同型半胱氨酸特異性熒光探針構(gòu)建摘要：同型半胱氨酸（Hcy）是生物體代謝中的一個(gè)重要的中間產(chǎn)物，其代謝異常常常會(huì)引發(fā)眾多疾病例如高血壓、心血管疾病等。因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Hcy水平的波動(dòng)對(duì)于疾病預(yù)防和發(fā)現(xiàn)十分重要。由于生物硫醇的結(jié)構(gòu)相似、化學(xué)性質(zhì)相近且在體內(nèi)濃度差異，對(duì)Hcy熒光探針的開發(fā)造成了極大的挑戰(zhàn)，當(dāng)前Hcy熒光探針在特異性位點(diǎn)、熒光波長(zhǎng)和生物相容性等方面仍然存在很大的不足。因此，Hcy熒光探針的進(jìn)一步開發(fā)和研究仍迫在眉睫。在此，本文基于香豆素?zé)晒鈭F(tuán)，通過連接對(duì)羥基吡啶及對(duì)巰基吡啶作用位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成兩種熒光探針P1和P2，并通過核磁、質(zhì)譜對(duì)二者進(jìn)行譜圖解析，有望開發(fā)Hcy快速特異性熒光開啟型探針。關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸熒光探針特異性ConstructionofhomocysteinespecificfluorescentprobesAbstract:Asanimportantmetaboliteofsulfur-containingaminoacids,homocysteine(Hcy)isconsideredasanindependentriskfactorforhypertension,diabetesandcardiovasculardiseases.Therefore,itisimportanttomonitorthefluctuationofHcylevelinrealtimefortheearlydiagnosisandtreatmentofthesediseases.Duetothesimilarstructure,similarchemicalpropertyanddifferentconcentrationsinvivo,thedevelopmentofHCYfluorescentprobesisagreatchallenge.Atpresent,theHcyfluorescenceprobestillhassomedeficienciesinthespecificsites,fluorescencewavelengthsandBiocompatibility.Therefore,thefurtherdevelopmentandresearchofHCYfluorescentprobeisstillurgent.Basedonthecoumarinfluorophores,twokindsoffluorescenceprobesP1andP2weredesignedandsynthesizedbylinkingtheinteractionsitesofP-hydroxypyridineandP-mercaptopyridine,itishopefultodevelopHcyfastspecificfluorescenceopenprobe.Keywords:Homocysteine,fluorescentprobes,specificity1前言1.1緒論近年來，科研工作者們經(jīng)過不懈努力與深入研究，在分析化學(xué)領(lǐng)域和生命科學(xué)領(lǐng)域中不斷取得突破性進(jìn)展，并且日益意識(shí)到一些生物活性小分子在生命體系內(nèi)的關(guān)鍵作用。許多生物活性小分子在生物體內(nèi)發(fā)揮著細(xì)胞信號(hào)傳遞、代謝過程調(diào)控、基因表達(dá)等多個(gè)方面的至關(guān)作用。它們性質(zhì)活潑，貫穿著核酸、蛋白質(zhì)、脂類、糖類以及氨基酸等重要化合物的合成過程之中，積極參與生命過程的各個(gè)反應(yīng)，從而維持了生物體的各項(xiàng)生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。而其中的活性硫物種，包括：谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸、二氧化硫、硫化氫等，它們以游離狀態(tài)或與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在與生物體中，通過生物合成和代謝過程互相轉(zhuǎn)化、互相制約，其及代謝水平異常會(huì)引發(fā)各種各樣的疾病ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Kohl</Author><Year>2019</Year><RecNum>22</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[1]</style></DisplayText><record><rec-number>22</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713009930">22</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Kohl,J.B.</author><author>Mellis,A.T.</author><author>Schwarz,G.</author></authors></contributors><auth-address>InstituteofBiochemistry,DepartmentofChemistryandCenterforMolecularMedicineCologne,UniversityofCologne,Cologne,Germany.</auth-address><titles><title>Homeostaticimpactofsulfiteandhydrogensulfideoncysteinecatabolism</title><secondary-title>BrJPharmacol</secondary-title><alt-title>Britishjournalofpharmacology</alt-title></titles><periodical><full-title>BrJPharmacol</full-title><abbr-1>Britishjournalofpharmacology</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>BrJPharmacol</full-title><abbr-1>Britishjournalofpharmacology</abbr-1></alt-periodical><pages>554-570</pages><volume>176</volume><number>4</number><edition>2018/08/09</edition><keywords><keyword>Animals</keyword><keyword>Cysteine/*metabolism</keyword><keyword>Homeostasis</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>HydrogenSulfide/*metabolism</keyword><keyword>Mitochondria/metabolism</keyword><keyword>Sulfites/*metabolism</keyword></keywords><dates><year>2019</year><pub-dates><date>Feb</date></pub-dates></dates><isbn>0007-1188(Print) 0007-1188</isbn><accession-num>30088670</accession-num><urls></urls><custom2>PMC6346071</custom2><electronic-resource-num>10.1111/bph.14464</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[1]。