞精密稱取藥粉35mg，置50ml量瓶中，加30%過(guò)氧化氫溶液1ml，室溫放置48h后取出，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。堿破壞精密稱取藥粉35mg，置50ml量瓶中，加1ml1mol/LNaOH，室溫放置5分鐘進(jìn)行強(qiáng)降解，強(qiáng)降解后的樣品，加入1ml1mol/LHCl溶液調(diào)節(jié)至中性，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。高溫精密稱取藥粉35mg，置50ml量瓶中，加溶劑約40ml，超聲10min使溶解，80℃水浴6小時(shí)后取出，放冷，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。高濕精密稱取藥粉35mg，置50ml量瓶中，高濕90%條件下放置48h后取出，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。光照精密稱取藥粉35mg，置50ml量瓶中，加溶劑約40ml溶解后，在強(qiáng)光（5000Lux）條件下放置24h后取出，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。2.3.6檢測(cè)限精密稱取磷酸奧司他韋對(duì)照品、雜質(zhì)I、II、III、IV、V各適量，加溶劑溶解并稀釋制成一定濃度的溶液，接著逐步用溶劑將該溶液稀釋到適宜濃度，當(dāng)信噪比為3:1時(shí)注入色譜儀確定檢測(cè)限。2.3.7定量限精密稱取磷酸奧司他韋對(duì)照品、雜質(zhì)I、II、III、IV、V各適量，加溶劑溶解并稀釋制成一定濃度的溶液，接著逐步用溶劑將該溶液稀釋到適宜濃度，當(dāng)信噪比為10:1時(shí)注入色譜儀來(lái)確定定量限。連續(xù)進(jìn)樣定量限溶液6次，以評(píng)估定量限的重復(fù)性是否滿足要求。2.3.8線性與范圍取“2.3.2”項(xiàng)下雜質(zhì)I至雜質(zhì)V貯備液各2ml，放入50ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度線，搖勻，即得線性貯備液。以供試品濃度的20%至150%范圍內(nèi)進(jìn)行線性實(shí)驗(yàn)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性與范圍試驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)≥0.999，截距比小于10%。表7線性溶液配制方法相當(dāng)于供試品濃度（%）取線性貯備液體積（ml）量瓶（ml）雜質(zhì)I理論濃度（μg/ml）雜質(zhì)II、IV、V理論濃度（μg/ml）雜質(zhì)III理論濃度（μg/ml）201200.60.41402201.20.82804202.41.641005203.02.051507.5204.537.5分別精密量取適量貯備液，逐級(jí)稀釋至一系列濃度的線性溶液，精密量取不同濃度的溶液10μl，注入色譜儀。2.3.9精密度重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密量取“2.3.2”項(xiàng)下供試品、對(duì)照品、靈敏度、系統(tǒng)適用性溶液各15μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。6份樣品測(cè)得各已知雜質(zhì)和其他單個(gè)雜質(zhì)的變化量均應(yīng)小于0.05%，未知雜質(zhì)總量和總雜的變化量值均應(yīng)小于0.1%。中間精密度于不同日期、不同人員、不同儀器，使用同一批樣品平行配制12份考察中間精密度。精密量取“2.3.2”項(xiàng)下供試品、對(duì)照品、靈敏度、系統(tǒng)適用性溶液以及12份樣品注入色譜儀，并記錄色譜圖。12份供試品溶液中各已知雜質(zhì)和其他單個(gè)雜質(zhì)的變化量均應(yīng)小于0.05%，未知雜質(zhì)總量和總雜的變化量值均應(yīng)小于0.1%。2.3.10相對(duì)校正因子根據(jù)校正因子計(jì)算的要求，相對(duì)校正因子=奧司他韋斜率/雜質(zhì)斜率，做線性試驗(yàn)并回歸線性方程。同時(shí)參照磷酸奧司他韋膠囊進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)、磷酸奧司他韋膠囊標(biāo)準(zhǔn)擬定本品各雜質(zhì)的相對(duì)校正因子。2.3.11準(zhǔn)確度根據(jù)100%的實(shí)驗(yàn)溶液濃度配制出3份供試品溶液，分別為50%、100%、150%，使用色譜條件“2.3.1”進(jìn)行進(jìn)樣?；厥章寿A備液：取“2.3.2”項(xiàng)下雜質(zhì)（I、II、III、IV、V）對(duì)照品貯備液各5ml，放入50ml量瓶中，加入溶劑至刻度，搖勻，得回收率貯備液?？瞻纵o料溶液：取空白輔料（批號(hào)：JAS-210830-01）約35mg，放入50ml量瓶中加入適量溶劑，超聲10分鐘使其溶解，冷卻后加入溶劑稀釋至刻度線，搖勻，過(guò)濾后取續(xù)濾液，得空白輔料溶液。表8各限度溶液配制方法限度配制內(nèi)容50%供試品溶液精密稱取本品適量，置20ml量瓶中，加溶劑適量，超聲使磷酸奧司他韋溶解，放冷，加入回收率貯備液1ml，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。（配制3份）100%供試品溶液精密稱取本品適量，置20ml量瓶中，加溶劑適量，超聲使磷酸奧司他韋溶解，放冷，加入回收率貯備液2ml，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。