文獻(xiàn)綜述1.1淀粉糖1.1.1淀粉糖簡介淀粉糖是指以淀粉為原料，在酶的催化下，經(jīng)液化、糖化等反應(yīng)所衍生出的一系列單糖或寡糖的統(tǒng)稱REF_Ref29414\r\h[1]。淀粉糖不僅可作為食品食糖的補(bǔ)充直接使用，它還能通過生物發(fā)酵變成糖醇、酒精、有機(jī)酸等多種商品，已成為醫(yī)藥、化工和材料等多個(gè)領(lǐng)域重要的基礎(chǔ)性原料。淀粉糖的生產(chǎn)原料很多，常見的有小麥、木薯、碎米等；在我國玉米具有種植面積廣、產(chǎn)量高、價(jià)格低等優(yōu)勢，是生產(chǎn)淀粉糖產(chǎn)品的首選原料之一REF_Ref29610\r\h[2]?，F(xiàn)目前我國對玉米的深度加工主要采用物理、化學(xué)和發(fā)酵等工藝技術(shù)，與發(fā)達(dá)國家相比仍然比較落后。1.1.2雙酶法制糖工藝淀粉糖的主要生產(chǎn)工藝有酸水解法、單一酶酶解法以及擠壓法等REF_Ref29985\r\h[3]REF_Ref30028\r\h[4]REF_Ref30047\r\h[5]，目前工業(yè)上主要采用雙酶法生產(chǎn)淀粉糖。雙酶法起源于日本，是一種利用淀粉酶和糖化酶水解淀粉使之轉(zhuǎn)化為葡萄糖的新型淀粉糖生產(chǎn)方法REF_Ref30253\r\h[6]REF_Ref30279\r\h[7]。采用雙酶法水解玉米淀粉乳可分為兩階段，首先液化過程中利用淀粉酶的作用得到液化產(chǎn)物；其次糖化過程中利用糖化酶對液化產(chǎn)物進(jìn)行糖化，最終經(jīng)提取純化可得到淀粉糖產(chǎn)品。液化工藝液化是利用α-淀粉酶對糊化的淀粉催化水解成較小的糊精、寡糖和單糖分子等。液化工藝中采用的酶處理通常是一個(gè)連續(xù)的過程，并且整個(gè)過程為保證原料液化充分需不斷攪拌。傳統(tǒng)制糖工藝多選擇20%~30%的淀粉乳作為液化初始濃度，易崔平等人使用濃度為20%的大米淀粉乳制備麥芽糖漿REF_Ref30416\r\h[8]，蔡勇建等人使用濃度為25%的秈米淀粉乳制備葡萄糖REF_Ref30462\r\h[9]，王鎮(zhèn)發(fā)等人使用濃度為30%的木薯淀粉乳制備低聚麥芽糖REF_Ref30517\r\h[10]。DE值可用于衡量淀粉水解程度，一般在淀粉糖行業(yè)內(nèi)，將糖液中的還原糖全部當(dāng)做葡萄糖來計(jì)算REF_Ref30615\r\h[11]REF_Ref30638\r\h[12]。水解液DE值越高，淀粉乳水解程度就越高，葡萄糖漿收率越高；因此可根據(jù)各因素下DE值的相對大小來確定最優(yōu)條件。糖化工藝糖化工藝是向淀粉乳液化后的產(chǎn)物中加入糖化酶，最終生產(chǎn)淀粉糖漿的過程。此工藝中的溫度、時(shí)間、和酶添加量等因素對糖化程度影響至關(guān)重要。張玲等人REF_Ref30766\r\h[13]通過單因素分析實(shí)驗(yàn)，確定了龍眼核淀粉糖化反應(yīng)最佳工藝條件:設(shè)定溫度為65℃，糖化酶添加量180U/g，糖化時(shí)間120min。王穎等人REF_Ref30824\r\h[14]得出陜南豆薯淀粉最佳的糖化工藝參數(shù)為糖化酶添加量200U/g，糖化時(shí)間120min，糖化溫度60℃。蔡文心等人REF_Ref30870\r\h[15]通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出了以玉米、糯米、小米為原料制作的滿族酸茶最佳糖化工藝條件：糖化時(shí)間5h，糖化溫度56℃，糖化酶添加量140U/g。1.2γ-聚谷氨酸1.2.1γ-聚谷氨酸簡介γ-聚谷氨酸（γ-Polyglutamicacid，γ-PGA）是一種天然存在的陰離子多肽，由D-谷氨酸和L-谷氨酸組成，通過α-氨基和γ-羧基基團(tuán)之間的γ-酰胺鍵聚合而成REF_Ref30942\r\h[16]。生物合成的γ-聚谷氨酸通常由500~5000個(gè)谷氨酸單體組成，相對分子量由于單體間聚合度不同，可低至10萬高能達(dá)到200萬，跨度較大REF_Ref30997\r\h[17]。γ-PGA最早于1937年由Ivanovic等REF_Ref31047\r\h[18]在炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)的莢膜中發(fā)現(xiàn)，屬芽孢桿菌莢膜的主要成分；之后，Nagai等REF_Ref31040\r\h[19]又在納豆桿菌(Bacillusnatto)中發(fā)現(xiàn)γ-PGA的存在。γ-PGA結(jié)構(gòu)如圖1.1所示，其主鏈上含有大量游離的親水性羧基，決定其有強(qiáng)大的水溶性；γ-PGA中的肽鍵可在生物分解作用影響下發(fā)生斷裂，能被降解為單體、小分子或是短肽REF_Ref31073\r\h[20]，因此具有可降解性；除此之外，γ-PGA還具有良好的吸附性、生物相容性、無毒無害等優(yōu)良特性，這些優(yōu)良理化性質(zhì)無疑使得γ-PGA成為國內(nèi)外備受關(guān)注的研究對象。 圖1.1γ-PGA的分子結(jié)構(gòu)Fig.1.1Molecularstructureofγ-PGA1.2.2γ-PGA的應(yīng)用γ-PGA作為一種新型的綠色高分子材料，在生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)、食品行業(yè)、化妝品行業(yè)等多領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。在食品行業(yè)中，研究表明，γ-PGA作為一種質(zhì)地增強(qiáng)劑和穩(wěn)定劑，可以提高淀粉、小麥面筋及其制品的質(zhì)量REF_Ref31216\r\h[21]；γ-PGA也是一種冷凍保護(hù)劑，可在冷凍干燥過程中保持益生菌的活力REF_Ref31242\r\h[22]；γ-PGA還可作為氨基酸、肽、奎寧、咖啡因、礦物質(zhì)等物質(zhì)中的苦味掩蔽劑，緩解苦味REF_Ref31265\r\h[23]；此外，對其抗氧化機(jī)制的研究表明，γ-PGA可以保護(hù)胃腸道免受氧化損傷REF_Ref31288\r\h[24]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中，γ-PGA因其所具有水溶性、強(qiáng)保水性、高生物降解性等生物學(xué)特性發(fā)揮著重要作用。例如，γ-PGA可提高水溶性營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增加根系生物量和活性REF_Ref31314\r\h[25]。γ-PGA可外源性應(yīng)用于保護(hù)幼苗免受不良影響REF_Ref31340\r\h[26]。