其中，同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）作為活性硫物種的關(guān)鍵組成部分，是一種經(jīng)由蛋氨酸發(fā)生去甲基化反應(yīng)產(chǎn)生，包含巰基的生物硫醇，在蛋氨酸與半胱氨酸生物合成中扮演著重要角色。目前已有大量研究證明，同型半胱氨酸（Hcy）代謝異常與心血管疾病ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[2,3]、動(dòng)脈粥樣硬化ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4]、腦卒中ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[5]、阿爾茲海默癥ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Morris</Author><Year>2003</Year><RecNum>27</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>27</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713010698">27</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Morris,M.S.</author></authors></contributors><auth-address>JeanMayerUnitedStatesDepartmentofAgricultureHumanNutritionResearchCenteronAgingatTuftsUniversity,Boston,MA02111,USA.martha.morris@<martha.morris@></auth-address><titles><title>HomocysteineandAlzheimer'sdisease</title><secondary-title>LancetNeurol</secondary-title><alt-title>TheLancet.Neurology</alt-title></titles><periodical><full-title>LancetNeurol</full-title><abbr-1>TheLancet.Neurology</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>LancetNeurol</full-title><abbr-1>TheLancet.Neurology</abbr-1></alt-periodical><pages>425-8</pages><volume>2</volume><number>7</number><edition>2003/07/10</edition><keywords><keyword>AlzheimerDisease/*blood/*complications/epidemiology</keyword><keyword>Brain/pathology</keyword><keyword>Homocysteine/*blood/metabolism</keyword><keyword>Hyperhomocysteinemia/*complications/epidemiology</keyword><keyword>RiskFactors</keyword></keywords><dates><year>2003</year><pub-dates><date>Jul</date></pub-dates></dates><isbn>1474-4422(Print) 1474-4422</isbn><accession-num>12849121</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/s1474-4422(03)00438-1</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[6]和骨質(zhì)疏松ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[7]等疾病密切相關(guān)。當(dāng)血漿中同型半胱氨酸的濃度達(dá)到或者超過10μmol/L時(shí)，就會(huì)被定義為高Hcy血癥(HHcy)。在出現(xiàn)患者同時(shí)患有原發(fā)性高血壓的情況時(shí)，就會(huì)被進(jìn)一步被診斷為H型高血壓。因此，為了能夠得到Hcy的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)情況，開發(fā)并應(yīng)用一種能夠精確檢測(cè)Hcy變化的方法頗具意義。相比于高效液相色譜法（HPLC）、酶促循環(huán)分析法（ECA）、酶免疫分析法（EIA）和熒光極性化免疫分析（FPIA）等分析檢測(cè)手段ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[8-10]。熒光探針具有可視化、非破壞性、原位檢測(cè)等特點(diǎn)，能夠?yàn)樯钚苑肿由砗筒±磉^程的動(dòng)態(tài)示蹤提供獨(dú)特的解決方案，實(shí)現(xiàn)分子信息認(rèn)知到組織器官成像。ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wu</Author><Year>2022</Year><RecNum>32</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[11]</style></DisplayText><record><rec-number>32</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713011218">32</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wu,X.</author><author>Wang,R.</author><author>Kwon,N.</author><author>Ma,H.</author><author>Yoon,J.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofChemistryandNanoscience,EwhaWomansUniversity,Seoul03760,Korea.jyoon@ewha.ac.kr. BeijingNationalLaboratoryforMolecularSciences,KeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforLivingBiosystems,InstituteofChemistry,ChineseAcademyofSciences,Beijing100190,China.mahm@.</auth-address><titles><title>Activatablefluorescentprobesforinsituimagingofenzymes</title><secondary-title>ChemSocRev</secondary-title><alt-title>ChemicalSocietyreviews</alt-title></titles><periodical><full-title>ChemSocRev</full-title><abbr-1>ChemicalSocietyreviews</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>ChemSocRev</full-title><abbr-1>ChemicalSocietyreviews</abbr-1></alt-periodical><pages>450-463</pages><volume>51</volume><number>2</number><edition>2021/12/25</edition><keywords><keyword>Biomarkers</keyword><keyword>*FluorescentDyes</keyword><keyword>*OpticalImaging</keyword></keywords><dates><year>2022</year><pub-dates><date>Jan24</date></pub-dates></dates><isbn>0306-0012</isbn><accession-num>34951429</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1039/d1cs00543j</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[11]因此，已經(jīng)成為目前的重要檢測(cè)手段之一。