2025年生物技術(shù)專升本實(shí)踐操作試卷（含答案）考試時(shí)間：______分鐘總分：______分姓名：______一、簡(jiǎn)述高壓蒸汽滅菌的原理、關(guān)鍵參數(shù)（溫度、壓力、時(shí)間）及其對(duì)微生物（細(xì)菌、病毒、芽孢）的殺滅效果。說(shuō)明使用高壓滅菌鍋時(shí)需要注意的安全事項(xiàng)。二、配制1000mLpH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS），濃度為0.01mol/L。已知Tris-HCl(分子量157.19g/mol)的pKa為8.1，HCl為強(qiáng)酸。請(qǐng)列出所需試劑（Tris-HCl、HCl、NaCl、Na?HPO?·12H?O或NaH?PO?·2H?O）的名稱、所需質(zhì)量（或體積）及計(jì)算過(guò)程。假設(shè)所需Tris-HCl和NaCl固體均為分析純，配制時(shí)需使用去離子水。三、在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)前，需要對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行預(yù)熱。請(qǐng)簡(jiǎn)述PCR預(yù)熱的原理和目的。若實(shí)驗(yàn)要求在95℃預(yù)熱3分鐘，應(yīng)如何設(shè)置PCR儀的循環(huán)參數(shù)？請(qǐng)寫出至少兩步的循環(huán)設(shè)置。四、某同學(xué)在進(jìn)行蛋白電泳實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)電泳結(jié)束后，凝膠上的蛋白條帶模糊不清，背景有拖尾現(xiàn)象。請(qǐng)分析可能的原因，并提出至少三種改進(jìn)措施。五、將一株革蘭氏陰性菌接種于含有特定抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過(guò)夜后觀察平板。請(qǐng)簡(jiǎn)述革蘭氏染色的基本步驟（至少包括脫色和復(fù)染環(huán)節(jié)），并解釋為什么該染色技術(shù)有助于區(qū)分該細(xì)菌是革蘭氏陽(yáng)性還是革蘭氏陰性。如果在平板上觀察到典型的大而彌散的菌落，這通常意味著什么？六、細(xì)胞培養(yǎng)是生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。請(qǐng)簡(jiǎn)述在超凈工作臺(tái)中接種細(xì)胞的基本操作步驟和關(guān)鍵注意事項(xiàng)（至少列出三項(xiàng)）。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，為什么需要維持無(wú)菌環(huán)境？請(qǐng)列舉至少兩種可能造成細(xì)胞污染的途徑。七、某研究項(xiàng)目需要將外源基因?qū)氪竽c桿菌中進(jìn)行表達(dá)。請(qǐng)簡(jiǎn)述基因工程中常用的兩種將外源DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法的原理，并比較它們的優(yōu)缺點(diǎn)。八、在生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的儀器設(shè)備。請(qǐng)分別說(shuō)明在以下情況下，應(yīng)選擇使用什么類型的儀器設(shè)備，并簡(jiǎn)要說(shuō)明其用途：1.需要精確測(cè)量微量液體體積。2.需要觀察細(xì)胞或微生物的微觀結(jié)構(gòu)。3.需要分離和純化混合物中的目標(biāo)組分（如DNA、蛋白質(zhì)）。4.需要定量檢測(cè)溶液中特定物質(zhì)的濃度（如核酸、蛋白質(zhì)、酶活性）。九、處理實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的廢棄物時(shí)，必須遵守相關(guān)安全規(guī)范。請(qǐng)列舉至少三種不同類型的實(shí)驗(yàn)廢棄物，并說(shuō)明它們應(yīng)該分別如何進(jìn)行分類和處理。為什么必須嚴(yán)格區(qū)分化學(xué)廢棄物和生物廢棄物？十、設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方案，以探究不同濃度的某種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（如赤霉素）對(duì)植物種子萌發(fā)率的影響。請(qǐng)包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、主要材料與試劑、實(shí)驗(yàn)步驟、預(yù)期結(jié)果及簡(jiǎn)要的分析說(shuō)明。