（配制3份）150%供試品溶液精密稱取本品適量，置20ml量瓶中，加溶劑適量，超聲使磷酸奧司他韋溶解，放冷，加入回收率貯備液3ml，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。（配制3份）取“2.3.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液、靈敏度溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液及上述溶液各15μl注入液相色譜儀中并記錄色譜圖。2.3.12耐用性溶液穩(wěn)定性在室溫條件下將“2.3.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，放置0~48小時(shí)，精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各15μl，注入液相色譜儀并記錄色譜圖以監(jiān)測(cè)峰面積的變化情況。色譜條件耐用性通過(guò)改變不同柱溫、不同品牌色譜柱、不同流動(dòng)相pH、不同流動(dòng)相比例來(lái)評(píng)估測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度。測(cè)定條件變化范圍如下：表9耐用性變化指數(shù)色譜參數(shù)規(guī)定值變動(dòng)的范圍柱溫50℃48℃、52℃流動(dòng)相比例620-245-135625-240-135、615-250-135流動(dòng)相PHPH6.0PH6.2、PH5.8色譜柱Waterssymmetry?C84.6×250mm，5μm納譜ChromCoreC84.6×250mm，5μm2.13樣品檢測(cè)根據(jù)確定的檢測(cè)方法對(duì)本品連續(xù)驗(yàn)證三批樣品（批號(hào)：20211101、20211102、20211103）及參比制劑（批號(hào)：M1045、M1066、M1069）的雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。3結(jié)果與分析3.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表10可知，系統(tǒng)適用性溶液中奧司他韋峰的理論塔板數(shù)大于2000，各雜質(zhì)出峰順序依次為雜質(zhì)III、雜質(zhì)II、雜質(zhì)I、雜質(zhì)V、奧司他韋、雜質(zhì)IV，各色譜峰的分離度均大于1.5，說(shuō)明各雜質(zhì)與主成分的分離度良好。主成分奧司他韋峰保留時(shí)間的RSD為0，峰面積RSD為0.9%，證明系統(tǒng)適用性精密度良好。表10系統(tǒng)適用性結(jié)果組分理論板數(shù)（N）保留時(shí)間（t）拖尾因子（T）分離度（R）雜質(zhì)V78583.1040.9881.645雜質(zhì)III75653.3341.031.569雜質(zhì)II128938.2810.83322.229雜質(zhì)I119409.3240.8273.297奧司他韋976116.3231.04913.968雜質(zhì)IV1537123.1620.8179.7133.2專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1空白介質(zhì)、空白輔料干擾試驗(yàn)結(jié)果圖3表明空白溶劑及空白輔料對(duì)主成分和各雜質(zhì)測(cè)定無(wú)干擾，證明方法專(zhuān)屬性良好。圖3干擾試驗(yàn)色譜圖3.2.2濾膜吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表11-12表明供試品溶液通過(guò)濾膜棄去不同體積，各雜質(zhì)檢出量與離心樣品各雜質(zhì)檢出量比較，均無(wú)明顯差異，雜質(zhì)變化量均小于0.05%，主峰面積與離心樣品中主峰峰面積比較，變化量均小于2.0%，綜上，選擇PTFE（上海安譜0.45μm）進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果無(wú)影響。表11濾膜吸附供試品溶液中奧司他韋峰面積變化結(jié)果樣品處理方式棄去體積峰面積A變化量（%）離心/20027387/尼龍（0.45μm）上海安譜2ml20019880-0.045ml200695140.218ml19958905-0.34表11濾膜吸附供試品溶液中奧司他韋峰面積變化結(jié)果（續(xù)）樣品處理方式棄去體積峰面積A變化量（%）聚四氟乙烯1（0.22μm）上海安譜2ml19951634-0.385ml19864520-0.818ml19842416-0.92聚四氟乙烯2（0.45μm）上海安譜2ml200708920.225ml19936324-0.458ml19997445-0.15聚四氟乙烯3（0.45μm）MREDA2ml19900784-0.635ml19951578-0.388ml19855754-0.86表12濾膜吸附供試品溶液中各雜質(zhì)變化結(jié)果名稱雜質(zhì)I%雜質(zhì)II%雜質(zhì)III%雜質(zhì)IV%未知雜質(zhì)總量%單雜%總雜%樣品-離心0.010.070.040.020.180.060.32尼龍-棄2ml0.010.070.050.020.200.060.34尼龍-棄5ml0.010.070.040.020.170.060.32尼龍-棄8ml0.010.070.040.020.180.060.33聚四氟乙烯1-棄2ml0.010.070.040