然而，在細(xì)胞中存在三種小分子生物硫醇即半胱氨酸（Cys），同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH），它們結(jié)構(gòu)相近、化學(xué)性質(zhì)極其相似，每個(gè)化合物分子都具有一個(gè)巰基（-SH）和一個(gè)氨基（-NH2）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[12-16]，并且同型半胱氨酸與半胱氨酸相比，只在巰基前包含一個(gè)亞甲基，大多數(shù)的生物硫醇檢測(cè)熒光探針不能夠區(qū)分它們，尤其是Cys和Hcy。此外，它們?cè)谏矬w內(nèi)具有濃度差異，GSH含量為0.5~10mmol，遠(yuǎn)高于Hcy(9~13μmol)和Cys(30~200μmol)的含量，且Hcy含量是最少的，這些都對(duì)Hcy的特異性熒光探針合成造成了極大的挑戰(zhàn)?？茖W(xué)家們已經(jīng)開發(fā)了許多能夠檢測(cè)生物硫醇的熒光探針，但是到目前為止所存在的熒光探針在識(shí)別硫醇時(shí)依舊存在合成步驟繁瑣、識(shí)別時(shí)間長(zhǎng)、受其他氨基酸影響大等缺點(diǎn)。1.2熒光探針1.2.1熒光探針的結(jié)構(gòu)一般來說，熒光探針的結(jié)構(gòu)由三部分組成，分別是含大π鍵、剛性平面、共軛體系、具備給電子能力的熒光團(tuán)（Fluorophore），能夠?qū)z測(cè)物質(zhì)進(jìn)行特異性響應(yīng)的識(shí)別基團(tuán)（Acceptor）以及通過各種方式將二者連在一起的連接基團(tuán)（Linker）。在識(shí)別基團(tuán)與目標(biāo)分析化合物發(fā)生反應(yīng)結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度或者發(fā)射波長(zhǎng)等熒光信號(hào)改變ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Lichtman</Author><Year>2005</Year><RecNum>38</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[17]</style></DisplayText><record><rec-number>38</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713012194">38</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Lichtman,J.W.</author><author>Conchello,J.A.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofMolecularandCellBiology,HarvardUniversity,7DivinityAvenue,Cambridge,Massachusetts02138,USA.jeff@</auth-address><titles><title>Fluorescencemicroscopy</title><secondary-title>NatMethods</secondary-title><alt-title>Naturemethods</alt-title></titles><periodical><full-title>NatMethods</full-title><abbr-1>Naturemethods</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>NatMethods</full-title><abbr-1>Naturemethods</abbr-1></alt-periodical><pages>910-9</pages><volume>2</volume><number>12</number><edition>2005/11/22</edition><keywords><keyword>Animals</keyword><keyword>*FluorescentDyes</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Microscopy,Fluorescence/instrumentation/*methods</keyword></keywords><dates><year>2005</year><pub-dates><date>Dec</date></pub-dates></dates><isbn>1548-7091(Print) 1548-7091</isbn><accession-num>16299476</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1038/nmeth817</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[17]。但部分熒光探針即使不包含連接基團(tuán)結(jié)構(gòu)，也能夠?qū)崿F(xiàn)熒光的信號(hào)識(shí)別ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Qian</Author><Year>2015</Year><RecNum>39</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[18]</style></DisplayText><record><rec-number>39</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713012251">39</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Qian,X.</author><author>Xu,Z.</author></authors></contributors><auth-address>ShanghaiKeyLaboratoryofChemicalBiology,StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,SchoolofPharmacy,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China.xhqian@.