酶制劑的生產(chǎn)TheproductionofEnzyme中心法則-CentralDogmaRNA的生物合成-Transcription蛋白質(zhì)的生物合成-Translation酶生物合成的調(diào)節(jié)-RegulationGoGoGoGo1.1酶生物合成調(diào)節(jié)的基本理論Reversetranscription中心法則-CentralDogmaABEX底物水平的調(diào)節(jié)酶水平的調(diào)節(jié)

酶活性的調(diào)節(jié)酶含量的調(diào)節(jié)酶的定位調(diào)節(jié)輔助因子調(diào)節(jié)產(chǎn)物調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酶的調(diào)控模式酶生物合成的調(diào)節(jié)(regulation)酶含量的調(diào)節(jié)--基因水平的表達(dá)控制

操縱子——基因表達(dá)的協(xié)同單位操縱子結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì),structuralgene,S）控制部位操縱基因（operatorgene,O）啟動(dòng)子（promotorgene,P）JacobandMonod的操縱子學(xué)說（operontheory）

酶生物合成的調(diào)節(jié)----基因調(diào)控理論

基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖

調(diào)節(jié)基因

啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因

DNA

轉(zhuǎn)錄

（-）

RNA聚合酶（+）轉(zhuǎn)錄

翻譯

mRNA

翻譯

阻遏蛋白

蛋白質(zhì)

誘導(dǎo)劑

控制區(qū)信息區(qū)操縱子乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物trp色氨酸操縱子（酶的阻遏）

----------阻遏物和操縱基因的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因關(guān)閉啟動(dòng)子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（無活性）基因表達(dá)mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)

B、乳糖酶的誘導(dǎo)

乳糖

阻遏蛋白（有活性）誘導(dǎo)酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動(dòng)基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因

阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物分解代謝物阻遏現(xiàn)象：

實(shí)驗(yàn)：

“二次生長(zhǎng)現(xiàn)象”(diauxie或biphasicgrowth）。葡萄糖效應(yīng)環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）降解物基因活化蛋白（CAP）分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達(dá)CAP基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)細(xì)菌乳糖操縱子的作用機(jī)制(降解物阻遏)調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子操縱基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP復(fù)合物mRNA+過去稱葡萄糖效應(yīng)1.2酶的生產(chǎn)方法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學(xué)合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……

organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn)?從自然界分離的菌種產(chǎn)品基因工程誘變育種誘變育種生產(chǎn)用菌種擴(kuò)大培養(yǎng)原料微生物菌體代謝產(chǎn)物分離提純發(fā)酵罐發(fā)酵條件控制接種培養(yǎng)基配置滅菌2.微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)2.1生產(chǎn)菌2.2酶制劑生產(chǎn)工藝流程2.3發(fā)酵條件2.4發(fā)酵方法2.5發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備概要2.6酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)2.1生產(chǎn)菌

2.1.1優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的條件（1）酶產(chǎn)量高（2）易培養(yǎng)（生長(zhǎng)速率高、營(yíng)養(yǎng)要求低）（3）遺傳性能穩(wěn)定，不易退化（4）易分離提純（5）安全可靠（不是致病菌）EscherichiacoliPseudomonasBacillussubtilisMicrococcusStreptococcusStreptomycesAspergillusnigerAspergillusoryzaeMonascusPenicilliumTrichodermaRhizopusMucorAbsidia

SaccharomycescerevisiaeCandida2.1.2常見產(chǎn)酶微生物(1)大腸桿菌，是最為著名的原核生物。(2)醋酸桿菌（Acetobacter）

2.1.2常見產(chǎn)酶微生物(3)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）

(4)放線菌(5)根霉(Rhizopus)(6)曲霉(Aspergillus)

2.1.3產(chǎn)酶微生物的分離和篩選

1)樣品的采集:從富含該酶作用底物的場(chǎng)所采集樣品

2)富集培養(yǎng):投其所好，取其所抗

3)分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pureculture）。

4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。

5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對(duì)較高的菌株，以質(zhì)為主。生產(chǎn)菌的改良⑴基因突變⑵基因轉(zhuǎn)移⑶基因克隆應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基2.1.4菌種活化與擴(kuò)大培養(yǎng)在制種時(shí)必須注意事項(xiàng)：⑴傳代次數(shù)⑵種子培養(yǎng)基⑶種子培養(yǎng)時(shí)間影響種子質(zhì)量的因素及其控制措施2.2微生物酶制劑生產(chǎn)工藝流程