.020.180.060.32聚四氟乙烯1-棄5ml0.010.070.040.020.190.060.33聚四氟乙烯1-棄8ml0.010.070.040.020.170.060.31聚四氟乙烯2-棄2ml0.010.070.040.020.190.060.33聚四氟乙烯2-棄5ml0.010.070.040.020.190.060.33聚四氟乙烯2-棄8ml0.010.070.040.020.180.060.32聚四氟乙烯3-棄2ml0.010.070.040.020.190.060.33聚四氟乙烯3-棄5ml0.010.070.040.020.190.060.33聚四氟乙烯3-棄8ml0.010.070.040.020.170.060.313.2.3強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果系統(tǒng)適用性結(jié)果表明所有成分都能被有效分離，理論板數(shù)高。在酸性和堿性環(huán)境下自制制劑和參比制劑都能降解生成已知雜質(zhì)III；在氧化條件下會(huì)降解生成已知雜質(zhì)II；在高溫、高濕和光照環(huán)境下，會(huì)產(chǎn)生一些未知雜質(zhì)峰，但都能與磷酸奧司他韋完全分離。以未破壞樣品為100%進(jìn)行物料平衡考察，破壞后樣品A/C系數(shù)與未破壞的樣品A/C系數(shù)的比值都在0.9~1.1之間，說(shuō)明在各破壞條件下物料都是守恒的。在各破壞條件下，最小峰純度指數(shù)都符合規(guī)定，奧司他韋峰純度是合格，而且在各種破壞條件下，輔料對(duì)本品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)都沒(méi)有干擾，說(shuō)明該色譜條件專(zhuān)屬性好。表13強(qiáng)降解試驗(yàn)系統(tǒng)適用性結(jié)果名稱保留時(shí)間（min）相對(duì)保留時(shí)間（min）理論板數(shù)(N)分離度（R）拖尾因子（T）雜質(zhì)V3.1270.1944801.492/雜質(zhì)III3.3640.2051541.2671.483雜質(zhì)II8.2590.501141219.7111.357雜質(zhì)I9.440.5796553.4061.454奧司他韋16.6741.00700412.2481.855雜質(zhì)IV23.6761.42137578.7301.363表14自制樣品破壞試驗(yàn)結(jié)果破壞途徑面積歸一化（%）雜質(zhì)個(gè)數(shù)理論塔板數(shù)分離度a未破壞99.539968293.499酸破壞96.7051070583.620堿破壞93.628472283.749氧化破壞99.1651070243.345高溫破壞98.935769133.642高濕破壞99.573769393.577光照破壞99.638669873.506表15參比制劑破壞試驗(yàn)結(jié)果破壞途徑面積歸一化（%）雜質(zhì)個(gè)數(shù)理論塔板數(shù)分離度未破壞99.786469443.173酸破壞96.974868798.254堿破壞81.842374998.681氧化破壞99.4371170343.051高溫破壞99.256569403.165高濕破壞99.873470743.534光照破壞99.868470163.458表16原料破壞試驗(yàn)結(jié)果破壞途徑面積歸一化（%）雜質(zhì)個(gè)數(shù)理論塔板數(shù)分離度未破壞99.749569813.713酸破壞96.508770263.636堿破壞86.411373833.742氧化破壞99.517869153.599高溫破壞99.013769143.635高濕破壞99.753568083.645光照破壞99.806370193.7133.3檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)表17可以得知磷酸奧司他韋、雜質(zhì)I、雜質(zhì)II、雜質(zhì)III、雜質(zhì)IV和雜質(zhì)V在相當(dāng)于主成分的濃度達(dá)到0.001%以上都能被檢測(cè)出來(lái)，且S/N≈3，這說(shuō)明色譜條件具有很高的靈敏度，非常適合用于雜質(zhì)的檢測(cè)與控制。表17檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果名稱濃度（μg/ml）檢測(cè)限（ng）相當(dāng)于主成分百分比（%）S/N奧司他韋0.0110.170.0014雜質(zhì)I0.0250.380.0035雜質(zhì)II0.0020.030.0003雜質(zhì)III0.0080.120.0013雜質(zhì)IV0.0911.370.0094雜質(zhì)V0.0240.360.00243.4定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表18可知磷酸奧司他韋、雜質(zhì)I、雜質(zhì)II、雜質(zhì)III、雜質(zhì)IV、雜質(zhì)V相當(dāng)于主成分0.003%以上均能被準(zhǔn)確定量。由表19可以看出定量限溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，峰面積RSD值小于15.0%，即定量限重復(fù)性符合要求。表明本品色譜條件靈敏度高，適合進(jìn)行雜質(zhì)控制。