</auth-address><titles><title>Fluorescenceimagingofmetalionsimplicatedindiseases</title><secondary-title>ChemSocRev</secondary-title><alt-title>ChemicalSocietyreviews</alt-title></titles><periodical><full-title>ChemSocRev</full-title><abbr-1>ChemicalSocietyreviews</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>ChemSocRev</full-title><abbr-1>ChemicalSocietyreviews</abbr-1></alt-periodical><pages>4487-93</pages><volume>44</volume><number>14</number><edition>2015/01/06</edition><keywords><keyword>Animals</keyword><keyword>CellLine</keyword><keyword>*FluorescentDyes</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>*Metals</keyword><keyword>Mice</keyword><keyword>Neoplasms/*pathology</keyword><keyword>OpticalImaging/*methods</keyword></keywords><dates><year>2015</year><pub-dates><date>Jul21</date></pub-dates></dates><isbn>0306-0012</isbn><accession-num>25556818</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1039/c4cs00292j</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[18]。據(jù)此分析，我們能夠發(fā)現(xiàn)，熒光團(tuán)承擔(dān)著識(shí)別信號(hào)，并將信號(hào)通過熒光釋放的功能。為了保證信號(hào)釋放的順利進(jìn)行，其分子結(jié)構(gòu)需要是吸電子結(jié)構(gòu)，同時(shí)還需具有特定的激發(fā)波長(zhǎng)的能量。此外，這些物質(zhì)還要求熒光量子產(chǎn)率到達(dá)一定高值。吸收光的分子所具有熒光量子產(chǎn)率偏低，所釋放出的熒光就會(huì)偏小，其中一個(gè)原因可能再于，當(dāng)吸收特定激發(fā)波長(zhǎng)的能量之后，這部分能量可能會(huì)被同類或者其他分子碰撞所消耗，最終以熱能的形式被釋放，因此不能夠以熒光的形式被釋放。通常情況下，當(dāng)發(fā)現(xiàn)分子中存在著π共軛結(jié)構(gòu)的時(shí)候，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)該分子的熒光效率將隨著共軛程度的增加而增加，從而在熒光光譜會(huì)表現(xiàn)為光譜向著波長(zhǎng)增加的方向移動(dòng)。因此，如果我們能夠?qū)⒎肿优c增強(qiáng)共軛的結(jié)構(gòu)進(jìn)行連接，便能夠?yàn)榉肿釉跓晒庑试黾踊蛘邿晒夤庾V向長(zhǎng)波方向移動(dòng)提供機(jī)會(huì)。1.2.2熒光探針的作用機(jī)制當(dāng)電子躍遷到激發(fā)態(tài)時(shí)，對(duì)于大多數(shù)電子而言會(huì)進(jìn)入到單重激發(fā)態(tài)。然而這種狀態(tài)并不能維持很長(zhǎng)的時(shí)間，這些電子會(huì)在非常快速的時(shí)間內(nèi)向下躍遷到達(dá)S1能級(jí)。接著，此能級(jí)內(nèi)的電子會(huì)向最低能級(jí)集中，在整個(gè)過程中的能量均會(huì)通過光來進(jìn)行釋放。對(duì)于這種光來說，它的半衰期非常短暫，以納秒為單位，被稱為熒光。對(duì)于那些半衰期超過納秒的電子，通常會(huì)經(jīng)由弛豫方式進(jìn)入到三重激發(fā)態(tài)，之后再經(jīng)由輻射躍遷的方式回到基態(tài)。由于這種方式所得到的三重態(tài)具有較長(zhǎng)半衰期，因此經(jīng)由的發(fā)射光也會(huì)具有較長(zhǎng)的存在壽命，這種發(fā)射光我們稱之為磷光。圖1.1熒光產(chǎn)生示意圖Figure1.1Schematicdiagramoffluorescencegeneration基于熒光探針的結(jié)構(gòu)以及熒光發(fā)射機(jī)制，科研工作者們衍生出了多種機(jī)制，包括分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移作用機(jī)制（IntramolecularChargeTransfer，ICT）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Nootem</Author><Year>2021</Year><RecNum>40</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[19]</style></DisplayText><record><rec-number>40</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713012695">40</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Nootem,Jukkrit</author><author>Daengngern,Rathawat</author><author>Sattayanon,Chanchai</author><author>Wattanathana,Worawat</author><author>Wannapaiboon,Suttipong</author><author>Rashatasakhon,Paitoon</author><author>Chansaenpak,Kantapat</author></authors></contributors><titles><title>ThesynergyofCHEFandICTtowardfluorescence‘turn-on’probesbasedonpush-pullbenzothiazolesforselectivedetectionofCu2+inacetonitrile/watermixture</title><secondary-title>JournalofPhotochemistryandPhotobiologyA:Chemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofPhotochemistryandPhotobiologyA:Chemistry</full-title></periodical><volume>415</volume><section>113318</section><dates><year>2021</year></dates><isbn>10106030</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.jphotochem.2021.113318</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[19]、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用機(jī)制（Photo-InducedElectronTransfer，PET）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wright</Author><Year>2020</Year><RecNum>41</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[20]</style></DisplayText><record><rec-number>41</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713012769">41</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wright,G.D.</author><author>Yao,C.Y.</author><author>Moody,T.S.</author><author>deSilva,A.P.