GST下拉試驗(yàn)方法總結(jié)與應(yīng)用摘要GST（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）下拉試驗(yàn)是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-小分子互作的經(jīng)典體外技術(shù)，通過GST融合誘餌蛋白與谷胱甘肽親和樹脂的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)互作靶標(biāo)的捕獲與鑒定。本文系統(tǒng)總結(jié)GST下拉試驗(yàn)的原理、標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程及優(yōu)化策略，結(jié)合其在信號(hào)通路解析、藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域的應(yīng)用案例，為科研工作者提供從方法建立到結(jié)果解讀的實(shí)用指南，助力提升分子互作研究的效率與準(zhǔn)確性。一、引言在生命科學(xué)研究中，蛋白質(zhì)間的相互作用是信號(hào)傳導(dǎo)、代謝調(diào)控、疾病發(fā)生等過程的核心分子基礎(chǔ)。GST下拉試驗(yàn)憑借操作簡(jiǎn)便、特異性高、可模擬體外生理環(huán)境的優(yōu)勢(shì)，成為驗(yàn)證直接互作、篩選未知結(jié)合蛋白的關(guān)鍵技術(shù)。與免疫共沉淀（CoIP）依賴內(nèi)源蛋白豐度不同，GST下拉通過重組表達(dá)的誘餌蛋白主動(dòng)捕獲靶標(biāo)，更適合研究低豐度蛋白或體外調(diào)控的互作過程，在基礎(chǔ)科研與藥物研發(fā)中廣泛應(yīng)用。二、方法原理GST下拉的核心基于GST標(biāo)簽與谷胱甘肽（GSH）的高親和力非共價(jià)結(jié)合：將目的蛋白（誘餌）與GST融合表達(dá)后，利用谷胱甘肽包被的固相載體（如瓊脂糖樹脂）特異性吸附GST-誘餌蛋白；當(dāng)誘餌蛋白與樣品（如細(xì)胞裂解液、體外翻譯產(chǎn)物）孵育時(shí)，與其相互作用的靶蛋白會(huì)隨誘餌蛋白一同被樹脂捕獲；經(jīng)洗滌去除非特異性結(jié)合后，通過洗脫、檢測(cè)（如WesternBlot、質(zhì)譜）即可鑒定或驗(yàn)證互作關(guān)系。三、實(shí)驗(yàn)流程與關(guān)鍵步驟（一）誘餌蛋白的構(gòu)建與表達(dá)1.載體構(gòu)建：選擇含GST標(biāo)簽的表達(dá)載體（如pGEX系列），將誘餌蛋白的編碼序列克隆至GST下游的多克隆位點(diǎn)，確保閱讀框正確。若誘餌蛋白分子量過大或疏水性強(qiáng)，可在GST與誘餌蛋白間插入柔性linker（如GSGSGS），減少空間位阻對(duì)互作的影響。2.表達(dá)系統(tǒng)選擇：原核表達(dá)：常用*E.coli*BL21(DE3)，誘導(dǎo)溫度（16~37℃）、IPTG濃度（0.1~1mM）需根據(jù)蛋白可溶性優(yōu)化（低溫誘導(dǎo)可提升可溶性）。真核表達(dá)：若蛋白需翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化），可采用昆蟲細(xì)胞（桿狀病毒系統(tǒng)）或哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如HEK293T）表達(dá)，需注意標(biāo)簽降解風(fēng)險(xiǎn)（可添加蛋白酶抑制劑）。3.蛋白純化：誘導(dǎo)后收集菌體/細(xì)胞，超聲破碎后離心取上清，與谷胱甘肽樹脂孵育（4℃，1~2h），洗滌后用還原型谷胱甘肽（5~10mM）洗脫，獲得GST-誘餌蛋白。（二）樹脂與樣品的準(zhǔn)備1.樹脂平衡：谷胱甘肽瓊脂糖樹脂（如GSTrapFF）使用前需用結(jié)合緩沖液（含10~150mMNaCl、1~5mMDTT、0.1%NP-40，pH7.4~8.0）洗滌3次，去除保存液（如20%乙醇），避免影響蛋白活性。2.樣品處理：細(xì)胞裂解液：用含蛋白酶/磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液（如RIPA或NP-40緩沖液）冰上裂解細(xì)胞，離心（12,000g，10min）取上清，蛋白濃度建議≥1mg/mL。體外翻譯產(chǎn)物：若研究蛋白-蛋白互作，可通過體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)（如TNT系統(tǒng)）合成靶蛋白，直接用于孵育。（三）孵育、洗滌與洗脫1.孵育：將純化的GST-誘餌蛋白（或空載GST作為對(duì)照）與樹脂室溫孵育1h（或4℃過夜），使誘餌蛋白充分結(jié)合樹脂；棄上清后，加入樣品（細(xì)胞裂解液或體外翻譯產(chǎn)物），4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育2~4h（延長(zhǎng)時(shí)間可提升弱互作的捕獲效率）。2.洗滌：用結(jié)合緩沖液洗滌樹脂5~6次（每次1mL，1,000g離心1min），重點(diǎn)去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。若非特異性條帶過多，可提高緩沖液中NaCl濃度（至500mM）或添加0.5%NP-40，但需注意高鹽/去污劑可能破壞弱互作。