表18定量限結(jié)果名稱濃度（μg/ml）定量限（ng）相當(dāng)于主成分百分比（%）S/N奧司他韋0.0590.890.00611雜質(zhì)I0.0821.230.00810雜質(zhì)II0.0250.380.00313雜質(zhì)III0.0280.420.00314雜質(zhì)IV0.1522.280.01514雜質(zhì)V0.081.200.00810表19重復(fù)性結(jié)果進(jìn)樣次數(shù)123456RSD%奧司他韋1373125412161295128313164.2雜質(zhì)I1737175416961681177018663.8雜質(zhì)II1425141915351418150614713.4雜質(zhì)III4303894314483954395.7雜質(zhì)IV2658256825022827255625774.4雜質(zhì)V8978868908889028711.23.5線性與范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表20圖4可知雜質(zhì)I在0.623~4.671μg/ml濃度范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，線性方程為y=26297.8306x-844.5535，r=0.9998，截距比為1.08。由表21圖5可知雜質(zhì)II在0.408~3.059μg/ml濃度范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，線性方程為y=70009.5950x-1108.8619，r=0.9998，截距比為0.80。由表22圖6可知雜質(zhì)III在0.752~5.641μg/ml濃度范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，線性方程為y=32458.7756x-1007.7724，r=0.9998，截距比為0.62。由表23圖7可知雜質(zhì)IV在0.404~3.028μg/ml濃度范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，線性方程為y=20256.7071x-1294.6624，r=0.9998，截距比為3.30。由表24圖8可知雜質(zhì)V在0.399~2.993μg/ml濃度范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，線性方程為y=24641.7232x-27.4496，r=1.0000，截距比為0.06。表20雜質(zhì)I線性試驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)于限度濃度的百分?jǐn)?shù)（%）濃度(μg/ml)峰面積20%供試品溶液0.6231152740%供試品溶液1.2462427580%供試品溶液2.49147725100%供試品溶液3.11460739150%供試品溶液4.67191926圖4雜質(zhì)Ⅰ線性標(biāo)準(zhǔn)曲線表21雜質(zhì)II線性試驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)于限度濃度的百分?jǐn)?shù)（%）濃度(μg/ml)峰面積20%供試品溶液0.4082789340%供試品溶液0.8165673280%供試品溶液1.631111515100%供試品溶液2.039141121150%供試品溶液3.059213981圖5雜質(zhì)Ⅱ線性標(biāo)準(zhǔn)曲線表22雜質(zhì)III線性試驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)于限度濃度的百分?jǐn)?shù)（%）濃度(μg/ml)峰面積20%供試品溶液0.7522379940%供試品溶液1.5044840380%供試品溶液3.00995207100%供試品溶液3.761120766150%供試品溶液5.641182859圖6雜質(zhì)Ⅲ線性標(biāo)準(zhǔn)曲線表23雜質(zhì)IV線性試驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)于限度濃度的百分?jǐn)?shù)（%）濃度(μg/ml)峰面積20%供試品溶液0.404669040%供試品溶液0.8081507180%供試品溶液1.61531480100%供試品溶液2.01940041150%供試品溶液3.02859746圖7雜質(zhì)Ⅳ線性標(biāo)準(zhǔn)曲線表24雜質(zhì)V線性試驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)于限度濃度的百分?jǐn)?shù)（%）濃度(μg/ml)峰面積20%供試品溶液0.399994640%供試品溶液0.7981945780%供試品溶液1.59639276100%供試品溶液1.99549195150%供試品溶液2.99373726圖8雜質(zhì)V線性標(biāo)準(zhǔn)曲線3.6精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.6.1重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果平行配制6份樣品測(cè)得各已知雜質(zhì)和其他單個(gè)雜質(zhì)的變化量均小于0.05%，未知雜質(zhì)總量和總雜的變化量值均小于0.1%，表明此方法檢測(cè)本品雜質(zhì)重復(fù)性良好。