保藏細(xì)胞細(xì)胞活化發(fā)酵原生質(zhì)體細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)固定化細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)無菌空氣培養(yǎng)基固定化分離純化酶酶發(fā)酵生產(chǎn)的工藝流程保藏菌種

菌種活化

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

發(fā)酵

分離純化

酶酶的發(fā)酵生產(chǎn)要求①性能優(yōu)良菌種（產(chǎn)率，穩(wěn)定性，發(fā)酵周期，營(yíng)養(yǎng)要求，副產(chǎn)物，安全性）②滿足菌種生長(zhǎng)需求；③滿足菌種產(chǎn)酶需求。2.3酶的發(fā)酵工藝條件與控制Thefermentationprinciplesanditscontrolofenzymeproduction2.3.1培養(yǎng)基2.3.2發(fā)酵條件及控制2.3.3提高產(chǎn)酶的措施GoGoGo2.3.1培養(yǎng)基（medium）各種生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求五大要素：碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原則？常用碳源：糖類、醇類、脂類、有機(jī)酸、烴類、蛋白質(zhì)及其降解物異養(yǎng)微生物：糖類是最好碳源（葡萄糖最為通用）水碳源選擇合適碳源，以適應(yīng)目的酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制氮源有機(jī)氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏無機(jī)氮源銨鹽、硝酸鹽常用：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元素的化合物。氮源無機(jī)鹽需要注意合適的碳氮比生長(zhǎng)因子（C/N）：培養(yǎng)其中碳元素（C）的總量與氮元素（N）的總量之比。根據(jù)微生物的需要量，分為主要元素和微量元素酶的誘導(dǎo)劑和其它促進(jìn)劑

實(shí)驗(yàn)室的常用培養(yǎng)基：細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡(jiǎn)稱普通肉湯培養(yǎng)基）；放線菌：高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌：查氏合成培養(yǎng)基；例如枯草芽孢桿菌：一般培養(yǎng)：肉湯培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基；自然轉(zhuǎn)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；觀察芽孢：生孢子培養(yǎng)基；產(chǎn)蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培養(yǎng)基；枯草桿菌BF7658α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉8%，豆餅粉4%，磷酸氫二鈉

0.8%，硫酸銨0.4%，氯化鈣0.2%，氯化按0.15%（自然pH）?？莶輻U菌AS1.398中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉4%，豆餅粉3%，麩皮3.2%,

糠1%,磷酸氫二鈉0.4%,磷酸二氫鉀0.03%（自然pH）。黑曲霉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10%，豆餅粉4%，麩皮1%（pH4.4～5.0）。地衣芽孢桿菌2709堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5.5%,豆餅4%,磷酸氫二鈉0.4%,磷酸二氫鉀0.03%(pH8.5)。黑曲霉AS3.350酸性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉6%,豆餅粉4%,玉米漿0.6%,氯化鈣0.5%,氯化銨1%,磷酸氫二鈉0.2%(pH5.5)。游動(dòng)放線菌葡萄糖異構(gòu)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜2%，豆餅粉2%，磷酸氫二鈉0。1%，硫酸鎂0。05%(pH7.2)。桔青霉磷酸二酯酶發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,硫酸鎂0.05%,氯化鈣0.04%,磷酸氫二鈉0.05%,磷酸二氫鉀0.05%(自然pH)。黑曲霉AS3.396果膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮5%,果膠0.3%,硫酸銨2%,磷酸二氫鉀0.25%,硫酸鎂0.05%,硝酸鈉0.02%,硫酸亞鐵0.001%(自然pH)?？莶輻U菌AS1.398堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸銨1%,氯化鉀0.1%,氯化鈣0.1mmol/L,氯化鎂1.0mmol/L,磷酸氫二鈉20mol/L(用pH7.4的Tris-HCl緩沖液配制)⑴pH值的控制pH控制①初級(jí)調(diào)節(jié)控制（起始培養(yǎng)基）調(diào)整C/N，調(diào)整生理酸性物質(zhì)與生理堿性物質(zhì)之比。②補(bǔ)料調(diào)節(jié)：流加酸/堿，初加碳、氮源③溶解氧調(diào)節(jié)：控制代謝中間產(chǎn)物的氧化程度。生長(zhǎng)繁殖最適與pH產(chǎn)酶最適pH發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH的變化由菌種的特性、培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件等決定。2.3.2發(fā)酵條件及控制枯草桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為34～37℃黑曲霉的最適生長(zhǎng)溫度為28～32℃最適生長(zhǎng)溫度與最適產(chǎn)酶溫度⑵溫度的控制⑵溫度的控制控制溫度方式：夾套，盤管例：用枯草芽胞桿菌AS1.3398生產(chǎn)中性蛋白酶溫度控制發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵單位