</author></authors></contributors><auth-address>SchoolofChemistryandChemicalEngineering,Queen'sUniversity,BelfastBT95AG,NorthernIreland,UK.a.desilva@qub.ac.uk. AlmacSciences,CraigavonBT635QD,NorthernIreland,UK.</auth-address><titles><title>Fluorescentmolecularlogicgatesbasedonphotoinducedelectrontransfer(PET)drivenbyacombinationofatomicandbiomolecularinputs</title><secondary-title>ChemCommun(Camb)</secondary-title><alt-title>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</alt-title></titles><periodical><full-title>ChemCommun(Camb)</full-title><abbr-1>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>ChemCommun(Camb)</full-title><abbr-1>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</abbr-1></alt-periodical><pages>6838-6841</pages><volume>56</volume><number>50</number><edition>2020/05/21</edition><keywords><keyword>ElectronTransport</keyword><keyword>Fluorescence</keyword><keyword>FungalProteins/*chemistry</keyword><keyword>Hydrogen/chemistry</keyword><keyword>Lipase/*chemistry</keyword><keyword>*Logic</keyword><keyword>Sodium/chemistry</keyword></keywords><dates><year>2020</year><pub-dates><date>Jun23</date></pub-dates></dates><isbn>1359-7345</isbn><accession-num>32432237</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1039/d0cc00478b</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[20]、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移作用機(jī)制（Excited-StateIntramolecularProtonTransfer，ESIPT）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[21]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用機(jī)制（FluorescenceResonanceEnergyTransfer，F(xiàn)RET）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[22]等。分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移作用機(jī)制（ICT）分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移作用機(jī)制（ICT）指的是經(jīng)由一定波長(zhǎng)的光激發(fā)，電荷在分子內(nèi)部發(fā)生由供體向受體的轉(zhuǎn)移過程。具體表述為，探針分子內(nèi)的電荷經(jīng)由提供電子的基團(tuán)，在共軛體系的幫助下，移動(dòng)到接受電子基團(tuán)上面，形成了一個(gè)“推-拉”結(jié)構(gòu)的電子共軛體系（D-π-A）。此過程中遷移的負(fù)電荷可來源于分子本身，也可來源于某些反應(yīng)（與分析物之間的相互作用）。在這一基礎(chǔ)上，如果使用提供電子的基團(tuán)進(jìn)行識(shí)別，進(jìn)行識(shí)別的基團(tuán)與分析物結(jié)合后會(huì)增強(qiáng)其提供電子的能力，時(shí)HOMO/LUMO能級(jí)之間的差值變小，在光譜上會(huì)造成引發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)。換言之，如果使用接受電子的基團(tuán)進(jìn)行識(shí)別，其與分析物作用后減弱了其吸電子能力，使HOMO/LUMO能級(jí)之間的差值變大，在光譜上會(huì)造成吸收和發(fā)射波長(zhǎng)向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)。光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用機(jī)制(PET）光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用機(jī)制（PET）指的是經(jīng)由一定波長(zhǎng)的光激發(fā)，利用非共軛連接基團(tuán)將熒光團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)結(jié)合在一起，引發(fā)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致熒光團(tuán)熒光猝滅的機(jī)制。熒光探針的設(shè)計(jì)基于PET機(jī)制的原理，通過選擇合適的熒光團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)，并利用非共軛的基團(tuán)將它們連接在一起，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的特異性識(shí)別和檢測(cè)。當(dāng)目標(biāo)分析物與識(shí)別基團(tuán)結(jié)合時(shí)，PET過程被抑制，熒光恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的可視化檢測(cè)。該機(jī)制的應(yīng)用廣泛，不僅在化學(xué)領(lǐng)域有著重要的地位，還在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用機(jī)制（FRET）具體指的是在與分析物作用前，對(duì)于受體的紫外吸收與供體的發(fā)射來說，幾乎沒有重疊發(fā)生。然而，當(dāng)受體熒光團(tuán)與目標(biāo)分析物相互作用后，受體的紫外吸收會(huì)發(fā)生移動(dòng)，然后與供體的發(fā)射出現(xiàn)重合，形成FRET體系。在設(shè)計(jì)探針時(shí)，我們需考慮以下幾個(gè)因素：首先，給體與受體之間的距離，應(yīng)該控制在10至100埃以內(nèi)；其次，對(duì)于二者的發(fā)射光譜與吸收光譜來說，應(yīng)該出現(xiàn)重疊現(xiàn)象；最后，在給體與受體之間，應(yīng)該以柔性非共軛鍵連接。通過優(yōu)化這些因素，我們可以提高FRET效率，從而實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的生物分子相互作用研究和更靈敏的生物傳感應(yīng)用。