在設(shè)置對(duì)照組時(shí)，應(yīng)考慮哪些因素？試卷答案一、高壓蒸汽滅菌利用高溫高壓水蒸氣的強(qiáng)大殺菌能力，使微生物的蛋白質(zhì)變性凝固、細(xì)胞壁破裂，從而達(dá)到滅菌目的。關(guān)鍵參數(shù)通常為121℃（1.05kg/cm2壓力）、15-20分鐘，此條件下可殺滅細(xì)菌、病毒，但對(duì)芽孢效果較差需更長(zhǎng)時(shí)間或更高溫度。安全事項(xiàng)包括：滅菌前檢查鍋內(nèi)有無(wú)積水；關(guān)門前確保蓋好鍋蓋并鎖緊；避免超載；運(yùn)行時(shí)避免強(qiáng)行開(kāi)蓋；取出熱物品時(shí)使用長(zhǎng)柄夾；定期檢查維護(hù)。二、所需試劑及計(jì)算：稱取Tris-HCl1.21g，NaCl0.85g，溶解于約800mL去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.4（可用HCl或NaOH，需精確測(cè)量），最后定容至1000mL。計(jì)算過(guò)程：所需Tris-HCl摩爾數(shù)=0.01mol/L*1L*157.19g/mol/157.19g/mol=0.01mol，質(zhì)量=0.01mol*157.19g/mol=1.5719g(約1.21g)。所需NaCl摩爾數(shù)=0.01mol/L*1L*58.45g/mol/58.45g/mol=0.01mol，質(zhì)量=0.01mol*58.45g/mol=0.5845g(約0.85g)。(注：pH調(diào)節(jié)過(guò)程略，實(shí)際配制需精確操作和測(cè)量)。三、PCR預(yù)熱是為了使反應(yīng)體系中的酶（如Taq酶）和模板DNA、引物等充分變性，達(dá)到后續(xù)PCR擴(kuò)增所需的反應(yīng)溫度。預(yù)熱通常在95℃進(jìn)行3分鐘，使模板DNA雙鏈解旋為單鏈。循環(huán)參數(shù)設(shè)置示例：第一步，95℃，3分鐘；第二步，循環(huán)35次，95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后，72℃延伸5分鐘，4℃保存。四、蛋白條帶模糊、拖尾可能原因：電壓或電流過(guò)高導(dǎo)致溫度過(guò)高；電泳緩沖液pH不當(dāng)；凝膠濃度不合適或制備不佳；樣品中鹽分過(guò)高；蛋白樣品處理不當(dāng)（如未充分變性或還原）；電泳槽內(nèi)有氣泡。改進(jìn)措施：降低電壓或電流；選擇合適的緩沖液pH；優(yōu)化凝膠濃度或改進(jìn)制備方法；對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)電泳去除鹽分；確保樣品充分變性并加還原劑；排除電泳槽氣泡；使用預(yù)染或后染marker。五、革蘭氏染色步驟：初染（結(jié)晶紫染色）；媒染（碘液）；脫色（95%乙醇或丙酮）；復(fù)染（沙弗寧或堿性復(fù)紅）。革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁厚，含大量肽聚糖，能保留初染劑結(jié)晶紫，呈紫色；陰性菌細(xì)胞壁薄，肽聚糖層少，外有脂質(zhì)膜，脫色后易著色劑（沙弗寧）染色，呈紅色或粉色。觀察到典型的大而彌散的菌落，通常意味著該細(xì)菌在該選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，并且具有對(duì)該培養(yǎng)基中抗生素的抗性。六、超凈工作臺(tái)接種步驟：開(kāi)啟紫外燈照射30分鐘以上消毒工作臺(tái)面；關(guān)閉紫外燈，開(kāi)啟通風(fēng)，調(diào)節(jié)工作臺(tái)至所需級(jí)別；用酒精燈火焰燒灼接種環(huán)等無(wú)菌工具至紅熱并冷卻；左手持皿/瓶，右手持工具，在靠近工作臺(tái)出口處打開(kāi)；將菌種接入培養(yǎng)基，動(dòng)作迅速準(zhǔn)確，盡量靠近工作臺(tái)中心區(qū)域；操作完畢后，立即蓋好皿/瓶，燒灼工具，關(guān)閉工作臺(tái)，清潔臺(tái)面。關(guān)鍵注意事項(xiàng)：保持工作臺(tái)面清潔；盡量減少人員走動(dòng)和談話；操作時(shí)身體與工作臺(tái)保持一定距離；避免頭手越過(guò)工作臺(tái)上方；操作前后進(jìn)行手消毒和工具滅菌。維持無(wú)菌環(huán)境是為了防止雜菌污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。污染途徑：空氣中的微生物沉降；操作人員的手或衣物帶菌；未滅菌或滅菌不徹底的工具、培養(yǎng)基；相鄰操作臺(tái)或環(huán)境的交叉污染。