變溫0-4h30-30℃4-8h32-40℃(2℃/h↑)26.5h7100u/ml8-12h40-32℃(2℃/h↓)12h后30-32℃恒溫30-32℃27h4275u/ml⑶溶解氧的控制調(diào)節(jié)通氣量調(diào)節(jié)氧的分壓調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間調(diào)節(jié)氣液接觸面積改變培養(yǎng)液的性質(zhì)控制溶解氧方法概念：耗氧速率細(xì)胞呼吸強(qiáng)度細(xì)胞濃度溶氧速率⑷泡沫

酶制劑發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫較多，產(chǎn)生原因：強(qiáng)烈的通氣攪拌和培養(yǎng)基中天然蛋白質(zhì)原料含量較高。造成危害？采取措施？

⑸濕度

固體發(fā)酵法：控制培養(yǎng)基的濕度和發(fā)酵室空氣中的相對(duì)濕度。

⑹發(fā)酵過程的中間補(bǔ)料補(bǔ)料方案：①補(bǔ)糖(碳源)②補(bǔ)氮源③補(bǔ)無機(jī)鹽和產(chǎn)酶促進(jìn)劑④補(bǔ)全料和補(bǔ)水。2.3.3提高酶產(chǎn)量的措施（一）菌種選育（一勞永逸）

1.誘變育種

(1)使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型——選育組成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜瓦x育營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株解除反饋?zhàn)瓒暨x育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏——選育抗分解代謝阻遏突變株

2.基因工程育種

（二）條件控制1.添加誘導(dǎo)物酶的底物類似物最有效。2.降低阻遏物濃度

除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑避免使用葡萄糖分解代謝物阻遏避免培養(yǎng)基過于豐富添加一定量的cAMP3.添加表面活性劑

離子型對(duì)細(xì)胞有毒害作用表面活性劑Tween－80

非離子型增加細(xì)胞通透性

TritonX－1004.添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑2.4發(fā)酵方法2.4.1液體發(fā)酵

產(chǎn)酶菌種，以需氧或兼性需氧的居多。為更好地控制生長(zhǎng)條件，采用合成培養(yǎng)基,并在發(fā)酵罐內(nèi)安裝攪拌設(shè)備，進(jìn)行通氣培養(yǎng)，是目前酶制劑生產(chǎn)的主要培養(yǎng)方式。優(yōu)點(diǎn)：①產(chǎn)酶純度高，質(zhì)量穩(wěn)定；②較易控制發(fā)酵條件，有利于自動(dòng)化控制；③機(jī)械化程度高，勞動(dòng)強(qiáng)度?。辉O(shè)備利用率高。缺點(diǎn)：設(shè)備投資較大。

2.4.2固態(tài)發(fā)酵

定義：又稱曲法培養(yǎng)。固態(tài)發(fā)酵是微生物在固態(tài)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和代謝的一種發(fā)酵方式。固態(tài)發(fā)酵根據(jù)設(shè)備和通氣方法不同，又分為淺盤法、轉(zhuǎn)鼓法和厚層通氣法三種。固態(tài)發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)：①設(shè)備簡(jiǎn)單，投資較少。②環(huán)境污染少；③特別適用于霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶。缺點(diǎn):①勞動(dòng)強(qiáng)度大；②原料利用率低；③產(chǎn)酶純度較差；提取精制較難；④傳質(zhì)傳熱效率低，發(fā)酵條件不易控制均勻，產(chǎn)酶不穩(wěn)定；⑤不宜胞內(nèi)酶生產(chǎn)2.4.3分批發(fā)酵分批發(fā)酵是指在一封閉培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)具有初始限制量基質(zhì)的一種發(fā)酵方式。分批培養(yǎng)細(xì)胞的五個(gè)生長(zhǎng)階段：2.4.4連續(xù)發(fā)酵