表25重復(fù)性測(cè)定結(jié)果名稱樣1樣2樣3樣4樣5樣6變化量%雜質(zhì)I%0.010.010.010.010.010.010.00雜質(zhì)II%0.070.070.080.070.070.070.01雜質(zhì)III%0.050.050.050.050.050.050.00雜質(zhì)IV%0.010.010.010.010.010.010.00其他單個(gè)雜質(zhì)%0.040.040.050.040.050.040.01未知雜質(zhì)總量%20.01總雜%60.023.6.2中間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同人員于不同時(shí)間使用不同儀器，測(cè)定的12份供試品溶液中各雜質(zhì)檢出量基本一致，表現(xiàn)為各已知雜質(zhì)和其他單個(gè)雜質(zhì)變化量均小于0.05%，未知雜質(zhì)總量和雜質(zhì)總量的變化量值均小于0.1%，證明此方法精密度良好。表26中間精密度測(cè)定結(jié)果中間精密度雜質(zhì)I%雜質(zhì)II%雜質(zhì)III%雜質(zhì)IV%其他單個(gè)雜質(zhì)%未知雜質(zhì)總量%雜質(zhì)總量%樣10.010.080.040.020.040.160.31樣20.010.070.040.020.060.160.29樣30.010.070.040.020.060.160.30樣40.010.070.040.020.060.160.30樣50.010.070.040.020.060.160.30樣60.010.070.040.020.060.160.30表27重復(fù)性測(cè)定結(jié)果重復(fù)性雜質(zhì)I%雜質(zhì)II%雜質(zhì)III%雜質(zhì)IV%其他單個(gè)雜質(zhì)%未知雜質(zhì)總量%雜質(zhì)總量%樣10.010.070.050.010.040.110.24樣20.010.070.050.010.040.110.25樣30.010.080.050.010.050.110.25樣40.010.070.050.010.040.110.24樣50.010.070.050.010.050.110.25樣60.010.070.050.010.040.120.263.7相對(duì)校正因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果為嚴(yán)格控制雜質(zhì)量，各雜質(zhì)相對(duì)校正因子測(cè)定值，擬定雜質(zhì)I、II、III、IV、V的相對(duì)校正因子分別為1.00、0.37、0.80、1.29、1.00。表28磷酸奧司他韋干混懸劑相對(duì)校正因子對(duì)比名稱擬定值（申報(bào)標(biāo)準(zhǔn)）測(cè)定值磷酸奧司他韋膠囊進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)磷酸奧司他韋膠囊USP43雜質(zhì)I1.000.98//雜質(zhì)II0.370.370.370.37雜質(zhì)III0.800.800.720.71雜質(zhì)IV1.291.291.111.11雜質(zhì)V1.001.050.84/其他單個(gè)雜質(zhì)1.00//1.03.8準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果9份樣品回收率測(cè)定結(jié)果均在90%~108%之間，每個(gè)濃度測(cè)定值RSD值小于5.0%，3個(gè)濃度測(cè)定值RSD值小于5.0%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。表29雜質(zhì)I準(zhǔn)確度結(jié)果名稱測(cè)定量（μg）加入量（μg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）平均值（%）RSD（%）50%-130.55830.76099.3499.360.699.260.650%-230.74630.76099.9550%-330.39030.76098.80100%-160.39461.52098.1798.750.6100%-261.11361.52099.34100%-360.74461.52098.74150%-192.23792.28099.9599.670.2150%-291.88892.28099.58150%-391.80292.28099.48表30雜質(zhì)II準(zhǔn)確度結(jié)果名稱測(cè)定量（μg）加入量（μg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）平均值（%）RSD（%）50%-131.67020.29097.8695.871.897.982.550%-231.00320.29095.0150%-331.06120.29094.73100%-151.04540.58096.6397.190.5100%-251.40540.58097.56100%-351.11640.58097.38150%-173.07560.870101.0100.90.3150%-273.34760.870101.1150%-372.87760.870100.6表31雜質(zhì)III準(zhǔn)確度結(jié)果名稱測(cè)定量（μg）加入量（μg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）平均值（%）RSD（%）50%-165.28758.20099.7299.740.299.440.750%-265.11958.20099.5350%-365.44158.20099.96100%-1121.129116.40097.8398.740.8100%-2122.450116.40098.97100%-3122.829116.40099.41150%-1181.277174.60099.7499.860.2150%-2181.429174.60099.76150%-3181.873174.600100.1表32雜質(zhì)IV準(zhǔn)確度結(jié)果名稱測(cè)