七、方法一：熱激法（電穿孔法）。原理：利用短暫的高壓電脈沖使細(xì)胞膜/壁瞬間形成可透性孔道，外源DNA分子進(jìn)入細(xì)胞后孔道迅速關(guān)閉。優(yōu)點(diǎn)：效率高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單快速；缺點(diǎn)：電脈沖可能對(duì)細(xì)胞造成損傷，重復(fù)性操作可能影響細(xì)胞活力。方法二：化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl?法）。原理：在低溫CaCl?存在下，細(xì)胞壁變得通透，吸收Ca2?后與DNA結(jié)合形成復(fù)合物，置于冰上使細(xì)胞膜脂質(zhì)層暫破，加入預(yù)熱LB培養(yǎng)基（42℃）時(shí)，Ca2?和DNA復(fù)合物被吸入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞膜恢復(fù)穩(wěn)定。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞損傷相對(duì)較小，成本較低；缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率通常低于熱激法，操作步驟較多。八、1.精確測(cè)量微量液體體積：移液器（可精確到0.1μL或1μL）。2.觀察細(xì)胞或微生物的微觀結(jié)構(gòu)：光學(xué)顯微鏡（觀察細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)）或電子顯微鏡（觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、病毒等）。3.分離和純化混合物中的目標(biāo)組分（如DNA、蛋白質(zhì)）：電泳（分離核酸、蛋白質(zhì)）、層析（如凝膠過(guò)濾、離子交換、親和層析，分離純化蛋白質(zhì)、核酸等）。4.定量檢測(cè)溶液中特定物質(zhì)的濃度（如核酸、蛋白質(zhì)、酶活性）：分光光度計(jì)（測(cè)定核酸、蛋白質(zhì)濃度）、酶標(biāo)儀（測(cè)定酶活性等吸光度變化）、高效液相色譜（HPLC，分離和定量分析化合物）。九、廢棄物類型及處理：1.化學(xué)廢棄物：分類收集，如酸堿廢液分開(kāi)，有機(jī)溶劑廢液分開(kāi)，劇毒品廢液專門處理，禁止隨意混合。按實(shí)驗(yàn)室規(guī)定進(jìn)行中和、焚燒或交由有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)處理。2.生物廢棄物：含病原微生物的培養(yǎng)基、培養(yǎng)物、實(shí)驗(yàn)器械等，應(yīng)先高壓蒸汽滅菌再按醫(yī)療廢棄物或危險(xiǎn)廢物處理。3.廢棄培養(yǎng)基（不含傳染性物質(zhì)）：可經(jīng)滅菌處理后作為普通垃圾處理。嚴(yán)格區(qū)分是為了防止交叉污染，保護(hù)環(huán)境和操作人員安全，特別是避免化學(xué)物質(zhì)與生物性物質(zhì)混合引發(fā)危險(xiǎn)反應(yīng)或擴(kuò)散。十、實(shí)驗(yàn)方案：目的：探究不同濃度的某種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（如赤霉素）對(duì)植物種子萌發(fā)率的影響。原理：植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，不同濃度可能產(chǎn)生不同效應(yīng)甚至抑制效應(yīng)。材料與試劑：待測(cè)植物種子（如花生、大豆）、赤霉素（Gibberellin,GA?）、蒸餾水、培養(yǎng)皿、紗布、標(biāo)記筆、記號(hào)筆。實(shí)驗(yàn)步驟：1.取若干培養(yǎng)皿，編號(hào)，在皿底墊紗布并濕潤(rùn)。2.將等量、完整的種子均勻鋪在紗布上。3.設(shè)置對(duì)照組（CK）：每皿播種50粒種子，噴灑等量蒸餾水。4.設(shè)置實(shí)驗(yàn)組：設(shè)置3-5個(gè)不同赤霉素濃度梯度（如0,10??,10??,10??,10?2M），每個(gè)濃度重復(fù)3次（每個(gè)皿50粒，共3皿）。5.在相同、適宜的條件下（溫度、濕度、光照）培養(yǎng)。6.每日觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的種子數(shù)量，記錄。7.觀察記錄種子發(fā)芽情況（如發(fā)芽速度、幼苗生長(zhǎng)勢(shì)）。預(yù)期結(jié)果：與對(duì)照組相比，低濃度的赤霉素可能促進(jìn)