此外，基于生物控制能力和抗菌活性，γ-PGA已被用于非生物或生物抵抗逆境REF_Ref31366\r\h[27]。γ-PGA作為一種生物螯合劑，對緩解農(nóng)作物重金屬和農(nóng)田污染引起的毒性積累極為有益REF_Ref31389\r\h[28]。γ-PGA在藥物制造中也表現(xiàn)出巨大的潛力。γ-PGA是一種天然、無毒、無免疫原性的生物大分子，與其他物質(zhì)聯(lián)合使用時(shí)，可以顯著降低藥物的毒性作用，提高藥物的使用效率REF_Ref31428\r\h[29]。特別是可生物降解的γ-PGA在藥物遞送平臺和作為基因治療的合適載體方面具有潛力REF_Ref31451\r\h[30]。γ-PGA已被用作新的生物粘合劑，通過與其他物質(zhì)化學(xué)交聯(lián)形成REF_Ref31288\r\h[24]。此外，γ-PGA還可作為一種良好的佐劑，誘導(dǎo)疫苗抗原具有更高的免疫原性REF_Ref31517\r\h[31]。1.2.3γ-PGA的生產(chǎn)方式γ-PGA生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、提取法、酶轉(zhuǎn)化法、微生物發(fā)酵法等REF_Ref31860\r\h[32]。其中，微生物發(fā)酵法與其余三種方法相比，具有條件溫和，周期較短，產(chǎn)量高且分子量分布合理等優(yōu)勢，目前該法已經(jīng)成為γ-PGA工業(yè)生產(chǎn)的首選方式。已有研究表明，γ-PGA生產(chǎn)菌株主要為芽孢桿菌屬，例如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等REF_Ref31902\r\h[33]，其中枯草芽孢桿菌是γ-PGA的高潛力微生物來源。γ-PGA生產(chǎn)菌可根據(jù)培養(yǎng)基是否添加谷氨酸分為兩類：谷氨酸依賴型和谷氨酸非依賴型菌株；前者需要添加谷氨酸才能產(chǎn)生γ-PGA，后者無需額外添加谷氨酸即可產(chǎn)生γ-PGAREF_Ref32036\r\h[34]REF_Ref32078\r\h[35]。大多數(shù)γ-PGA生產(chǎn)菌為谷氨酸依賴性菌株，本研究所利用的枯草芽孢桿菌10-2菌株也屬于谷氨酸依賴性菌株。在枯草芽孢桿菌中，γ-PGA合成途徑有兩種，一是內(nèi)源途徑：微生物通過自身合成谷氨酸底物，葡萄糖經(jīng)過糖酵解，生成丙酮酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA）循環(huán)，然后通過α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成谷氨酸，用作合成γ-PGA的底物REF_Ref32111\r\h[36]；二是外源途徑：直接添加谷氨酸。一般直接在培養(yǎng)基中添加谷氨酸鈉，在酶的作用下先轉(zhuǎn)化為Ｄ-谷氨酸和Ｌ-谷氨酸再聚合成γ-PGAREF_Ref32144\r\h[37]。1.3研究目標(biāo)及意義高分子材料的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為現(xiàn)代生活提供了極大的便利，但隨之而來也出現(xiàn)了一系列環(huán)境問題，如用聚苯乙烯、聚氯乙烯等高分子化合物制成的塑料制品難以被降解等。為平衡發(fā)展中‘金山銀山’與‘綠水青山’兩者間的關(guān)系，利用生物技術(shù)合成綠色環(huán)保、應(yīng)用前景良好的高分子物質(zhì)已成為研究人員的首要任務(wù)。而γ-PGA作為一種具備可水溶性、降解性、無毒無害等特殊性質(zhì)的綠色高分子材料，近幾年來越來越備受人們的關(guān)注。毫無疑問γ-PGA在眾多領(lǐng)域的利用價(jià)值是巨大的，但在現(xiàn)有工藝中，高昂的生產(chǎn)成本以及較低的產(chǎn)量極大地限制γ-PGA大規(guī)模應(yīng)用范圍。國內(nèi)外現(xiàn)有研究中，γ-PGA主要通過使用各種芽孢桿菌菌株進(jìn)行微生物發(fā)酵制備，葡萄糖和甘油是最常用的碳源REF_Ref31902\r\h[33]REF_Ref32326\r\h[38]。然而，葡萄糖和甘油價(jià)格相對昂貴，增加了γ-PGA的生產(chǎn)成本，為降低γ-PGA的生產(chǎn)成本，有必要找到一種更經(jīng)濟(jì)的碳源。而玉米作為我國糧食產(chǎn)量第二的農(nóng)作物REF_Ref32353\r\h[39]，較其他谷類和薯類作物來說生產(chǎn)要求低、種植面積大，并且含有大量淀粉糖，無疑為碳源的選擇提供了新思路。為尋找工藝更簡單、成本更低廉的γ-PGA制備方式，本研究將建立一種全新工藝流程，如圖1.2所示。使用生玉米淀粉作為直接原料，經(jīng)液化、糖化過程后，所得到的糖化液作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源；在生產(chǎn)原料上通過省略精制葡萄糖的中間環(huán)節(jié)，從而達(dá)到節(jié)約成本、降低能耗的目標(biāo)。此外本研究還將對工藝過程中的液化、糖化、發(fā)酵過程進(jìn)行單因素優(yōu)化，通過正交試驗(yàn)確定最優(yōu)生產(chǎn)條件，以達(dá)到高效提高γ-PGA產(chǎn)量的目標(biāo)，進(jìn)而為開發(fā)γ-PGA經(jīng)濟(jì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)支持。圖1.2制備γ-PGA工藝流程Fig.1.2Processforpreparingγ-PGA2材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.2.1菌株來源枯草芽孢桿菌（B.subtilis）10-2由實(shí)驗(yàn)室篩選并經(jīng)誘變獲得。