ICS65.020.30

CCSB41

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內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2728—2022

牛輪狀病毒腹瀉診斷技術(shù)規(guī)范

Technicalspecificationfordiagnosisofbovinerotavirusdiarrhea

2022-07-29發(fā)布2022-08-29實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2728—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、北京生泰爾科技股份有限公司、內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控

制中心、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、金宇保靈生物藥品有限公司。

本文件主要起草人：徐曉靜、王建龍、謝夢(mèng)圓、馬立峰、郭宇、王秀敏、常繼濤、陳堅(jiān)、馬培倩、

周偉光、黃海碧。

I

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牛輪狀病毒腹瀉診斷技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了牛輪狀病毒腹瀉的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)方法、操作程序和判定標(biāo)準(zhǔn)。

本文件適用于牛輪狀病毒腹瀉的診斷、監(jiān)測(cè)和檢疫等。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

BRV：牛輪狀病毒（Bovineratovirus）

CPE：致細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect）

DMEM：達(dá)爾伯克改良依格爾培養(yǎng)基（DuLbecco’sModifiedEagleMedium）

FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）

MA104細(xì)胞：恒河猴腎細(xì)胞（Rhesuskidneycell）

PBS：磷酸鹽緩沖鹽水（PhosphateBufferSaline）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）

TCID50：半數(shù)組織培養(yǎng)物感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose）

5生物安全措施

樣品處理的生物安全措施符合GB19489的規(guī)定。

樣品采集的生物安全措施符合GB/T27401的規(guī)定。

6病原

牛輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，病毒顆粒無囊膜，近似球形，直徑約70nm～75nm，

具有外、中、內(nèi)三層衣殼，每層均為20面體對(duì)稱?；蚪M為線狀雙股RNA。

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7臨床診斷

流行病學(xué)

7.1.1易感動(dòng)物

不同年齡和品種牛均可感染BRV，3周齡內(nèi)牛最易感，多發(fā)生于1周齡內(nèi)的犢牛。

7.1.2傳染源

病牛和帶毒牛是本病自然流行的傳染源，隱性感染牛和痊愈?？沙掷m(xù)排毒。

7.1.3傳播途徑

消化道是主要的傳播途徑。

7.1.4流行特點(diǎn)

有明顯季節(jié)性，多發(fā)生在晚秋、冬季和早春。

臨床癥狀

犢牛感染后在12h～24h出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，發(fā)病突然，病初表現(xiàn)為精神不振、厭食、嘔吐和腹瀉，體

溫正常或略高，排黃白色液狀糞便，有時(shí)排出帶有黏液的稀便。病程長者脫水明顯，嚴(yán)重者常有死亡。

成年牛多呈隱性感染，并在一定時(shí)間持續(xù)向外界排毒。

病理變化

牛輪狀病毒感染病理變化主要表現(xiàn)在消化道，腸腔內(nèi)充滿凝乳塊和乳汁，小腸腸壁變薄、半透明，

腸內(nèi)容物呈液狀、灰黃或灰黑色。

結(jié)果判定

符合6.1、6.2、6.3，可判定為牛輪狀病毒腹瀉疑似病例。

8實(shí)驗(yàn)室診斷

主要儀器設(shè)備

電鏡、低溫高速離心機(jī)、倒置顯微鏡、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、PCR儀、

PCR管、電泳儀、凝膠成像儀、酶標(biāo)儀。

主要試劑

PBS、2%磷鎢酸、DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞維持液、胰酶、MA104細(xì)胞、PCRTaq酶、DNAMarker、

TAE電泳緩沖液。主要試劑配制見附錄A。

樣品采集與處理

8.3.1糞便樣品

將棉拭子伸入肛門內(nèi)刮取新鮮糞便，也可無菌采集地上剛排出的新鮮糞便。分別放入裝有3mLPBS

的采樣管中，編號(hào)并記錄相關(guān)信息。

2

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漩渦振蕩器充分振蕩后，12000r/min4℃離心5min～8min，取上清編號(hào)備用。

8.3.2組織樣品

取病死牛小腸及內(nèi)容物，置于無菌密封袋或采樣杯內(nèi)。

稱取1g樣品置于研缽，充分研磨后加5mLPBS，混勻，8000r/min4℃離心5min，取上清編號(hào)

備用。

8.3.3血液樣品

一次性采血管采集血液3mL～4mL，犢牛采用頸靜脈采血，成年牛采用尾靜脈采血。

室溫靜置30min，3000r/min～4000r/min離心5min～10min。分離血清編號(hào)備用。

樣品運(yùn)輸與保存

采集的樣品應(yīng)低溫運(yùn)送，盡量12h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

采集或處理后的樣品在2℃～8℃保存，一般不超過24h，若長期保存，應(yīng)置于-70℃以下條件保

存。

病原學(xué)檢測(cè)

8.5.1電鏡檢查

將采集的糞便或腸內(nèi)容物用PBS制成1:4懸液，于盛有玻璃珠的管內(nèi)充分震蕩30min，取懸液3000

r/min離心30min，取上清，15000r/min離心30min，取上清，以40000r/min～50000r/min離心3

h～4h，棄上清，加1～2滴蒸餾水懸浮，滴加銅網(wǎng)，2%磷鎢酸染色，電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。

