鑒別免疫與感染動(dòng)物的布魯氏菌天然半抗原抗體瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)argargelimmunodiffusiontest(AGID)for2025-9-30發(fā)布2025-9-30實(shí)施IT/CVMA291—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提出。本文件由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、青島市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師畜牧水產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心、青島立見生物技術(shù)有限公司、包頭市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、內(nèi)蒙古包頭市固陽(yáng)縣畜牧技術(shù)服務(wù)中心。本文件主要起草人：邵衛(wèi)星、李彥、焉鑫、段笑笑、趙明、孫榮釗、徐晶晶、孫世雄、張培培、張研博、亓菲、杜建軍、王東云、馬帥、孫明軍、張皓博、劉蒙達(dá)、靳繼惠、黃孟錕、孫翔翔。物的抗體檢測(cè)方法。光滑型布魯氏菌的天然半抗原(NativeHapten,NH)是一種分子量小、抗原性較續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)NH的抗體，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，且抗體與NH抗原結(jié)合常數(shù)相對(duì)高；而接種動(dòng)物后，疫依據(jù)NH抗體在感染和免疫動(dòng)物體內(nèi)抗體的滴度、持續(xù)時(shí)間及與NH抗原結(jié)合常數(shù)的不同，可通過檢測(cè)本文件僅規(guī)定了牛種布魯氏菌和羊種布魯氏菌兩種光滑型布魯氏菌感染牛、羊引起的NH抗體瓊脂本文件等同采用WOAH《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)》中3.1.4章“布魯氏菌病(牛種、羊種和豬種布魯氏菌感染)(2022版)”的8.9節(jié)內(nèi)容。T/CVMA291—20251本文件規(guī)定了檢測(cè)牛、羊血清中布魯氏菌天然半抗原(NH)抗體瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法(AGID)的程僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范后且進(jìn)入感染活躍期，感染動(dòng)物常出現(xiàn)菌血癥，并通過機(jī)體向外排菌的情況(其血液、乳汁、陰道分泌物、精液等可分離檢測(cè)到布魯氏菌)。AGID:瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(Agargelimmunodiffusiontest)NH:天然半抗原(Nativehapten)25.1.1除特別說明以外，本文件所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水符合GB/T6682中二級(jí)水的要求。5.1.2布魯氏菌天然半抗原，制備方法見附錄A。5.1.3帶梅花形孔的瓊脂糖平板，制備方法5.1.4陰性對(duì)照血清為布魯氏菌疫苗免疫血清，制備方法見附錄C。5.1.5陽(yáng)性對(duì)照血清為布魯氏菌感染血清，制備方法見附錄D。5.1.6離心管(2.0mL,無(wú)核酸酶)。5.1.7微量移液器吸頭(10μL、200μL,無(wú)核酸酶)。6.1冰箱：2℃~8℃,-20℃以下。6.5微量移液器(量程為2μL～20μL、20μL～200μL)。8.1.1對(duì)于未成年羊(3月齡～4月齡)8.1.2對(duì)于未成年牛(3月齡～8月齡)8.2對(duì)于成年(性成熟)后僅免疫一次疫苗的牛、羊3疫后4個(gè)月開始檢測(cè)。點(diǎn)眼接種RevI疫苗，可在免疫后2個(gè)月開始檢測(cè)。無(wú)論何種疫苗免疫，都可在分8.3對(duì)于成年(性成熟)后免疫二次(間隔1年以上)的牛、羊皮下二次接種A19、A19△virB12、S19或BA0711疫苗，可在免疫后9個(gè)月開始檢測(cè)，或在分娩(二免后)后1個(gè)月進(jìn)行檢測(cè)。9.1從2℃~8℃冰箱中取出帶有梅花形(一個(gè)梅花形包含6個(gè)周圍孔和1個(gè)中間孔)孔的瓊脂糖平板，反復(fù)經(jīng)過4次～5次(不超過10s),對(duì)瓊脂糖平板梅花形孔的底部進(jìn)行封閉，避免加入的抗原或血清陽(yáng)性對(duì)照血清分別加到瓊脂糖平板上同一個(gè)梅花形周圍鄰近的2個(gè)孔中(參見1中NC孔和PC孔)。每批9.3將18μL～20μL的檢測(cè)抗原加到瓊脂糖平板每個(gè)梅花形在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育12h以上(最長(zhǎng)不超過24h)后，取出瓊脂糖平板，對(duì)著光源，并傾斜一陽(yáng)性對(duì)照血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)1條沉淀線，并靠近血清孔一側(cè)(參見圖1中PC孔);而陰性對(duì)照血清與抗原孔之間不出現(xiàn)沉淀線(參見圖1中NC孔)。9.5.3.1非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體個(gè)體陽(yáng)性率在抗原孔與血清孔之間無(wú)沉淀線(參見圖1中V孔),判4靜默期的牛、羊。對(duì)于陰性結(jié)果，可在本次采樣后1月～2月或分娩后1月～2月再次采樣檢測(cè)，可9.5.3.2在抗原孔與樣品血清孔之間出現(xiàn)1條沉淀線，并靠近血清孔(參見下圖I孔),判定該血清標(biāo)引序號(hào)說明：I——感染血清；V——免疫血清；A——檢測(cè)抗原；NC——陰性對(duì)照血清；PC——陽(yáng)性對(duì)照血清。T/CVMA291—20255(資料性)布魯氏菌NH抗原的制備在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，從-80℃取出魯氏菌16M株菌種，在TSA平板上劃線，于37℃培養(yǎng)箱中培平板中，200μL/塊，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。取出TSA平板，用PBS洗脫菌苔，2mL/塊，置于15mL離心管中，向管中加入終濃度為2%的苯酚，室溫滅活48h,從管中取出10μL,涂布TSA平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,無(wú)菌落生長(zhǎng)，證明滅活完全。將滅活的菌液管經(jīng)傳遞窗傳遞到生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室將滅活的菌液用生理鹽水洗3次，5000g離心15min,然后將菌體以菌體(濕重):2%乙酸-10%NaCl溶液為100g:500mL的比例加入2%乙酸-10%NaCl溶液中，重懸菌液。對(duì)細(xì)菌懸液高壓(151b/in2,121℃,30min),冷卻至室溫，10,000g離心15min,保留上清液。向上清液中加入等體積的含1%乙0.12%Trishydrochoride(pH7.0))溶解，用純水在4℃透析24h,凍干，獲得NH抗原粗提物。DNase,在室溫持續(xù)攪拌18h,然后加入50μg/mL的蛋白酶K,55℃作用1h,然后置于室溫24h。在4℃條件下200,000g離心6h。取出上清，去除沉淀。向上清溶液中加入等體積的90%飽和酚，在70℃持續(xù)攪拌30min,然后將溶液在2℃~8℃冰箱放置過夜。在0℃條件下10,000g離心15min,吸出苯酚層，分別加入5倍體積和7倍-20℃從苯酚層沉淀NH抗原，用含1%乙酸鈉的甲醇溶液洗滌2次，經(jīng)Tris鹽溶解和透析，然后進(jìn)行超速離心(100,000g,18h,4℃),去除蛋后凍干。凍干的NH粉末溶于pH4.0的0.05M乙酸吡啶(溶液：NH=1000:1),然后用葡聚糖G-50柱 (2.5cm×100cm)洗脫，洗脫液分部分收集，并凍干，獲得純化的NH抗原。進(jìn)行瓊抗原溶于純水中(純水：NH=100mL:16mg),一周之內(nèi)，可保存在2℃~8℃冰箱，長(zhǎng)期應(yīng)保存在-20℃以下。6(資料性)1.0%瓊脂成分及含量見表B.1。氯化鈉向250mL三角瓶中加入表B.1中各成分，置于微波爐中加熱5min,期間搖動(dòng)三角瓶1～2次，至瓊脂糖完全熔化，然后置于70℃水浴中。用10mL移液管吸取7.0mL1.0%瓊脂糖至直徑為60mm的一次性平皿中(注意不要產(chǎn)生氣泡),待瓊脂糖完全凝固，置于2℃~8℃冰箱中過夜，取出，用孔徑4mm、孔距3mm的7孔梅花型打孔器進(jìn)行打孔，將切下的中間瓊脂柱用針頭輕輕挑出，保持孔的邊緣平整。每個(gè)平皿打3組梅花孔。將打孔后的瓊脂板在酒精燈外焰上均勻轉(zhuǎn)動(dòng)4s～5s,封底。鋁箔袋真空包裝，2℃~8℃保存，保存期12個(gè)月。7(資料性)在無(wú)害化處理場(chǎng)采集布魯氏菌感染的羊。選擇制備陽(yáng)性血清羊的標(biāo)準(zhǔn)需同時(shí)達(dá)到以下條件：1)血清經(jīng)虎紅平板凝集試驗(yàn)和NH-AGID試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果均為強(qiáng)陽(yáng)性；2)采集臟器(脾、淋巴結(jié))和/或奶從羊的頸靜脈無(wú)菌采集羊的血液，室溫放置2h～4h,待血清析出，3500g離心10min,取血清，分裝1.8mL管中，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｑ鍛?yīng)無(wú)溶血，呈淡黃色。8