2.2.2儀器設(shè)備儀器名稱型號生產(chǎn)廠家電子精密天平AY120日本Shimadzu公司臺式高速離心機(jī)TGL16M貝克曼庫爾特公司可見光分光光度計(jì)UV-2450上海元析儀器有限公司精密pH計(jì)PHS-3C貝爾分析儀器有限公司高壓蒸汽滅菌鍋DSX-280A上海申實(shí)生物科技有限公司恒溫水浴鍋HH-W600河南沃林儀器設(shè)備有限公司生物傳感分析儀ZH10477三諾生物傳感股份有限公司冷凍干燥機(jī)L3-65南京玉衡儀器設(shè)備有限公司恒溫?fù)u床THZ-82A濟(jì)南泰醫(yī)生物技術(shù)有限公司超凈工作臺SW-CJ-IF蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司2.1.3實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家玉米淀粉山東萍聚生物科技有限公司麥芽糊精山東嘉珂生物科技有限公司蔗糖太古糖業(yè)有限公司耐高溫α-淀粉酶廣州華鈺生物科技有限公司糖化酶江蘇采薇生物科技有限公司2.1.4培養(yǎng)基培養(yǎng)基類型成分LB液體培養(yǎng)基酵母粉1g/L蛋白胨5g/LNaCl5g/LddH?OLB固體培養(yǎng)基酵母粉1g/L蛋白胨5g/LNaCl5g/LddH?O發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖97.5g/L酵母粉10g/L谷氨酸鈉50g/L尿素6g/LNH4Cl5g/LK2HPO1.5g/LKH2PO40.5g/LMgSO?0.208g/LCaCl?0.01%2.2工藝路線2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1還原糖的測定采用DNS法：取已配制好不同含量的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.5mL，加入3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑1.5mL，充分混勻后于沸水浴中加熱煮沸5min，冷卻后加4mL去離子水，混勻。在波長540nm處比色，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.0495x-0.0292，相關(guān)系數(shù)R2將樣品液6000r/min離心10min，取上清液稀釋至適宜倍數(shù)待測，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品液中還原糖含量。2.3.2DE值的測定DE值又稱葡萄糖值，指糖液中還原糖含量(以葡萄糖計(jì))占干物質(zhì)的百分率。DE值REF_Ref32513\r\h[40]=還原糖含量干物質(zhì)含量×100%2.3.3總糖的測定采用苯酚-硫酸法REF_Ref32562\r\h[41]：取稀釋適當(dāng)倍數(shù)的發(fā)酵液1.0mL，加入0.5mL6%新制苯酚溶液，搖勻后迅速加入濃硫酸3.5mL，混勻；在90℃水浴鍋中反應(yīng)30min后，取出置于冰水浴中冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=33.343x+0.0336，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997,計(jì)算樣品中總糖含量。2.3.4γ-PGA含量的測定十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶液具有與γ-PGA反應(yīng)產(chǎn)生渾濁的特性，其反應(yīng)體系的濁度可由吸光度反映，通過濁度與γ-PGA濃度的線性關(guān)系可計(jì)算發(fā)酵液中γ-PGA的含量REF_Ref32601\r\h[42]。已有研究表明，γ-PGA與CTAB溶液的最佳反應(yīng)時(shí)間為2min，吸光度最佳檢測波長為430nm，溫度對混合體系的吸光值影響不大REF_Ref32633\r\h[43]，本實(shí)驗(yàn)選擇在25℃下、CTAB濃度為1.5g/L時(shí)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定步驟如下：將復(fù)溶后的樣品稀釋一定倍數(shù)；取100μL稀釋后的復(fù)溶樣品于96孔板中，并加入100μL濃度為1.5g/L的CTAB溶液，25℃，反應(yīng)2min，震蕩5s，在430nm處測定吸光度；依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品液中γ-PGA的含量。2.3.5液化工藝優(yōu)化液化工藝單因素試驗(yàn)以生玉米淀粉為原料，配制濃度為20%的乳漿，pH為6.5，液化溫度分別為60℃、72℃、80℃、85℃、95℃，液化時(shí)間分別為15min、30min、45min、60min、100min，耐高溫α-淀粉酶添加量分別為35U/g、55U/g、75U/g、95U/g，液化結(jié)束，沸水浴10min滅酶活，6000r/min離心取上清液，測定DE值。以DE值為指標(biāo)依次研究液化溫度、液化時(shí)間、耐高溫α-淀粉酶添加量對玉米淀粉乳液化的影響，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。液化工藝正交試驗(yàn)基于單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，使用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以DE值為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)確定最優(yōu)液化2.3.6糖化工藝優(yōu)化糖化工藝單因素試驗(yàn)將選擇最佳液化工藝后的液化液調(diào)pH至6，糖化溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃，糖化時(shí)間分別為15min、25min、38min、46min、51min，糖化酶添加量分別為80U/g、100U/g、120U/g、140U/g，糖化結(jié)束，沸水浴10min滅酶活，10000r/min離心取上清液，測定DE值。以DE值為指標(biāo)依次研究糖化溫度、糖化時(shí)間、糖化酶添加量對玉米淀粉乳糖化的影響，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。糖化工藝正交試驗(yàn)基于單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，使用L9（342.3.7γ-PGA發(fā)酵培養(yǎng)成分優(yōu)化取活化后的枯草芽孢桿菌10-2菌株按4%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，以γ-PGA產(chǎn)量為主要指標(biāo)依次研究不同有機(jī)氮源(酵母粉、黃豆粉、大豆酪蛋白、玉米漿)、糖化液添加量(15ml、20ml、25ml、30ml）、谷氨酸鈉添加量（40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L）對γ-PGA產(chǎn)量的影響，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。