8.5.2病毒分離鑒定

8.5.2.1病毒分離

8.5.2.1.1單層細(xì)胞制備

MA104細(xì)胞可用于牛輪狀病毒分離培養(yǎng)。

用胰酶消化細(xì)胞，加入至少等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液終止，吹打混勻，使其分散濃度為1～2×106個(gè)/毫

升，分裝到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃靜置培養(yǎng)24h～48h。隨時(shí)觀察細(xì)胞生長情況，

待細(xì)胞長成單層備用。

8.5.2.1.2接種細(xì)胞

將處理后的樣品用細(xì)胞維持液制成1:5懸液，漩渦振蕩混勻，3000r/min4℃離心10min，用0.22

μm濾膜過濾后取上清，添加濃度為10μg/mL～20μg/mL胰酶，37℃處理0.5h～1h。每份樣品接種3瓶

細(xì)胞，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組。接種前棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中液體，按細(xì)胞維持液終體積的10%加入處理好的

樣品，37℃吸附1h，期間每隔20min搖晃一次，吸附完成后補(bǔ)加含0.5μg/mL～2μg/mL胰酶的細(xì)胞

維持液。對(duì)照組不接種樣品，棄去培養(yǎng)液后加入等量細(xì)胞維持液。均置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃靜置培

養(yǎng)。

8.5.2.1.3觀察和記錄

3

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每天觀察細(xì)胞狀態(tài)并記錄，連續(xù)觀察4d～5d。如對(duì)照組細(xì)胞單層完好，細(xì)胞生長正常，接種樣品

的細(xì)胞出現(xiàn)CPE，且80%以上細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，置-70℃以下凍存。若接種的細(xì)胞無CPE出現(xiàn)，反復(fù)凍融3次，

進(jìn)行盲傳。

8.5.2.1.4盲傳

將第1代無CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次后混合，5000r/min4℃離心5min～8min，取上清繼續(xù)

接種細(xì)胞，進(jìn)行觀察、記錄、收毒，盲傳第2代。此過程中培養(yǎng)物仍無CPE則按同樣的方法繼續(xù)盲傳至

第5～7代，若出現(xiàn)CPE，達(dá)到80%以上時(shí)收毒，置-70℃以下凍存。

8.5.2.2中和試驗(yàn)（固定血清-稀釋病毒法）

8.5.2.2.1單層細(xì)胞制備

將細(xì)胞濃度制備為1～2×106個(gè)/mL，于96孔板培養(yǎng)，每孔100μL，加細(xì)胞培養(yǎng)液補(bǔ)齊至1毫升/孔，

置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h。

8.5.2.2.2固定血清-稀釋病毒法

用DMEM培養(yǎng)基將病毒液進(jìn)行梯度稀釋（10-1～10-8）；將不同稀釋梯度的病毒液和已滅活的待檢血

清等量混合，37℃水浴感作1h；取混合液200μL分別加至已長成單層細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀

釋梯度接種4孔；同時(shí)設(shè)對(duì)照非免疫血清（對(duì)照組）和正常細(xì)胞各4孔。于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，計(jì)

算每組的TCID50和中和指數(shù)。

8.5.3PCR檢測(cè)

8.5.3.1總RNA提取

將采集的樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行處理，按RNA提取試劑盒方法提取核酸。在-20℃條件下可短時(shí)間

保存，若需長期保存，應(yīng)置于-70℃以下條件，避免反復(fù)凍融。

8.5.3.2引物合成

根據(jù)BRVVP6基因設(shè)計(jì)引物，采用常繼濤文章“牛輪狀病毒病原流行病學(xué)調(diào)查、基因重配毒株的構(gòu)

建及二價(jià)減毒株的免疫原性評(píng)價(jià)”中BRV引物序列：BRV-VP6-F：GACGGAGCGACTACATGGT；BRV-VP6-R：

GTCCAATTCATACCTGGTGG。

8.5.3.3反應(yīng)體系

按25μL反應(yīng)體系配制。

一步法：模板2μL，上、下游引物各1μL，OnestepTaq酶12.5μL，RNase-FreeH2O8.5μL。

兩步法：按反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA；模板2μL，上下游引物各1μL，Taq酶12.5μL，RNase-Free

H2O8.5μL。

8.5.3.4反應(yīng)參數(shù)

一步法：50℃30min；94℃5min；95℃20s，54℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃

10min。

兩步法：94℃5min；95℃20s，54℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

8.5.3.5電泳檢測(cè)

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制備瓊脂糖凝膠，取5μL～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入上樣孔，同時(shí)加入陽性和陰性對(duì)照以及DNAMarker，

于1×TAE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

8.5.3.6測(cè)序分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后測(cè)序分析，于NCBI中Blast分析是否為牛輪狀病毒VP6基因。

8.5.4ELISA檢測(cè)