把新鮮的培養(yǎng)基連續(xù)地供給均勻混合的發(fā)酵系統(tǒng)，同時(shí)又以相同的速度把含有細(xì)胞和產(chǎn)物的發(fā)酵液從發(fā)酵系統(tǒng)中抽出便可使發(fā)酵過程連續(xù)化優(yōu)點(diǎn)：1）補(bǔ)料分批培養(yǎng)能維持低基質(zhì)濃度；2）可以提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量，節(jié)省發(fā)酵罐的非生產(chǎn)時(shí)間。3）便于自動(dòng)控制。發(fā)酵罐內(nèi)微生物、基質(zhì)、產(chǎn)物和溶解氧濃度等各參數(shù)維持在一定水平，易于控制。連續(xù)培養(yǎng)過程中的主要問題雜菌污染問題生產(chǎn)菌株突變問題2.4.5補(bǔ)料分批發(fā)酵

補(bǔ)料分批發(fā)酵也叫半連續(xù)發(fā)酵、半連續(xù)培養(yǎng)，流加發(fā)酵（fed-batchfermentation），它是以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的一種發(fā)酵方法。補(bǔ)料分批發(fā)酵與傳統(tǒng)分批發(fā)酵相比，其優(yōu)點(diǎn)在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度。補(bǔ)料分批發(fā)酵的特點(diǎn)-------低基質(zhì)濃度的優(yōu)點(diǎn)：①可以除去快速利用碳源的阻遏效應(yīng)，并維持適當(dāng)?shù)木w濃度，使不致于加劇供氧矛盾②避免在培養(yǎng)基中積累有毒代謝物，即代謝阻遏。③不需要嚴(yán)格的無菌條件，也不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問題。2．5酶制劑生產(chǎn)設(shè)備微生物選育設(shè)備無菌空氣制備設(shè)備－－離心式空壓機(jī)、往復(fù)式空壓機(jī)電加熱高溫滅菌、Bio-X過濾器發(fā)酵設(shè)備－－液體發(fā)酵設(shè)備、固體發(fā)酵設(shè)備提取設(shè)備－－固液分離設(shè)備、濃縮設(shè)備、除菌設(shè)備、干燥設(shè)備、造粒干燥設(shè)備發(fā)酵罐示意圖電動(dòng)機(jī)pH檢測(cè)及控制裝置培養(yǎng)液無菌空氣排氣口冷卻水出口冷卻水進(jìn)口攪拌器加料口放料口2．5發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備概要2．5．1發(fā)酵罐標(biāo)準(zhǔn)型發(fā)酵罐，是廣泛采用的培養(yǎng)好氣微生物的攪拌通氣發(fā)酵罐。

大型發(fā)酵罐攪拌裝置

H/D=1.7~4d/D=1/2~1/3W/D=1/8~1/12B/D=0.8~1.0(s/d)2=1.5~2.5(s/d)3=1~2標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵罐的幾何尺寸自吸式充氣發(fā)酵罐帶升式充氣發(fā)酵罐2．5．2固態(tài)發(fā)酵設(shè)備較為簡(jiǎn)單，無需嚴(yán)格的空氣滅菌設(shè)備，也不需液體循環(huán)裝置。關(guān)鍵是控溫、控濕以至固態(tài)曲塊翻動(dòng)的自動(dòng)化，以減輕勞動(dòng)強(qiáng)度。發(fā)酵方式有淺盤式、轉(zhuǎn)鼓式、厚層通風(fēng)式幾種。轉(zhuǎn)鼓式培養(yǎng)罐厚層通風(fēng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)軸式固態(tài)發(fā)酵罐