2.3.8γ-PGA分子量測定SDS法（1）組裝好制膠的玻璃板后，加滿水靜置15min以檢測是否漏水。在確認(rèn)組裝好的玻璃板不漏水后將水倒掉，并用濾紙將板內(nèi)殘留的水吸干。（2）按照表2.1的配方配制5mL12%的分離膠溶液后，加滿水至玻璃板間并用水加滿密封，靜置40min。（3）將上層水倒出后，按照表2.1的方案配制3mL5%的濃縮膠溶液，將玻璃板內(nèi)的空隙加滿后迅速將梳子插好，靜置50min。（4）輕柔地拔掉已經(jīng)凝固的濃縮膠中的梳子，并用剪裁好的濾紙條吸干點(diǎn)樣孔中的水。（5）將純化后的γ-PGA溶液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后，吸取40μL的純化液加入10μL的5×SDS上樣緩沖液，于沸水中水浴10min。（6）點(diǎn)樣：用微量移液器，取10μL變性后的樣品加入點(diǎn)樣孔中，以及在一個(gè)點(diǎn)樣孔加入5μL的ProteinLadder作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)對照物。（7）電泳：將點(diǎn)好樣的膠置入電泳槽內(nèi)，并倒入電泳緩沖液，電壓調(diào)至80V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)整為120V，直至溴酚藍(lán)遷移至凝膠最底部時(shí)結(jié)束。（8）染色：取出玻璃板內(nèi)部的凝膠，加考馬斯亮藍(lán)R-250染色液至完全覆蓋，置于微波爐中加熱2min。（9）脫色：取出已經(jīng)染色的凝膠，加入足夠量的清水后，置于微波爐打熱10min。反復(fù)進(jìn)行此操作，直至藍(lán)色背景色褪去，此時(shí)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品條帶清晰。（10）復(fù)染：加入阿利新藍(lán)染液直至沒過凝膠后，于室溫下放置20min，此期間不斷震蕩以便更好上色。（11）脫色：加入足夠的脫色液后，置于100rpm的搖床中脫色24h，期間每隔4h更換一次脫色液，此操作直至已染色的背景褪去，樣品條帶完全清晰。（12）觀察：將已經(jīng)脫色的凝膠放置于實(shí)物展示臺上，打開底燈后觀察、拍照。表2.15%SDS凝膠配方Table2.1Theformulaof5%SDS儀器名稱3%濃縮膠5%分離膠ddH2O15.06mL10.4mL30%單體2mL3.32mLTris-HCl（6.8）2.5mL-Tris-HCl（8.8）-5.04mL10%SDS200μL200μL10%過硫酸銨200μL200μLTEMED40μL40μL凝膠色譜-示差-多角度激光光散射法通過SDS對γ-PGA分子量初步測定后，本研究采用凝膠色譜-示差-多角度激光光散射系統(tǒng)來進(jìn)一步測定γ-PGA的分子量。液相系統(tǒng)為U3000（Thermo，USA），示差檢測器為OptilabT-rEX（Wyatttechnology，CA，USA），激光光散射檢測器為DAWNHELEOSⅡ（Wyatttechnology，CA，USA），采用凝膠排阻色譜柱OhpakSB-805HQ（300×8mm）和OhpakSB-803HQ（300×8mm）串聯(lián)。柱溫設(shè)置45℃，進(jìn)樣量100μL，流動(dòng)相A（0.02%NaN3，0.1MNaNO3），流速0.6mL/min，洗脫梯度：等度75min。3結(jié)果與討論3.1玉米淀粉液化工藝的優(yōu)化3.1.1液化溫度對DE值的影響如圖3.1所示，玉米淀粉乳的液化DE值隨著溫度的升高而增加，液化溫度在65℃~72℃時(shí)，DE值增長幅度最大，糊化程度和酶解的效率不斷提升，繼續(xù)升高溫度，DE值的增長趨于相對平緩。由于液化溫度越高液化速度就越快，不利于尋找液化過程中最適宜的DE值REF_Ref25\r\h[44]；同時(shí)作用溫度越高，還原糖越易發(fā)生焦糖化反應(yīng)，造成糖分的損失REF_Ref52\r\h[45]。整體考慮生產(chǎn)的能量消耗以及糖化工藝對液化產(chǎn)物DE值的要求REF_Ref94\r\h[46]REF_Ref123\r\h[47]，液化最佳溫度范圍應(yīng)為72℃-85℃。 圖3.1液化溫度對DE值的影響Fig.3.1EffectofliquefactiontemperatureonDEvalues3.1.2液化時(shí)間對DE值的影響由圖3.2可知，隨著液化時(shí)間的增加，DE值增長；在15min~45min時(shí)DE值增長趨勢較快，45min~60min增長逐漸趨于緩慢。原因是原料玉米淀粉中含有直鏈淀粉與支鏈淀粉，耐高溫α-淀粉酶作為一種內(nèi)切酶，從分子內(nèi)部開始水解淀粉且僅能水解α-1，4糖苷鍵REF_Ref185\r\h[48]。因此在液化初期，耐高溫α-淀粉酶首先快速降解直鏈淀粉，作用于α-1，4糖苷鍵，使之生成寡糖，溶液黏度下降，同時(shí)需跨越α-1，6糖苷鍵繼續(xù)酶解α-1，4糖苷鍵REF_Ref208\r\h[49]，此時(shí)酶促反應(yīng)速度較快；隨著水解程度加深，α-1，6糖苷鍵會(huì)影響水解速度，酶促反應(yīng)速度下降，DE值增長趨于緩慢。液化最佳時(shí)間范圍應(yīng)為30℃-60℃。圖3.2液化時(shí)間對DE值的影響Fig.3.2EffectofliquefactiontimeonDEvalues3.1.3耐高溫α-淀粉酶添加量對DE值的影響由圖3.3可知，當(dāng)耐高溫α-淀粉酶添加量在35U/g～75U/g間，液化進(jìn)程隨酶量增加而加快，DE值顯著增長，并在75U/g達(dá)到最大值16.5%，當(dāng)加酶量超過75U/g后，DE值下降。原因可能是反應(yīng)初期，底物濃度大，增加耐高溫α-淀粉酶添加量可使酶與底物充分結(jié)合，從而使淀粉水解反應(yīng)速度加快，當(dāng)加酶量達(dá)到75U/g，底物與酶結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)，催化效果也達(dá)到飽和，繼續(xù)增加酶的添加量對液化效果提升不大REF_Ref30870\r\h[15]。因此耐高溫α-淀粉酶添加量選擇為55g/L-95g/L。圖3.3耐高溫α-淀粉酶對DE值的影響Fig.3.3Effectofhightemperatureresistantα-amylaseonDEvalues3.1.4液化工藝正交試驗(yàn)結(jié)果分析根據(jù)單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，考察液化溫度、液化時(shí)間、耐高溫α-淀粉酶添加量3個(gè)因素對玉米粉液化程度的影響，選擇合適的水平范圍，以DE值為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)確定最優(yōu)液化條件。