ICS65.020.30CCSB4443DetectionmethodsoffishmyxosporeanIDB43/T2816—2023前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14試劑與材料 15儀器與設(shè)備 16采樣 27檢查步驟 28結(jié)果判定 3附錄A（規(guī)范性）試劑及其配制 4附錄B（資料性）不同粘孢子蟲感染癥狀及包囊形態(tài) 5附錄C（資料性）幾種常見粘孢子蟲成熟孢子形態(tài) 6DB43/T2816—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：湖南農(nóng)業(yè)大學、湖南應用技術(shù)學院、資興市水產(chǎn)良種場、中國科學院水生生物研本文件主要起草人：劉新華、任詩思、皮杰、李德亮、向建國、余建波、呂欣榮、劉志輝、葉少文。DB43/T2816—20231魚類粘孢子蟲檢測方法本文件給出了湖泊魚類粘孢子蟲檢測的試劑與材料、儀器和設(shè)備、采樣、檢查步驟與結(jié)果判定方法。本文件適用于魚類粘孢子蟲的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。SC/T7103水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范SC/T7223.1黏孢子蟲病診斷規(guī)程第1部分：洪湖碘泡蟲SC/T7223.2黏孢子蟲病診斷規(guī)程第2部分：吳李碘泡蟲SC/T7223.3黏孢子蟲病診斷規(guī)程第3部分：武漢單極蟲SC/T7223.4黏孢子蟲病診斷規(guī)程第4部分：吉陶單極蟲SN/T2503淡水魚中寄生蟲檢疫技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4試劑與材料本標準所使用的試劑均為分析純，水為蒸餾水。4.1乙醇：70%乙醇。4.2溴酚藍。4.310xPCRBufferMIX：-20℃保存，避免反復凍融。4.4引物序列上游引物：5’-GATTGACGAGGTCGTTCGTTTA-3’；下游引物：5’-AGTAGGCCCTTACCCTACTTAC-3’；本對引物擴增小核糖體小亞基rRNA基因（18SrDNA）的部分序列。4.5DNAmarker2000（bp）:2000、1000、750、500、250、100。5儀器與設(shè)備5.1解剖盤、剪刀、鑷子、解剖針、解剖刀。5.2體視顯微鏡和帶測微標尺的光學顯微鏡。5.3蓋玻片、載玻片、培養(yǎng)皿、巴氏吸管。5.4恒溫水浴鍋（控溫范圍：RT-100℃±1℃)。2DB43/T2816—20235.5-20℃和-80℃冰箱。5.7PCR擴增儀。5.8離心管和PCR管。5.9高壓滅菌鍋。5.10超凈工作臺。5.11水平電泳系統(tǒng)。5.12紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)。6采樣樣品的采集應符合SC/T7103、SC/T7223.1、SC/T7223.2、SC/T7223.3和SC/T7223.4中的相關(guān)要求，樣品封存和運輸應符合SC/T7103的相關(guān)規(guī)定。7檢查步驟觀察樣品，檢查順序應符合SN/T2503中的相關(guān)要求，先檢查體表部位是否有明顯的白色包囊或似包囊狀瘤狀物，如體表皮膚、鰭、鼻腔、口腔、眼球等，隨后解剖魚體觀察內(nèi)臟是否出現(xiàn)白色包囊，包括體腔、脂肪組織、胃腸、肝、脾等。7.2鏡檢7.2.1當在7.1中發(fā)現(xiàn)疑似包囊狀物時，用剪刀與鑷子將單個或多個包囊分離，置于載玻片上。然后，再用解剖針戳破疑似包囊物，加入約20μL-30μL雙蒸水，蓋上蓋玻片置于光學顯微鏡中觀察是否存在成熟孢子。7.2.2當在魚體組織中未發(fā)現(xiàn)疑似包囊狀物時，用剪刀或鑷子取少量組織或液體（膽汁、血液、尿液等）置于載玻片上，用鑷子將組織分散，加入約20μL-30μL雙蒸水，蓋上蓋玻片，稍加壓平，置于光學顯微鏡中觀察是否存在成熟孢子。