在實(shí)際應(yīng)用中，F(xiàn)RET技術(shù)可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物分子之間的相互作用，在藥物篩選、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能研究等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移作用機(jī)制（ESIPT）是在一種在特定波長(zhǎng)激發(fā)下，處于熒光探針分子內(nèi)部的質(zhì)子將從供體基團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體原子，這將導(dǎo)致互變異構(gòu)體過程的發(fā)生。一般而言，面對(duì)具有ESIPT特性的熒光團(tuán)，通常在其結(jié)構(gòu)內(nèi)會(huì)存在著一些氫鍵供體、氫鍵受體以及兩者經(jīng)由分子內(nèi)氫鍵組合而成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)通常很穩(wěn)定。在未作用之前，提供質(zhì)子的識(shí)別體通常不具備質(zhì)子供應(yīng)能力，只有在與特定物質(zhì)相互作用被激發(fā)之后，才能讓被提供的質(zhì)子順利轉(zhuǎn)移到受體上面，從而導(dǎo)致互變異構(gòu)體的形成。這種轉(zhuǎn)變通常會(huì)影響探針的π共軛體系以及電子云密度，導(dǎo)致其發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致其熒光特性發(fā)生改變。與電子轉(zhuǎn)移相比較而言，激發(fā)態(tài)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移速度會(huì)更快，從而有助于降低光化學(xué)發(fā)生反應(yīng)的概率，進(jìn)一步增強(qiáng)探針的光穩(wěn)定性。通常情況下，ESIPT過程對(duì)分子內(nèi)質(zhì)子供體與受體之間的距離會(huì)有所要求，即該距離不能超過0.2納米，并該過程常常伴隨著較大的斯托克斯位移。1.3Hcy熒光探針的發(fā)展現(xiàn)狀目前，Hcy特異性熒光探針的開發(fā)仍是硫醇熒光探針開發(fā)領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)，雖然取得了一些成果，但在位點(diǎn)的普適性、生理水平的選擇性以及反應(yīng)的速率等方面仍然面臨著很大的問題。圖1.2NPO-Pyr探針與Hcy的反應(yīng)機(jī)理ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[23]Figure1.2ProposedmechanismofNPO-PyrfluorescenceprobewithHcyDokyoungKim課題組ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[23]設(shè)計(jì)合成了一種基于二環(huán)庚二烯（NBD）熒光團(tuán)和4-羥基-吡啶的配位加成反應(yīng)的新型Hcy熒光探針（NPO-Pyr）。NPO-Pyr探針通過將4-羥基-吡啶部分摻入NBD熒光團(tuán)骨架中，使摻入的吡啶部分可以與Hcy上的\o"從ScienceDirect的AI生成的主題頁面了解有關(guān)硫醇基團(tuán)的更多信息"硫醇基團(tuán)配位（吡啶-硫醇配位），然后進(jìn)行胺加成反應(yīng)（12kJ/mol）。因?yàn)镠cy分子鏈較Cys（4.17?）更長(zhǎng)（量子化學(xué)優(yōu)化結(jié)構(gòu)中胺和硫醇基團(tuán)之間為5.25?），因此認(rèn)為4-羥基-吡啶（5.01?）對(duì)Hcy具有選擇性，而且Hcy內(nèi)的這種吡啶-硫醇配位可以降低胺加成和氧裂解的過渡態(tài)（TS）能級(jí)?；诖嗽恚琋PO-Pyr對(duì)Hcy做出響應(yīng)，并表現(xiàn)出高選擇性和靈敏度（LOD：0.084ppm）以及快速響應(yīng)時(shí)間（＜5分鐘）的開啟特性。但在利用NPO-Pyr探針針對(duì)Hcy進(jìn)行早期膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）進(jìn)行細(xì)胞形成預(yù)測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)該熒光探針存在波長(zhǎng)較短，生物毒性較大的缺點(diǎn)。這些問題限制了在需要長(zhǎng)時(shí)間、高濃度使用的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域場(chǎng)景中的應(yīng)用。圖1.3硝基香豆素?zé)晒馓结樀慕Y(jié)構(gòu)及反應(yīng)機(jī)理ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Yin</Author><Year>2023</Year><RecNum>47</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[24]</style></DisplayText><record><rec-number>47</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713013165">47</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Yin,G.</author><author>Gan,Y.</author><author>Jiang,H.</author><author>Yu,T.</author><author>Liu,M.</author><author>Zhang,Y.</author><author>Li,H.</author><author>Yin,P.</author><author>Yao,S.</author></authors></contributors><auth-address>KeyLaboratoryofChemicalBiologyandTraditionalChineseMedicineResearch(MinistryofEducation),CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HunanNormalUniversity,Changsha410081,China.</auth-address><titles><title>GeneralStrategyforSpecificFluorescenceImagingofHomocysteineinLivingCellsandInVivo</title><secondary-title>AnalChem</secondary-title><alt-title>Analyticalchemistry</alt-title></titles><periodical><full-title>AnalChem</full-title><abbr-1>Analyticalchemistry</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>AnalChem</full-title><abbr-1>Analyticalchemistry</abbr-1></alt-periodical><pages>8932-8938</pages><volume>95</volume><number>23</number><edition>2023/05/31</edition><keywords><keyword>Humans</keyword><keyword>*DiabetesMellitus,Type2</keyword><keyword>Cysteine/chemistry</keyword><keyword>HeLaCells</keyword><keyword>OpticalImaging</keyword><keyword>FluorescentDyes/chemistry</keyword></keywords><dates><year>2023</year><pub-dates><date>Jun13</date></pub-dates></dates><isbn>0003-2700</isbn><accession-num>37256919</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/acs.analchem.3c00799</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[24]Figure1.3Structureandreactionmechanismoffluorescenceprobecontainingnitrogroup尹鵬課題組結(jié)合之前的工作ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[25,26]，針對(duì)高選擇性的Hcy的檢測(cè)，設(shè)計(jì)了一種構(gòu)建含硝基熒光探針合成的通用策略ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Yin</Author><Year>2023</Year><RecNum>47</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[24]</style></DisplayText><record><rec-number>47</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713013165">47</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Yin,G.</author><author>Gan,Y.</author><author>Jiang,H.</author><author>Yu,T.</author><author>Liu,M.</author><author>Zhang,Y.</author><author>Li,H.</author><author>Yin,P.</author><author>Yao,S.</author></authors></contributors><auth-address>KeyLaboratoryofChemicalBiologyandTraditionalChineseMedicineResearch(MinistryofEducation),CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HunanNormalUniversity,Changsha410081,China.</auth-address><titles><title>GeneralStrategyforSpecificFluorescenceImagingofHomocysteineinLivingCellsandInVivo</title><secondary-title>AnalChem</secondary-title><alt-title>Analyticalchemistry</alt-title></titles><periodical><full-title>AnalChem</full-title><abbr-1>Analyticalchemistry</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>AnalChem</full-title><abbr-1>Analyticalchemistry</abbr-1></alt-periodical><pages>8932-8938</pages><volume>95</volume><number>23</number><edition>2023/05/31</edition><keywords><keyword>Humans</keyword><keyword>*DiabetesMellitus,Type2</keyword><keyword>Cysteine/chemistry</keyword><keyword>HeLaCells</keyword><keyword>OpticalImaging</keyword><keyword>FluorescentDyes/chemistry</keyword></keywords><dates><year>2023</year><pub-dates><date>Jun13</date></pub-dates></dates><isbn>0003-2700</isbn><accession-num>37256919</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/acs.analchem.3c00799</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[24]。而且通過在7-二乙氨基香豆素?zé)晒鈭F(tuán)的6位直接引入一個(gè)硝基結(jié)合雙結(jié)合位點(diǎn)，開發(fā)了一系列熒光探針，能對(duì)Hcy具有熒光開啟響應(yīng)，具有良好的靈敏度、遠(yuǎn)紅/近紅外熒光發(fā)射和快速響應(yīng)能力。還實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞和體內(nèi)內(nèi)源性Hcy動(dòng)力學(xué)的熒光成像。這一技術(shù)為Ⅱ型糖尿病和阿爾茨海默病中內(nèi)源性Hcy的增加提供了直接確鑿的證據(jù)，極大地促進(jìn)對(duì)Hcy代謝級(jí)聯(lián)與Hcy相關(guān)疾病的根本原因之間的聯(lián)系與發(fā)展。然而，盡管這些熒光探針在Hcy檢測(cè)方面取得了顯著成果，但其在生理選擇性方面仍存在不足。這意味著這些探針在復(fù)雜生物樣本中可能無法特異性地識(shí)別Hcy，容易受到其他物質(zhì)的干擾。圖1.4RH-2熒光探針的結(jié)構(gòu)及反應(yīng)機(jī)理ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[27]Figure1.4StructureandreactionmechanismofRH-2fluorescenceprobe孟祥明課題組ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[27]開發(fā)了一種基于咔唑骨架的新型雙光子（TP）熒光探針（RH-2），該探針采用氫鍵輔助策略特異性檢測(cè)Cys和GSH上的Hcy。RH-2能夠在活細(xì)胞和組織中完成對(duì)Hcy的實(shí)時(shí)、特異性成像。目前，科研人員已經(jīng)成功將其應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠中Hcy異常水平的雙光子可視化中，為更深入理解這一疾病的發(fā)病機(jī)制提供了有力支撐。RH-2因其具有的實(shí)時(shí)成像的能力，能夠作為一種高效、方便的成像工具被科研人員使用，為進(jìn)一步探索Hcy在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用提供可能。然而，盡管RH-2探針在Hcy檢測(cè)方面展現(xiàn)出了巨大的潛力，但其反應(yīng)速率過慢的問題仍需解決。