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3.1。表3.1液化正交試驗(yàn)結(jié)果Table3.1Liquefactionorthogonalexperimentresults試驗(yàn)號A液化溫度/℃B液化時(shí)間/minC加酶量/(U/g)DE值（%）11(72)1(30)1(55)14.2212(45)2(75)16.8313(60)3(95)14.942(80)1213.7522314.5623110.473(85)1311.9832112.5933212.7k15.30013.26712.367k12.86714.60014.400k12.36712.66713.767R2.9331.9332.033由表3.1可知，液化工藝條件對于液化程度的影響主次順序液化溫度＞耐高溫α-淀粉酶量＞液化時(shí)間，最優(yōu)液化工藝條件組合為A1B2C2，即液化溫度72℃、液化時(shí)間45min、耐高溫α-淀粉酶添加量量75U/g。在此最佳液化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，液化液DE值為16.8%。3.2玉米淀粉糖化工藝的優(yōu)化3.2.1糖化溫度對DE值的影響由圖3.4所示，當(dāng)糖化溫度為60℃時(shí)，DE值出現(xiàn)最高峰達(dá)到81.92%，與最佳液化工藝條件下的DE值16.8%相比，提高了4.88倍。當(dāng)繼續(xù)升高溫度，DE值顯著下降，猜測糖化酶最適溫度在60℃左右。李保軍REF_Ref339\r\h[50]研究發(fā)現(xiàn)，糖化酶在40~70℃的溫度范圍內(nèi)均有活力，在40~65℃有較高的活力，而65℃以上活力較低；為避免高溫糖化酶蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，水解反應(yīng)被抑制REF_Ref362\r\h[51]，因此選取糖化溫度為50℃～70℃較為適宜。圖3.4糖化溫度對DE值的影響Fig.3.4EffectofglycationtemperatureonDEvalues3.2.2糖化時(shí)間對DE值的影響由圖3.5可知，在糖化時(shí)間25h之前，糖化液DE值隨著時(shí)間的推移小幅度提高；在糖化時(shí)間15h～25h時(shí)，DE值顯著增加，并在38h達(dá)到最大值82.15%，與最佳液化工藝條件下的DE值16.8%相比，提高了4.89倍；38h后，隨著糖化時(shí)間的增加DE值出現(xiàn)緩慢下降的趨勢。整體考慮提高設(shè)備利用率和節(jié)約時(shí)間，糖化時(shí)間最佳范圍為25h～46h。圖3.5糖化時(shí)間對DE值的影響Fig.3.5EffectofglycationtimeonDEvalues3.2.3糖化酶添加量對DE值的影響由圖3.6所示，DE值在糖化酶添加量為80U/g~100U/g間顯著升高，并于100U/g時(shí)達(dá)到82.38%，與最佳液化工藝條件下的還原糖含量16.8%相比，提高了4.9倍。因?yàn)榍捌诘孜餄舛容^高，酶能與底物結(jié)合較充分，水解反應(yīng)隨著酶濃度增加而加快，酶催化效果好；當(dāng)超過100U/g時(shí)，由于底物已大部分被水解，糖化程度下降，DE值趨于平衡。綜合考慮成本和糖化酶解效果，糖化酶添加100U/g~140U/g較適宜。圖3.6糖化酶對DE值的影響Fig.3.6EffectofglycosylaseonDEvalues3.2.4糖化工藝正交試驗(yàn)結(jié)果分析根據(jù)單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，考察糖化溫度、糖化時(shí)間、糖化酶酶添加量、3個(gè)因素對玉米粉糖化程度的影響，選擇合適的水平范圍，以DE值為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)確定最優(yōu)糖化條件。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3.2。表3.2糖化正交試驗(yàn)結(jié)果Table3.1Resultsoftheglycationorthogonaltest試驗(yàn)號A糖化溫度/℃B糖化時(shí)間/hC加酶量/(U/g)DE值（%）11(50)1(25)1(100)72.3212(38)2(120)74.6313(46)3(140)69.242(60)1274.5522384.6623181.473(70)1366.9832176.3933273.7k72.03371.23376.667k80.16778.50074.267k72.30074.76773.567R8.1347.2673.100由表3.2可知，糖化工藝條件對于糖化程度的影響主次順序?yàn)樘腔瘻囟龋咎腔瘯r(shí)間＞糖化酶添加量，最優(yōu)糖化工藝條件組合為A2B2C1，即糖化溫度60℃、糖化時(shí)間38h、糖化酶添加量100U/g。在此最佳糖化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，糖化液DE值為85.4%，比液化正交所得DE值提高了5.08倍3.3γ-PGA發(fā)酵培養(yǎng)成分的優(yōu)化3.3.1不同糖化液的添加量對γ-PGA產(chǎn)量的影響碳源是微生物用來構(gòu)建菌體和代謝產(chǎn)物碳骨架以及為生命體提供能量的碳素營養(yǎng)REF_Ref669\r\h[52]，本研究使用糖化液充當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。在總量為30ml的培養(yǎng)液中分別添加15ml、20ml、25ml、30ml糖化液進(jìn)行發(fā)酵，測定γ-PGA產(chǎn)量以及殘?zhí)橇俊Ｓ蓤D3.7可知，當(dāng)糖化液的添加量為15ml時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)量為22.38g/L，殘?zhí)橇繛?.31mg/L；當(dāng)糖化液的添加量為20ml，此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)量為22.81g/L，殘?zhí)橇繛?0.94mg/L；此后再添加糖化液，糖含量過剩未能充分利用，發(fā)酵產(chǎn)量逐漸下降。綜合考慮用料成本以及發(fā)酵產(chǎn)量，最優(yōu)糖化液添加量應(yīng)為15ml。