定量（μg）加入量（μg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）平均值（%）RSD（%）50%-122.83119.990102.9101.73.2102.82.150%-221.83019.99097.9650%-323.08419.990104.1100%-144.02239.980104.4103.41.2100%-243.69039.980103.6100%-343.02339.980102.1150%-163.15459.970101.6103.41.6150%-264.36459.970103.6150%-365.15459.970104.9表33雜質(zhì)V準(zhǔn)確度結(jié)果名稱測(cè)定量（μg）加入量（μg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）平均值（%）RSD（%）50%-120.30520.070101.2101.10.1100.42.350%-220.28520.070101.150%-320.29020.070101.1100%-139.64640.14098.7798.403.4100%-238.07340.14094.85100%-340.78040.140101.6150%-161.29160.210101.8101.80.2150%-261.15860.210101.6150%-361.39560.210102.03.9耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.9.1溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果系統(tǒng)適用性溶液在0~48h內(nèi)各雜質(zhì)與主成分分離度表現(xiàn)良好且相對(duì)保留時(shí)間基本一致，沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明系統(tǒng)適用性溶液在48h內(nèi)有良好穩(wěn)定性；供試品溶液在0~48h不同時(shí)間點(diǎn)各雜質(zhì)的檢出量與0h各已知雜質(zhì)檢出量的極差都小于0.05%，總雜檢出量的極差小于0.1%，與0h相比各雜質(zhì)的檢出量沒(méi)有顯著變化，證明供試品溶液在48小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性。至于對(duì)照品溶液在0~48h不同時(shí)間點(diǎn)，奧司他韋峰面積的保留時(shí)間的RSD%為0.4%，峰面積的RSD為1.7%，這表明對(duì)照品溶液在48小時(shí)內(nèi)也是穩(wěn)定的。表34系統(tǒng)適用性溶液穩(wěn)定性結(jié)果樣品樣品名稱保留時(shí)間（min）相對(duì)保留時(shí)間理論板數(shù)分離度0h雜質(zhì)V3.1330.1960221.639雜質(zhì)III3.3660.2167391.431雜質(zhì)II8.2690.511054520.171雜質(zhì)I9.2270.5798312.76奧司他韋16.1271.00789212.565雜質(zhì)IV22.8731.42111508.4728h雜質(zhì)V3.1340.1960191.663雜質(zhì)III3.3690.2166561.437雜質(zhì)II8.2940.511047220.13雜質(zhì)I9.2570.5797062.75奧司他韋16.1751.00787912.525雜質(zhì)IV22.9371.42113458.50316h雜質(zhì)V3.1260.1960131.644雜質(zhì)III3.3610.2166351.443雜質(zhì)II8.2640.511066620.212雜質(zhì)I9.2260.5796952.769奧司他韋16.1271.00788012.53表34系統(tǒng)適用性溶液穩(wěn)定性結(jié)果（續(xù)）樣品樣品名稱保留時(shí)間（min）相對(duì)保留時(shí)間理論板數(shù)分離度16h雜質(zhì)IV22.8711.42114798.53524h雜質(zhì)V3.130.1960341.632雜質(zhì)III3.3640.2167541.442雜質(zhì)II8.2730.511058420.226雜質(zhì)I9.2520.5797662.813奧司他韋16.1691.00786612.535雜質(zhì)IV22.8931.42112628.44636h雜質(zhì)V3.1280.1960271.641雜質(zhì)III3.3650.2167161.453雜質(zhì)II8.270.511053620.164雜質(zhì)I9.2740.5797842.88奧司他韋16.211.00774712.478雜質(zhì)IV22.9081.41114378.40744h聚維酮K302.8550.184075/雜質(zhì)V3.1310.1961121.630雜質(zhì)III3.3680.2167441.460雜質(zhì)II8.2730.511058620.202雜質(zhì)I9.2960.5794882.909奧司他韋16.2431.00775012.407雜質(zhì)IV22.9341.41112588.35048h聚維酮K302.840.174009/雜質(zhì)V3.1160.1960851.629雜質(zhì)III3.3540.2166201.463雜質(zhì)II8.2710.511037820.083雜質(zhì)I9.2910.5795632.896奧司他韋16.2411.00762312.366雜質(zhì)IV22.9341.41109058.25表