圖1.5TCF-SBD與Hcy和Cys反應(yīng)機(jī)理ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Yang</Author><Year>2022</Year><RecNum>49</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[28]</style></DisplayText><record><rec-number>49</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713013445">49</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Yang,Linlin</author><author>Gu,Pengli</author><author>Li,Beining</author><author>Li,Junwan</author><author>Fu,Aoxiang</author><author>Gong,Xianyu</author><author>Huang,Yanmei</author><author>Xie,Lixia</author><author>Ji,Liguo</author><author>Ma,Nana</author><author>Li,Lili</author><author>He,Guangjie</author></authors></contributors><titles><title>Ahomocysteine-selectivefluorescentprobeforcellimagingbasedonsubstitution-rearrangementprocess</title><secondary-title>DyesandPigments</secondary-title></titles><periodical><full-title>DyesandPigments</full-title></periodical><volume>207</volume><section>110802</section><dates><year>2022</year></dates><isbn>01437208</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.dyepig.2022.110802</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[28]Figure1.5ProposedmechanismforthereactionofTCF-SBDwithHcyandCysYang等ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Yang</Author><Year>2022</Year><RecNum>49</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[28]</style></DisplayText><record><rec-number>49</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713013445">49</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Yang,Linlin</author><author>Gu,Pengli</author><author>Li,Beining</author><author>Li,Junwan</author><author>Fu,Aoxiang</author><author>Gong,Xianyu</author><author>Huang,Yanmei</author><author>Xie,Lixia</author><author>Ji,Liguo</author><author>Ma,Nana</author><author>Li,Lili</author><author>He,Guangjie</author></authors></contributors><titles><title>Ahomocysteine-selectivefluorescentprobeforcellimagingbasedonsubstitution-rearrangementprocess</title><secondary-title>DyesandPigments</secondary-title></titles><periodical><full-title>DyesandPigments</full-title></periodical><volume>207</volume><section>110802</section><dates><year>2022</year></dates><isbn>01437208</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.dyepig.2022.110802</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[28]團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種基于三環(huán)喃熒光團(tuán)和SBD反應(yīng)位點(diǎn)，利用取代重排原理構(gòu)成了一種新型熒光探針TCF-SBD。該探針能在存在眾多競(jìng)爭(zhēng)分析物，如氨基酸、活性硫和ROS等存在的環(huán)境中呈現(xiàn)出對(duì)Hcy的高選擇性，尤其在Cys/GSH存在的情況下，該探針依然能夠準(zhǔn)確識(shí)別Hcy，顯示出優(yōu)異的選擇性。值得一提的是，TCF-SBD探針不僅具有高靈敏度，還在實(shí)際應(yīng)用中能夠?qū)崟r(shí)、選擇性地反映活細(xì)胞內(nèi)Hcy的分布情況。目前，該探針已在不同活細(xì)胞的Hcy成像中得到了成功應(yīng)用，為熒光探針在生物硫醇鑒別領(lǐng)域的研究提供了新的視角和工具。但是，盡管TCF-SBD探針在Hcy檢測(cè)方面取得了顯著成果，但仍對(duì)Cys及GSH表現(xiàn)出一定程度的響應(yīng)。圖1.6P-Hcy-1和P-Hcy-2的結(jié)構(gòu)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Lee</Author><Year>2014</Year><RecNum>50</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[29]</style></DisplayText><record><rec-number>50</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2eevw2vsozat2mesawyvsxsl525dwzzf2stp"timestamp="1713013496">50</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Lee,H.Y.</author><author>Choi,Y.P.</author><author>Kim,S.</author><author>Yoon,T.</author><author>Guo,Z.</author><author>Lee,S.</author><author>Swamy,K.M.</author><author>Kim,G.</author><author>Lee,J.Y.</author><author>Shin,I.</author><author>Yoon,J.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofChemistryandNanoScience,EwhaWomansUniversity,Seoul120-750,Korea.jyoon@ewha.ac.kr.</auth-address><titles><title>Selectivehomocysteineturn-onfluorescentprobesandtheirbioimagingapplications</title><secondary-title>ChemCommun(Camb)</secondary-title><alt-title>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</alt-title></titles><periodical><full-title>ChemCommun(Camb)</full-title><abbr-1>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>ChemCommun(Camb)</full-title><abbr-1>Chemicalcommunications(Cambridge,England)</abbr-1></alt-periodical><pages>6967-9