圖3.7糖化液的添加量對γ-PGA的影響Fig.3.7Effectoftheamountofglycationsolutionaddedonγ-PGA3.3.2不同有機(jī)N源對γ-PGA產(chǎn)量的影響氮源對生物體的生長和目標(biāo)物的積累有重要的影響，一方面是生物體酶、結(jié)構(gòu)蛋白等的最重要來源；另一方面可以作為代謝的前體物質(zhì)，直接參與次級代謝REF_Ref737\r\h[53]。研究表明使用有機(jī)氮源發(fā)酵后的γ-PGA平均產(chǎn)量高于無機(jī)氮源，其原因可能是有機(jī)氮源除了為菌體提供必要的氮元素之外，還提供很多必需的生長因子REF_Ref767\r\h[54]。如圖3.8所示，不同有機(jī)氮源對枯草芽孢桿菌（B.subtilis）10-2菌發(fā)酵產(chǎn)量有較顯著的影響，4種有機(jī)氮源對于γ-PGA產(chǎn)量影響先后順序?yàn)榻湍阜郏军S豆粉＞大豆酪蛋白＞玉米漿。添加酵母粉時(shí)產(chǎn)酸量最高可達(dá)35.71g/L，均高于其它氮源。不同的菌株所需氮源不同，ZhinanXu等選取胰蛋白胨作為B.subtilisZJU-7發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的氮源REF_Ref826\r\h[55]；曹旭等選取玉米粉作為B.subtilisZJU-7發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA氮源REF_Ref897\r\h[56]，于本研究而言酵母粉為枯草芽孢桿菌（B.subtilis）10-2菌發(fā)酵最適有機(jī)氮源。圖3.8有機(jī)氮源對γ-PGA的影響Fig.3.8Effectoforganicnitrogensourcesonγ-PGA3.3.3不同谷氨酸添加量對γ-PGA產(chǎn)量的影響谷氨酸的添加量是關(guān)系γ-PGA是否能夠高效發(fā)酵的重要因素之一，以谷氨酸初始添加量分別為40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L進(jìn)行批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵條件按照γ-PGA發(fā)酵配方要求、發(fā)酵工藝參數(shù)控制要求進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵產(chǎn)量以及谷氨酸鈉消耗量。由圖3.9可知，谷氨酸消耗量各組無顯著差異，總體呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)谷氨酸鈉添加量為60g/L時(shí)，谷氨酸消耗量下降，谷氨酸出現(xiàn)過剩現(xiàn)象。γ-PGA產(chǎn)量在谷氨酸添加量為55g/L時(shí)，最高達(dá)到45.33g/L，當(dāng)繼續(xù)提高谷氨酸濃度，γ-PGA產(chǎn)量下降，說明兩者之間并不是存在著簡單的線性關(guān)系。這也表明過高濃度的谷氨酸前體物質(zhì)可能會(huì)抑制γ-PGA的合成。其原因可能是谷氨酸在結(jié)構(gòu)上與γ-PGA類似，谷氨酸濃度過高對γ-PGA合成酶系產(chǎn)生了反饋?zhàn)瓒?，從而抑制了?PGA的生物合成REF_Ref995\r\h[57]。綜上分析，依據(jù)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性原則，確定谷氨酸的最優(yōu)添加量為55g/L.圖3.9谷氨酸添加量對γ-PGA的影響Fig3.9Effectofsodiumglutamateadditiononγ-PGA3.4γ-PGA分子量測定用SDS凝膠電泳技術(shù)測定純化后γ-PGA的分子量大小結(jié)果如圖3.10a所示，其中泳道M為Marker，泳道1和2分別為5g/L和1g/L的γ-PGA，根據(jù)樣品與蛋白Marker的軌道比對，可確定枯草芽孢桿菌10-2發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA分子量大于130kDa。隨后經(jīng)由GPC–MALLS（上海三黍生物科技有限公司）測定，γ-PGA的分子量分布分析如圖3.10b和3.10c所示。γ-聚谷氨酸的重均分子量（Mw）為4,862kDa，數(shù)均分子量（Mn）1,508kDa，分子量范圍為800-2500kDa，多分散性（Mw/Mn）為3.224，分子量分布較寬。conformationplotslope為0.20，說明在本實(shí)驗(yàn)條件下，γ-PGA的分子為棒狀。圖3.10γ-PGA分子量測定Fig.3.6Molecularweightdeterminationofγ-PGASDS法（M,Marker；泳道1，5g/Lγ-PGA；泳道2，1g/Lγ-PGA）.（b）分子構(gòu)型分析圖.（c）γ-PGA絕對分子量分析圖.4結(jié)論與展望本研究以實(shí)驗(yàn)室自主篩選并經(jīng)誘變的枯草芽孢桿菌（B.subtilis）10-2為出發(fā)菌株，成功建立了以生玉米淀粉為直接原料，經(jīng)過液化處理及分步糖化發(fā)酵發(fā)酵制備γ-PGA的新工藝。在對液化、糖化和發(fā)酵工藝中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化后，確定了最佳工藝條件。在最優(yōu)液化條件下：液化溫度72℃、耐高溫α-淀粉酶添加量75U/g和液化時(shí)間45min，實(shí)現(xiàn)了液化液DE值（葡萄糖當(dāng)量）為16.8%。隨后，通過控制糖化溫度為60℃，糖化時(shí)間為38小時(shí)，以及糖化酶添加量為100U/g，糖化液DE值顯著提高至85.4%，較液化DE值提升了5.08倍。這一結(jié)果表明，優(yōu)化后的糖化過程顯著提高了淀粉向可發(fā)酵糖的轉(zhuǎn)化效率。基于最佳液化、糖化條件下所得的糖化液作為培養(yǎng)基中的碳源，采用酵母粉作為有機(jī)氮源，控制糖化液添加量為15ml，并加入谷氨酸55g/L，最終γ-聚谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到了45.33g/L，γ-聚谷氨酸的重均分子量（Mw）為4,862kDa，數(shù)均分子量（Mn）1,508kDa，分子量范圍為800-2500kDa，呈棒狀。這一結(jié)果不僅證明了所采用的發(fā)酵策略的有效性，而且與優(yōu)化前的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量相比，產(chǎn)量提高了2.67倍，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量的顯著增加。