3.洗脫：用含5~10mM還原型谷胱甘肽的洗脫緩沖液（pH8.0）室溫孵育樹脂15~30min，離心收集洗脫液，即為含誘餌蛋白與靶蛋白的復(fù)合物。（四）檢測(cè)與驗(yàn)證1.WesternBlot：將洗脫液進(jìn)行SDS分離，轉(zhuǎn)膜后用靶蛋白的特異性抗體檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置GST空載對(duì)照（排除非特異性結(jié)合）。2.質(zhì)譜鑒定：若篩選未知互作蛋白，可將洗脫液進(jìn)行SDS后切膠，經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行LC-MS/MS分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定靶蛋白。3.功能驗(yàn)證：對(duì)候選互作蛋白，可通過CoIP、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）或酵母雙雜交等技術(shù)交叉驗(yàn)證，確?；プ鞯恼鎸?shí)性。四、優(yōu)化策略：解決常見技術(shù)難題（一）誘餌蛋白的可溶性問題若GST-誘餌蛋白以包涵體形式表達(dá)，可嘗試：低溫誘導(dǎo)（如16℃）或降低IPTG濃度（0.1mM）；表達(dá)時(shí)添加分子伴侶（如GroEL/GroES）或促溶標(biāo)簽（如MBP、Trx）；純化后通過透析或凝膠過濾復(fù)性（需根據(jù)蛋白特性優(yōu)化緩沖液）。（二）非特異性結(jié)合的干擾非特異性條帶通常源于雜蛋白與樹脂或誘餌蛋白的非特異性結(jié)合，可通過以下方式優(yōu)化：洗滌緩沖液中添加1%脫脂牛奶或0.5%BSA（封閉非特異性位點(diǎn)）；孵育時(shí)加入過量的非特異性競(jìng)爭(zhēng)蛋白（如無關(guān)GST融合蛋白）；調(diào)整緩沖液pH（如pH7.0~8.5）或離子強(qiáng)度，削弱非特異性相互作用。（三）弱互作的捕獲效率若靶蛋白與誘餌蛋白的互作較弱，可：延長(zhǎng)孵育時(shí)間（如4℃過夜）或增加樣品量；優(yōu)化緩沖液成分，如添加1~5mMMg2?、Mn2?（維持蛋白構(gòu)象）或10%甘油（穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)）；采用交聯(lián)劑（如DSP）在孵育后交聯(lián)蛋白，防止洗脫時(shí)解離（需注意交聯(lián)劑對(duì)后續(xù)檢測(cè)的影響）。五、應(yīng)用領(lǐng)域：從基礎(chǔ)研究到藥物研發(fā)（一）驗(yàn)證已知蛋白互作在信號(hào)通路研究中，GST下拉常與CoIP聯(lián)用：例如驗(yàn)證MAPK通路中激酶（如MEK）與底物（如ERK）的直接結(jié)合，通過GST-MEK下拉體外翻譯的ERK，結(jié)合WB檢測(cè)，明確互作的直接性（CoIP可能受內(nèi)源復(fù)合物干擾）。（二）篩選未知結(jié)合蛋白以疾病相關(guān)蛋白為誘餌（如腫瘤抑制蛋白p53），從細(xì)胞裂解液中釣取結(jié)合蛋白，結(jié)合質(zhì)譜鑒定新的互作因子。例如，通過GST-p53下拉發(fā)現(xiàn)其與代謝酶的互作，揭示p53在代謝重編程中的新功能。（三）解析蛋白結(jié)構(gòu)域的互作通過構(gòu)建誘餌蛋白的截短體（如刪除特定結(jié)構(gòu)域的GST融合蛋白），利用GST下拉鑒定靶蛋白的結(jié)合區(qū)域。例如，研究轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域與共激活因子的互作，通過截短實(shí)驗(yàn)明確關(guān)鍵結(jié)合基序。（四）藥物靶點(diǎn)與小分子篩選將靶點(diǎn)蛋白（如激酶）與GST融合，固定于樹脂上，用于篩選能結(jié)合靶點(diǎn)的小分子化合物或多肽。例如，從天然產(chǎn)物庫(kù)中篩選可抑制激酶-底物互作的小分子，為藥物研發(fā)提供先導(dǎo)化合物。六、常見問題與解決方案問題類型可能原因解決方案誘餌蛋白不表達(dá)載體構(gòu)建錯(cuò)誤、密碼子偏好重新測(cè)序驗(yàn)證載體，使用密碼子優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)洗脫液無靶蛋白互作弱、樣品處理不當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間，優(yōu)化緩沖液成分非特異性條帶過多樹脂封閉不足、洗滌不充分增加封閉劑，提高洗滌次數(shù)/強(qiáng)度靶蛋白降解蛋白酶污染、洗脫條件劇烈添加蛋白酶抑制劑，優(yōu)化洗脫緩沖液pH七、總結(jié)與展望GST下拉試驗(yàn)作為分子互作研究的“經(jīng)典工具”，以其操作靈活、成本低廉、可體外調(diào)控的優(yōu)勢(shì)，在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)解析、藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。盡管體外環(huán)境與體內(nèi)存在差異（如缺乏翻譯后修飾的動(dòng)態(tài)調(diào)控），但結(jié)合CRISPR介導(dǎo)的內(nèi)源蛋白標(biāo)記、單分子熒光技術(shù)等新方法，GST下