待檢糞便樣品按牛輪狀病毒抗原診斷ELISA試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)。

8.5.5結(jié)果判定

8.5.5.1電鏡檢查結(jié)果

可見略呈球形，直徑約70nm～75nm的病毒顆粒，其形態(tài)似典型的“車輪”狀（見附錄B），即判

定樣品為牛輪狀病毒陽性。

8.5.5.2中和試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)正常對(duì)照組孔內(nèi)細(xì)胞單層生長良好，證明試驗(yàn)成立；可根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算中和指數(shù)（見附

錄C），待檢血清的中和指數(shù)大于50(Log＞1.7)，即可判定為陽性；10～49(Log=1～1.6)為可

疑；小于10(Log＜1)為陰性。

8.5.5.3PCR檢測(cè)結(jié)果

陽性對(duì)照、PCR產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致（207bp），同時(shí)陰性對(duì)照無條帶；即判定為陽性。

測(cè)序分析Blast比對(duì)為牛輪狀病毒VP6基因，即判定為陽性。

8.5.5.4ELISA檢測(cè)結(jié)果

按ELISA試劑盒要求進(jìn)行判定，樣品結(jié)果符合陽性標(biāo)準(zhǔn)即判定為陽性。

血清學(xué)檢測(cè)

采用中和試驗(yàn)（固定病毒-稀釋血清法）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。

8.6.1檢測(cè)時(shí)間

發(fā)病初期和發(fā)病后2周各檢測(cè)1次。

8.6.2血清稀釋

于1.5mL離心管中加入DMEM培養(yǎng)基，每管100μL；取56℃，30min滅活的血清100μL加入管內(nèi)，

從第一個(gè)管開始做10倍連續(xù)稀釋，從最后一管內(nèi)棄去100μL液體。

8.6.3感作

每個(gè)不同稀釋度的血清內(nèi)加入100μLBRV病毒液，充分混勻，37℃水浴感作1h。

8.6.4接種

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取200μL感作后的液體分別加至已長成單層細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋梯度接種4孔；同

時(shí)設(shè)血清毒性對(duì)照（細(xì)胞內(nèi)加最低稀釋度的血清）、1:10稀釋的BRV陽性血清對(duì)照、1:5稀釋的陰性血清

對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照各4孔及BRV病毒液回歸對(duì)照100～10-3的4個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度各4孔。

8.6.5觀察和記錄

將細(xì)胞板置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察5d～7d，觀察并記錄各孔CPE。

8.6.6結(jié)果判定

當(dāng)正常對(duì)照組孔內(nèi)細(xì)胞單層生長良好，陽性血清對(duì)照組呈現(xiàn)預(yù)期的中和效價(jià)，陰性血清對(duì)照組沒有

中和效價(jià)，證明試驗(yàn)成立。記錄血清各稀釋度的4個(gè)孔中出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，按照Reed-Muench法（見附錄

C）分別計(jì)算血清中和BRV的抗體效價(jià)，抗體效價(jià)大于1:5時(shí)，即為中和試驗(yàn)結(jié)果陽性。

發(fā)病初期和發(fā)病后2周中和試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，且發(fā)病后2周抗體效價(jià)達(dá)發(fā)病初期的4倍，即判定為

牛輪狀病毒感染。

9綜合判定

疑似

符合6.1、6.2、6.3，可判定為牛輪狀病毒腹瀉疑似病例。

確診

符合6.1、6.2、6.3，同時(shí)病原學(xué)檢測(cè)中任一檢測(cè)（電鏡檢查、病毒分離鑒定、PCR檢測(cè)、ELISA檢

測(cè)）結(jié)果為陽性可確診牛輪狀病毒腹瀉。

符合6.1、6.2、6.3，同時(shí)符合7.6.6，可確診牛輪狀病毒腹瀉。

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

試劑配制

A.1PBS緩沖液：

NaCl8g

KCl0.2g

Na2HPO41.44g

KH2PO40.24g

蒸餾水定容至800mL，HCl調(diào)其pH至7.4左右，加蒸餾水定容至1000mL，121℃15min高壓滅菌。

A.2細(xì)胞培養(yǎng)液：

DMEM培養(yǎng)基44.5mL

FBS5mL

青鏈霉素(10000U/mL)500μL

混合均勻后，4℃密封保存，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

A.3細(xì)胞維持液

DMEM培養(yǎng)基44.5mL

胰酶0.25g/mL

青鏈霉素(10000U/mL)500μL

混合均勻后，4℃密封保存，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

A.450×TAE電泳緩沖液

三羥甲基氨基甲烷（Tris）242g

EDTA-2Na37.2g

冰乙酸57.1mL

去離子水942.9mL

Tris和EDTA-2Na溶于800mL去離子水，攪拌均勻；加入冰乙酸，充分溶解；用1moL/LNaOH調(diào)pH值

至8.3，滅菌去離子水定容至1000mL后，室溫保存。使用時(shí)稀釋50倍即為1×TAE電泳緩沖液。

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B

B

附錄B

（資料性）

牛輪狀病毒電鏡圖

牛輪狀病毒電鏡檢查結(jié)果如下圖，鏡下可見略呈球形，直徑約70nm～75nm的病毒顆粒，其形態(tài)似

典型的“車輪”狀。

圖B.1牛輪狀病毒粒子電鏡圖