固態(tài)發(fā)酵飼用酶制劑的工藝流程

轉(zhuǎn)軸式固態(tài)發(fā)酵罐

1.在位滅菌與冷卻

2.溫、濕度控制3.在位接種

4.動(dòng)力驅(qū)動(dòng)5.空氣無菌調(diào)節(jié)系統(tǒng)2．5．3．酶液分離設(shè)備⑴過濾設(shè)備主要有加壓過濾設(shè)備、真空過濾設(shè)備和離心式過濾設(shè)備。加壓過濾設(shè)備，用得最多的是板框壓濾機(jī)。⑵離心機(jī)工業(yè)用離心機(jī)主要有沉降式離心機(jī)和離心過濾機(jī)兩類。沉降式離心機(jī)又有管式和碟式兩種；離心過濾機(jī)有多種機(jī)型，可以是連續(xù)式、自動(dòng)間歇式和分批操作式等。碟式離心機(jī)廣泛用于分離乳膠體或含少量固體物的乳膠體。轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm,通常在5000rpm左右離心容量較大。管式離心機(jī)轉(zhuǎn)速可達(dá)15000—50000rpm，容量有限，生產(chǎn)能力小。Alfalava公司的保留固體式離心澄清機(jī)的碟片式轉(zhuǎn)鼓分批自動(dòng)排出沉渣的離心澄清機(jī)自動(dòng)排出沉渣的離心澄清機(jī)

2.5.4干燥設(shè)備噴霧干燥:主要設(shè)備包括干燥室、空氣加熱器、噴霧器、干燥成品收集器。

箱式干燥器

氣流干燥器2.6酶生產(chǎn)過程的動(dòng)力學(xué)2.6.1酶生物合成的模式2.6.2酶生產(chǎn)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)2.6.3酶生產(chǎn)過程中產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)GoGoGo2.6.1酶生物合成的模式細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)過程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長(zhǎng)期、平衡期和衰退期等4個(gè)階段酶生物合成的模式

根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為3種模式，即：同步合成型生長(zhǎng)偶聯(lián)型——

中期合成型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型——延續(xù)合成型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型——

滯后合成型⑴同步合成型（又稱生長(zhǎng)偶聯(lián)型）酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步。特點(diǎn)：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對(duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml⑵生長(zhǎng)偶聯(lián)型中的特殊形式——中期合成型

酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點(diǎn)：酶的合成受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。

枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線

⑶部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型）

酶的合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長(zhǎng)一段時(shí)間。特點(diǎn)：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導(dǎo)物以含有葡萄糖的果膠為誘導(dǎo)物黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線⑷非生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱滯后合成型）

只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點(diǎn)：受分解代謝物的阻遏作用。所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素高：可在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后繼

1）mRNA的穩(wěn)定性續(xù)合成酶差：隨著細(xì)胞停止生長(zhǎng)而終止酶的合成2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開始酶的合成。受阻遏：細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或平衡期后，酶才開始合成。目的：提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期最理想的合成模式：延續(xù)合成型策略措施：①菌種選育：提高mRNA的穩(wěn)定性，解除分解代謝物阻遏和反饋?zhàn)瓒?。②發(fā)酵代謝調(diào)節(jié)：理想誘導(dǎo)物的添加，解除反饋?zhàn)瓒艉头纸獯x物阻遏（難利用的碳氮源的使用，補(bǔ)料發(fā)酵）。③降低產(chǎn)酶溫度。模型的簡(jiǎn)化均衡生長(zhǎng)模型主要簡(jiǎn)化的內(nèi)容細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)行為的描述，不考慮細(xì)胞之間的差別。把菌體視為單組分，細(xì)胞內(nèi)各種成分均以相同的比例增加。2.6.2酶生產(chǎn)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)比生長(zhǎng)速率若細(xì)胞物質(zhì)或細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)一倍的時(shí)間間隔是常數(shù)，則微生物是以指數(shù)速率增長(zhǎng)，可用數(shù)學(xué)模型來描述。①

②

在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比

若μ為常數(shù)，則：

對(duì)式①積分得：

此式可在△t=td（td為倍增時(shí)間）時(shí)求得，td即在時(shí)所需時(shí)間，于是td=ln2/μ=0.693/μ。

為比生長(zhǎng)速率，單位是h-1。

例題：某微生物的＝0.125h-1，求td。比生長(zhǎng)速率的意義

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，是一個(gè)常數(shù)，這時(shí)

營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）和生長(zhǎng)速率之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系：Monod模型μ:比生長(zhǎng)速率(1/h)(specificgrowthrate)μmax：最大比生長(zhǎng)速率（1/h）S：營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）g/LKs：莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營(yíng)養(yǎng)物利用常數(shù)g/L，或mol/L無抑制的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)——Monod方程2.6.3產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)一般產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可表達(dá)為：式中X——細(xì)胞濃度(g/L)