超過了國內(nèi)已報(bào)道納豆芽孢桿菌（Bacillusnatto）NE-5.2-RE、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)LDJJ11經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化所產(chǎn)最高產(chǎn)量，分別為38.94g/L和37.048g/LREF_Ref1113\r\h[58]REF_Ref1195\r\h[59]。綜上所述，本研究開發(fā)的液化處理和分步糖化發(fā)酵工藝，顯著提高了γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)效率，并為其在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。該工藝的成功實(shí)施預(yù)示著未來可以低成本、高效率地生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，有望推動(dòng)聚谷氨酸在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。目前，國內(nèi)外γ-PGA液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量普遍不高。最主要的原因在于：發(fā)酵原料成本高、菌株產(chǎn)能低；其次隨著發(fā)酵液中γ-PGA濃度增加，發(fā)酵液粘度顯著上升，由于發(fā)酵液黏度高而難以有效通氧和分離提純目標(biāo)產(chǎn)物REF_Ref737\r\h[53]，這大大制約γ-PGA發(fā)酵生產(chǎn)能力的提升。因此，為了更好地應(yīng)對不同的社會(huì)需求，提高γ-PGA產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本等都將是今后γ-PGA研究的重要課題方向。在后續(xù)研究中，本實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)在此基礎(chǔ)上，以γ-PGA產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化分析后，在發(fā)酵罐進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA。通過改變發(fā)酵罐的通氣量、溶氧量、罐壓等，有望使產(chǎn)量進(jìn)一步提升，以為實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中提供更加節(jié)能降耗的技術(shù)參考。參考文獻(xiàn)：佟毅.中國玉米淀粉與淀粉糖工業(yè)技術(shù)發(fā)展歷程與展望[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2019,45(17):5.李娜.玉米淀粉糖生產(chǎn)工藝改進(jìn)研究[D].齊魯工業(yè)大學(xué),2014.高新,陳啟杰,趙雅蘭,等.酶預(yù)處理和酸水解制備糯玉米淀粉納米晶及其表征[J].中國糧油學(xué)報(bào),2021,36(5):6.劉淑英,劉育博,齊俊.小米淀粉水解和改性技術(shù)的研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2023,36(1):1-4.何東,付昱東,段慶松,等.玉米淀粉制備中擠壓聯(lián)用亞硫酸浸泡預(yù)處理工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2021,42(14):8.Feng,Wang,and,etal.RegulationofCCRintheγ-CGTaseproductionfromBacillusmacorousbythespecificcellgrowthratecontrolScienceDirect[J].EnzymeandMicrobialTechnology,2006,39(6):1279-1285.SaglioP.Theresponseofplantstooxygendeprivation.Roleofenzymeinductionintheimprovementoftolerancetoanoxia[J].PlantResponsestoenvironmentalStresses,fromPhytohormonestoGenomeReorganization,1999.易翠平,蔡吉祥,劉瑞興.大米淀粉制備麥芽糖漿的工藝研究[J].食品科學(xué),2010,31(24):24-27.蔡勇建,吳偉,林親錄,等.秈米淀粉酶法制備葡萄糖液化工藝研究[J].糧食與油脂,2014,27(1):3.王鎮(zhèn)發(fā),李夏蘭,陳培欽.響應(yīng)面法優(yōu)化木薯淀粉制備低聚異麥芽糖工藝[J].中國糧油學(xué)報(bào),2013.熊漢國,張家年,譚軍,魏學(xué)鋒,張先炳.葛根淀粉的酶法水解及其水解產(chǎn)物的流變學(xué)特性研究[J].食品科學(xué),2002,23(2):4.蔣守群,蔣宗勇.大豆異黃酮在畜牧上的研究與應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2007.張玲,陳淇,高偉芳等.龍眼核淀粉的液化及糖化工藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā),2024,45(01):115-122.王穎,何強(qiáng),陳文強(qiáng),等.陜南豆薯淀粉漿液液化和糖化的工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(13):4.蔡文心,韓建春,劉丹怡等.響應(yīng)面法優(yōu)化滿族酸茶液化及糖化工藝[J].食品工業(yè)科技,2019,40(23):163-171.ShaY,SunT,QiuY,etal.InvestigationofGlutamateDependenceMechanismforPoly-γ-glutamicAcidProductioninBacillussubtilisontheBasisofTranscriptomeAnalysis[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry,2019,67(22):6263-6274.王衛(wèi)國,王衛(wèi),趙永亮,etal.