7.3分子鑒定7.3.1檢測樣本固定將6.2中粘孢子蟲感染的包囊或組織從宿主上分離，用濃度大于70%的乙醇固定于離心管中（參見附錄A），低溫（-20℃)保存，標識好標簽并記錄。7.3.2DNA提取將6.2固定的樣品充分混勻，破碎后用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次以去除殘余酒精。將離心管置于-80℃冰箱快速冷凍5min，取出并立即置于80℃水浴鍋中5min，重復三次后鏡檢觀察孢子是否完全破碎，極絲是否擠出。破碎后利用細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，提取樣品基因組DNA。提取好的基因組DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.3.3PCR擴增DB43/T2816—20233在50μL的PCR反應體系中，包含模板基因組DNA2μL、10×PCRBufferMIX（康為世紀）在PCR擴增儀中，反應程序為94℃預變性4min；94℃變性1min；46℃退火50s；65℃延伸1min,35個循環(huán)；65℃終延伸10min。PCR擴增時，應設(shè)置陰性對照和陽性對照。7.3.4PCR產(chǎn)物電泳與測序取5微升PCR擴增產(chǎn)物，用添加溴酚藍指示劑的1.0%瓊脂糖凝膠于TAE緩沖液（參見附錄A）中電泳分離，同時設(shè)置DNA分子量標準作參照，紫外透射儀下檢查是否存在大約900bp的目的條帶。如果存在，則取PCR擴增產(chǎn)物測序，測序后通過GenBank進行BLAST比對。8結(jié)果判定當肉眼觀察到明顯白色包囊或白色囊狀物（見附錄B），可以懷疑為粘孢子蟲感染，但需經(jīng)8.2、8.3步驟檢查后才能進一步確診。8.2鏡檢8.2.1將經(jīng)8.1步驟檢查未觀察到明顯包囊的組織進一步置于解剖鏡下，觀察是否有肉眼不可見的白色包囊（見附錄B），如觀察到需將其從組織中分離，并經(jīng)7.2.2進行觀察后確診。8.2.2將經(jīng)8.1和8.2.1步驟觀察的疑似包囊以及外觀正常的少量組織進行壓片，觀察到明顯的粘孢子蟲成熟孢子即可確診（見附錄C）。8.3分子鑒定將所測定的18SrDNA序列（900bp左右）與GenBank數(shù)據(jù)庫中粘孢子蟲序列進行比對，如比對出來的種類均為粘孢子蟲序列相似性在80%以上，亦可判定為粘孢子蟲。DB43/T2816—20234試劑及其配制A.170%乙醇溶液70mL無水乙醇溶液，加30mLPBS緩沖液（0.01mol/L,pH7.4）。A.2磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L,pH7.4）稱7.9gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH2PO4（or1.44gNa2HPO4）和1.8gK2HPO4，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加雙蒸水定容至1L，4℃冰箱保存。A.3TAE電泳緩沖液（50倍）稱量242.0gTris堿、37.2gNa2EDTA·2H2O混合，然后加入800mL的去離子水充分攪拌溶解，再加入57.1ml的冰乙酸，充分混勻，加去離子水定容至1L，室溫保存。A.4溴酚藍指示劑溶液取溴酚藍100mg，加雙蒸水5mL,在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍溶液中，搖勻后加雙蒸水定容至50mL，加入氫氧化鈉（NaOH）溶液1滴，調(diào)至藍色。DB43/T2816—20235不同粘孢子蟲感染癥狀及包囊形態(tài)圖B.1不同粘孢子蟲病感染癥狀(A)：普洛寧碘泡蟲感染鯽魚腹腔癥狀，靶尺=1cm；(B)：吉陶單極蟲感染散鱗