——細(xì)胞比生長(zhǎng)速率(h-1)

——生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g)

——非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(gh))E——酶濃度(IU/L)t——時(shí)間(h)生長(zhǎng)偶聯(lián)型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型

非生長(zhǎng)偶聯(lián)型

3.動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)3.1動(dòng)植物細(xì)胞的特性微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞的主要特性差異細(xì)胞種類植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞大小/um200～3001～1010～100倍增時(shí)間/h﹥120.3-6﹥15營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜光照要求大多數(shù)要求不要求不要求對(duì)剪切力敏感大多數(shù)不敏感非常敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等三者之間的差異主要有：植物細(xì)胞>動(dòng)物細(xì)胞>微生物細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長(zhǎng)。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求較簡(jiǎn)單。植物細(xì)胞的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。3.2植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

3.2.1植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)

3.2.2培養(yǎng)基特點(diǎn)應(yīng)用最廣的是MS培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基是1962年由Murashinge和Skoog為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。LS培養(yǎng)基是在其基礎(chǔ)上演變而來的。3.2.3培養(yǎng)方法：——懸浮細(xì)胞培養(yǎng)①細(xì)胞株的建立；外植體與愈傷組織②擴(kuò)大培養(yǎng)；③大罐培養(yǎng)；外植體：從植株取出，經(jīng)過預(yù)處理后，用于植物組織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等）的片段或小塊。愈傷組織：將上述外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25℃左右培養(yǎng)一段時(shí)間，從外植體的切口部位長(zhǎng)出小細(xì)胞團(tuán)。水稻的外植體（幼胚）和愈傷組織外植體愈傷組織3.2.4培養(yǎng)條件的影響與控制（1）溫度（2）pH（3）通氣與攪拌（4）光照的控制（5）前體的添加（飼喂）（6）誘導(dǎo)子（elicitors）的應(yīng)用3.2.5植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實(shí)例以大蒜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（SOD）為例(1)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)選取結(jié)實(shí)、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后無菌水漂洗3次。在無菌條件下，切成0.5cm3的小塊，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的半固體MS培養(yǎng)基中，在25℃，600lux，12h/d光照條件下培養(yǎng)18d，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每18天繼代一次。(2)大蒜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

將上述在半固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d的愈傷組織，在無菌條件下轉(zhuǎn)入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA（芐基腺嘌呤）的液體MS培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)18d，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液體MS培養(yǎng)基中，25℃,600lux，12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)18d。(3)酶的分離純化細(xì)胞培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。3.3動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

3.3.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢。（需添加抗生素）細(xì)胞體積大，無細(xì)胞壁保護(hù)，對(duì)剪切力敏感。反應(yīng)過程成本高，產(chǎn)品價(jià)格貴。細(xì)胞具有錨地依賴性。原代細(xì)胞一般繁殖50代。3.3.2培養(yǎng)基

①天然培養(yǎng)基②合成培養(yǎng)基③無血清培養(yǎng)基3.3.3培養(yǎng)方法

(1)懸浮培養(yǎng)(suspensionculture)(2)貼壁培養(yǎng)(anchorage-dependentculture)(3)貼壁－懸浮培養(yǎng)(pseudo-suspensionculture)

微載體培養(yǎng)(microcarrierculture)

包埋(entrapment)和微囊(microencapsulation)培養(yǎng)結(jié)團(tuán)培養(yǎng)(aggregateculture)3.3.4培養(yǎng)條件的影響與控制（1）溫度：一般控制在36.5℃.（2）pH值：一般控制在7.0-7.6的微堿性范圍內(nèi)。（3）滲透壓:應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)滲透壓相同。（4）溶解氧：根據(jù)情況隨時(shí)調(diào)節(jié)。4.酶制劑概述4.1酶制劑的定義及分類4.2酶的保存與酶制劑的生產(chǎn)技術(shù)4.3液體酶制劑4.4固體酶制劑酶制劑的分類①?gòu)男螒B(tài)上分類液體酶制劑包括稀酶液與濃縮酶液；比較經(jīng)濟(jì)，但不穩(wěn)定，且成分復(fù)雜；只適于就近的某些工業(yè)部門如紡織工業(yè)等直接應(yīng)用。固體酶制劑經(jīng)濃