γ-聚谷氨酸的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2016,37(2):7.IVANOVICSG,ERDOSL.Einbeitragzumwesenderkaspelsubstanzdesmilzbrandbazillus[J].ZImmuntatsforsch,1937,90:5-19.ToshirouN,KumikoK,YoshifumiI.Chemicalanalysisofpoly-gamma-glutamicacidproducedbyplasmid-freeBacillussubtilis(natto):Evidencethatplasmidsarenotinvolvedinpoly-gamma-glutamicacidproduction.[J].JournalofGeneral&AppliedMicrobiology,1997,43(3):139.BeraA,DubeyS,BhayaniK,etal.Microbialsynthesisofpolyhydroxyalkanoateusingseaweed-derivedcrudelevulinicacidasco-nutrient[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2015,72:487-494.XieX,WuX,ShenY,etal.Effectofpoly‐γ‐glutamicacidonhydrationandstructureofwheatgluten[J].JournalofFoodScience,2020,85.SiaterlisA,DeepikaG,CharalampopoulosD.Effectofculturemediumandcryoprotectantsonthegrowthandsurvivalofprobioticlactobacilliduringfreezedrying[J].LettersinAppliedMicrobiology,2010,48(3):295-301.FengJ,GuY,QuanY,etal.Improvedpoly-γ-glutamicacidproductioninBacillusamyloliquefaciensbymodularpathwayengineering.[J].MetabolicEngineering,2015.LeeJM,JangWJ,ParkSH,etal.Antioxidantandgastrointestinalcytoprotectiveeffectofediblepolypeptidepoly-γ-glutamicacid[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2020,153(1).YinA,JiaY,QiuT,etal.Poly-γ-glutamicacidimprovesthedroughtresistanceofmaizeseedlingsbyadjustingthesoilmoistureandmicrobialcommunitystructure[J].AppliedSoilEcology,2018:S0929139318302324.WangQ,ChenS,ZhangJ,etal.Co-producinglipopeptidesandpoly-γ-glutamicacidbysolid-statefermentationofBacillussubtilisusingsoybeanandsweetpotatoresiduesanditsbiocontrolandfertilizersynergisticeffects[J].BioresourTechnol,2008,99(8):3318-3323.WooseongL,MinwooK,Seung-HoonL,etal.ProphylacticefficacyoforallyadministeredBacilluspoly-γ-glutamicacid,anon-LPSTLR4ligand,againstnorovirusinfectioninmice[J].ScientificReports,2018,8(1):8667.XuZ,LeiP,PangX,etal.Exogenousapplicationofpoly--glutamicacidenhancesstressdefenseinBrassicanapusL.seedlingsbyinducingcross-talksbetweenCa2+,H2O2,brassinolide,andjasmonicacidinleaves[J].PlantPhysiology&Biochemistry,2017,118:460-470.LuoZ,GuoY,LiuJ,etal.Microbialsynthesisofpoly-[gamma]-glutamicacid:currentprogress,challenges,andfutureperspectives[J].2016.ZhanY,ShengB,WangH,etal.Rewiringglycerolmetabolismforenhancedproductionofpoly-γ-glutamicacidinBacilluslicheniformis[J].BiotechnologyforBiofuels,2018,11(1).NguyenQT,KwakC,LeeWS,etal.Poly-γ-GlutamicAcidComplexedWithAlumInducesCross-ProtectiveImmunityofPandemicH1N1Vaccine.[J].FrontiersMediaSA,2019.TamangJP,Dong-HwaS,Su-JinJ,etal.FunctionalPropertiesofMicroorganismsinFermentedFoods[J].FrontiersinMicrobiology,2016,7:578-.SirisansaneeyakulS,CaoM,KongklomN,etal.Microbialproductionofpoly-γ-glutamicacid[J].WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology,2017,33(9):173.BajajI,SinghalR.Poly(glutamicacid)-Anemergingbiopolymerofcommercialinterest[J].BIORESOURCETECHNOLOGY,2011.李文婧,趙祥穎,田延軍,等.γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010(3):5.BuescherJM,MargaritisA.MicrobialBiosynthesisofPolyglutamicAcidBiopolymerandApplicationsintheBiopharmaceutical,BiomedicalandFo