35供試品溶液溶液穩(wěn)定性結(jié)果時(shí)間（h）雜質(zhì)I%雜質(zhì)II%雜質(zhì)III%雜質(zhì)IV%單雜%總雜%0h0.0150.2040.0590.0050.0440.3848h0.0150.2060.0590.0080.0430.38716h0.0150.2110.0590.0080.0410.39528h0.0150.2120.0590.0100.0410.41232h0.0150.2120.0590.0110.0420.41942h0.0150.2170.060.0120.040.42648h0.0160.2190.0590.0150.0420.4393.9.2色譜條件耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表36-39可知當(dāng)色譜條件中柱溫、pH值、色譜柱、流動(dòng)相比例發(fā)生微小變化時(shí)，系統(tǒng)適用性溶液均滿足要求；每個(gè)條件雜質(zhì)與原條件檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯變化，各已知雜質(zhì)和單雜檢出量極差小于0.05%，未知雜質(zhì)總量和總雜檢出量極差小于0.1%，供試品溶液中測(cè)得的雜質(zhì)結(jié)果基本一致，表明該方法耐用性良好。表36流動(dòng)相比例結(jié)果名稱保留時(shí)間（min）相對(duì)保留時(shí)間（RRT）理論板數(shù)（N）分離度（R）拖尾因子625-240-135雜質(zhì)V3.1150.1963221.629/雜質(zhì)III3.3370.2068701.3971.048雜質(zhì)II8.2190.501083620.4750.902雜質(zhì)I9.2130.56101022.9130.907奧司他韋16.060.97826712.7591.248雜質(zhì)IV22.721.38122728.7240.865620-245-135雜質(zhì)V3.1160.2078161.871.255雜質(zhì)III3.3330.2289961.5431.172雜質(zhì)II7.9770.521771324.4241.048雜質(zhì)I8.9350.58149193.61.05奧司他韋15.4461.001179215.1131.655雜質(zhì)IV21.991.421996810.9861.054615-250-135雜質(zhì)V3.0870.2161051.387/雜質(zhì)III3.2880.2267901.2681.013雜質(zhì)II7.6510.521069219.1520.9雜質(zhì)I8.6340.5998293.0490.946奧司他韋14.6981.00823412.1751.188雜質(zhì)IV20.5471.40119278.3520.856表37不同柱溫結(jié)果名稱保留時(shí)間（min）相對(duì)保留時(shí)間（RRT）理論板數(shù)（N）分離度（R）拖尾因子48℃雜質(zhì)V3.3470.2188451.6521.187雜質(zhì)III8.1960.521787725.0271.062雜質(zhì)II9.0220.58143223.021.086雜質(zhì)I15.6791.001118214.8831.71奧司他韋22.3441.432027010.921.057雜質(zhì)IV3.1150.208153/1.21350℃雜質(zhì)V3.1160.2078161.871.255雜質(zhì)III3.3330.2289961.5431.172雜質(zhì)II7.9770.521771324.4241.048雜質(zhì)I8.9350.58149193.61.05奧司他韋15.4461.001179215.1131.655雜質(zhì)IV21.991.421996810.9861.05452℃雜質(zhì)V3.320.2288201.4411.065雜質(zhì)III7.7520.511734323.521.119雜質(zhì)II8.8590.58145424.1831.63雜質(zhì)I15.2221.001202914.9881.061奧司他韋21.5631.421994610.8781.057表37不同柱溫結(jié)果（續(xù)）名稱保留時(shí)間（min）相對(duì)保留時(shí)間（RRT）理論板數(shù)（N）分離度（R）拖尾因子52℃雜質(zhì)IV3.1180.207996/1.192表38不同PH值結(jié)果名稱保留時(shí)間（min）相對(duì)保留時(shí)間（RRT）理論板數(shù)（N）分離度（R）拖尾因子PH5.8雜質(zhì)V3.070.2163721.448/雜質(zhì)III3.3490.2369181.7751.016雜質(zhì)II8.2070.561053820.204/PH5.8雜質(zhì)I8.6390.5895601.285/奧司他韋14.7681.00690311.5161.337雜質(zhì)IV20.5111.39128508.0060.939PH6.0雜質(zhì)V3.1160.2078161.871.255雜質(zhì)III3.3330.2289961.5431.172雜質(zhì)II7.9770.521771324.4241.048雜質(zhì)I8.9350.58149193.61.05奧司他韋15.4461.001179215.1131.655雜質(zhì)IV21.991.421996810.9861.054PH6.2雜質(zhì)V3.1360.1959341.608/雜質(zhì)III3.3310.2068681.211/雜質(zhì)II8.1430.491055620.1390.882雜質(zhì)I9.4210.5796563.6490.892奧司他韋16.4931.00831312.7761.09雜質(zhì)IV23.221.41119458.5520.848表39不同色譜柱結(jié)果名稱保留時(shí)間（min）相對(duì)保留時(shí)間（RRT）理論板數(shù)（N）分離度（R）拖尾因子Waters雜質(zhì)V3.1340.1962861.585/雜質(zhì)III3.3630.2068491.4251.046雜質(zhì)II8.2820.501085620.4760.903雜質(zhì)I9.4030.57100713.2370.929奧司他韋16.471.00806612.7521.207雜質(zhì)IV23.2171.41122208.5760.865納譜雜質(zhì)V3.1160.2078161.871.255雜質(zhì)III3.3330.2289961.5431.172雜質(zhì)II7.9770.521771324.4241.048雜質(zhì)I8.9350.58149193.61.05奧司他韋15.4461.001179215.1131.655雜質(zhì)IV21.991.421996810.9861.0543.10樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果連續(xù)驗(yàn)證三批樣品雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果基本一致，各雜質(zhì)檢出量均較小，遠(yuǎn)低于各雜質(zhì)的擬定限度，驗(yàn)證三批樣品與參比制劑質(zhì)量一致，證明符合標(biāo)準(zhǔn)。表40工藝驗(yàn)證樣品檢測(cè)結(jié)果名稱批號(hào)雜質(zhì)Ⅰ%雜質(zhì)Ⅱ%雜質(zhì)Ⅲ%雜質(zhì)Ⅳ%其他總雜量%單雜%總雜%參比制劑M10450.010.040.040.070.060.020.23M10660.010.020.040.080.050.030.19M10690.010.020.040.070.060.030.21自制品20211101/0.070.040.010.120.040.2520211102/0.050.030.020.100.040.2020211103/0.030.030.030.100.040.194討論首先考察了方法的專(zhuān)屬性，即該方法在分析磷酸奧司他韋及其雜質(zhì)時(shí)的準(zhǔn)確性。通過(guò)使用不同的色譜柱和優(yōu)化的色譜條件，能夠有效分離出磷酸奧司他韋的主要成分和雜質(zhì)。雜質(zhì)的分離度和奧司他韋峰的保留時(shí)間表明，該方法能夠精準(zhǔn)地識(shí)別和分離目標(biāo)成分和雜質(zhì)，進(jìn)一步證實(shí)了方法的專(zhuān)屬性。接下來(lái)，對(duì)方法的精密度進(jìn)行了評(píng)估。在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行多次測(cè)試，我們觀察到了非常低的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，這表明了實(shí)驗(yàn)方法在重復(fù)使用時(shí)能保持一致的性能。這種高精密度對(duì)于藥品質(zhì)量控制至關(guān)重要，尤其是在連續(xù)生產(chǎn)和多批次分析中。在靈敏度方面，能夠在低濃度水平上有效檢測(cè)到雜質(zhì)，這對(duì)于確保藥品安全性至關(guān)重要。特別是對(duì)于微量雜質(zhì)的檢測(cè)，顯示出高靈敏度，能夠在臨床使用的安全范圍內(nèi)準(zhǔn)確地測(cè)量雜質(zhì)含量。系統(tǒng)適用性和耐用性的考察也是焦點(diǎn)。在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，如不同的柱溫、流動(dòng)相pH值等顯示出良好的穩(wěn)定性。此外，即使在長(zhǎng)時(shí)間使用后，該方法仍能保持良好的分離效果和準(zhǔn)確度，這表明了其良好的耐用性。通過(guò)這些全面的方法學(xué)驗(yàn)證，可以確信，本研究中使用的方法不僅適合于磷酸奧司他韋膠囊的質(zhì)量控制，而且其精確度和可靠性對(duì)于保障藥品的安全性和有效性至關(guān)重要。5結(jié)論系統(tǒng)適用性溶液的檢測(cè)結(jié)果顯示雜質(zhì)與主成分之間的分離度表現(xiàn)良好；靈敏度溶液主成分峰信噪比高達(dá)82.33遠(yuǎn)超10的標(biāo)準(zhǔn)，反映出儀器的高靈敏度；空白溶劑和空白輔料對(duì)各雜質(zhì)峰及主峰無(wú)干擾，實(shí)驗(yàn)采用上海安譜0.45μmPTFE濾膜，其雜質(zhì)變化量在0.05%之內(nèi)，破壞條件下的最小峰純度指數(shù)均為正數(shù)且主峰與相鄰雜質(zhì)分離度超過(guò)1.5顯示了良好的專(zhuān)屬性；磷酸奧司他韋及其雜質(zhì)I至雜質(zhì)V在相當(dāng)于主成分0.001%以上的濃度時(shí)均可被檢出，連續(xù)進(jìn)樣6次的定量限溶液峰面積RSD值小于15.0%顯示了高靈敏度；雜質(zhì)在0.405~5.641μg/ml的濃度范圍內(nèi)與奧司他韋在0.156~7.782μg/ml的濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=25867.9225x-86.1178，各雜質(zhì)截距比均低于5%，符合線性要求；已知雜質(zhì)和其他單個(gè)雜質(zhì)的變化量均在0.05%以內(nèi)，未知雜質(zhì)總量和總雜的變化量均在0.1%以