ICS65.020.20

B05

DB13

河北省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB13/T1767—2013

蘋果品種DNA指紋鑒定

2013-09-05發(fā)布2013-09-30實(shí)施

河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DB13/T1767—2013

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由河北省林業(yè)廳提出。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉興菊、楊敏生、梁海永、張軍、左立輝、李雪雁、姚偉明、楊立華、韓志校

魏姍姍、甄紅偉、王瑞霞。

I

DB13/T1767—2013

蘋果品種DNA指紋鑒定

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蘋果品種DNA指紋鑒定的方法及判定標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于蘋果品種鑒定及河北省蘋果品種DNA指紋庫的建立。

2原理

不同蘋果品種由于遺傳組成不同，基因組DNA中簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)有差異，這種差異可經(jīng)過

PCR擴(kuò)增、電泳分離、顯色程序繪制的DNA指紋圖譜加以區(qū)分，從而對(duì)不同品種進(jìn)行鑒定。從蘋果幼苗、

葉片等組織中提取總DNA，利用SSR引物對(duì)位于不同染色體上的SSR位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同堿基長(zhǎng)度的PCR

擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（或通過DNA分析儀、測(cè)序儀進(jìn)行分離），并通過染色顯示DNA

指紋譜帶類型。

3儀器設(shè)備及試劑

蘋果品種DNA指紋鑒定所需儀器設(shè)備及試劑名單見附錄A。

4溶液配制

蘋果品種DNA指紋鑒定相關(guān)溶液配制方法見附錄B。

5鑒定方法

5.1樣品準(zhǔn)備

5.1.1取樣量

每份送檢樣品至少檢測(cè)3個(gè)個(gè)體，每個(gè)個(gè)體至少1g，對(duì)一致性差的樣品應(yīng)至少檢測(cè)5個(gè)個(gè)體。

5.1.2品種比較方式

a)成對(duì)品種的比較

送檢樣品提供兩份，一份為待檢品種，一份為對(duì)照品種。將待檢品種與對(duì)照品種直接進(jìn)行成對(duì)比

較。雜交后代需提供母本與父本的樣品。

b)品種與DNA指紋庫入庫品種的比較

送檢樣品可提供一份。將待檢樣品與DNA指紋庫所有入庫品種的指紋進(jìn)行比較，篩選出指紋最相

似或相同的品種作為待檢品種的近似品種，然后將待檢品種與近似品種直接進(jìn)行成對(duì)比較。

5.2DNA提取

1

DB13/T1767—2013

5.2.1宜采用改良的CTAB法。取200mg干凈葉片置入1.5mL離心管中，加入500μLDNA提取液研磨碎，

并加1mL洗滌液及30μLβ-巰基乙醇，充分搖勻后置冰上5min，于4℃，12000g離心8min后，洗滌

一次，棄上清，再加700μL預(yù)熱的CTAB緩沖液,充分混勻后，于65℃水浴60min，其間顛倒幾次。然

后于室溫冷卻4min～5min，取上清,加等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),混勻抽提，室溫靜置5min，

于室溫12000g離心8min。上清液移于一新的1.5mL離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，充

分混勻后室溫靜置5min，室溫12000g離心8min，取上清，重復(fù)加等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，

取上清加入等體積氯仿抽提一次，取上清液，加入2倍體積的無水乙醇(-20℃)，輕輕混勻后在-20℃沉

淀30分鐘以上，12000g離心10min，將所得沉淀風(fēng)干后溶于100μL水中，置4℃冰箱備用。

5.2.2其它保證DNA質(zhì)量的方法也可采用，應(yīng)用前需要通過微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA質(zhì)量與濃度

檢測(cè)。

5.3PCR擴(kuò)增

5.3.1SSR擴(kuò)增

基本核心引物名單見附錄C。

5.3.2反應(yīng)體系

反應(yīng)液體積為20μL，組分配制應(yīng)符合表1的規(guī)定（或按比例減少至10μL）。

表1PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)組分原濃度終濃度反應(yīng)體積μL

ddH2O13.35

10×buffer10×1×2

MgCl225mmol/L2.5mmol/L2

dNTP2.5mmol/L0.15mmol/L1.2

Taq酶5U/μL1U0.2

引物20μmol/L0.25μmol/L0.25

DNA30~50ng/μL1.5~2.5ng/μL1

5.3.3反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s,共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保

存。

5.4變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

5.4.1清洗玻璃板

用自來水沾洗滌靈將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，雙蒸水擦洗兩遍，95%乙醇擦洗兩遍，干燥。在長(zhǎng)板上

涂上0.5mL親和硅烷工作液，帶凹槽的短板上涂0.5mL剝離硅烷工作液。操作過程中防止兩塊玻璃板互

相污染。

5.4.2組裝電泳板

待玻璃板徹底干燥后組裝電泳板，并用水平儀調(diào)平。

2

DB13/T1767—2013

5.4.3灌膠

在100mL4.5%PAGE膠中加入TEMED和25%過硫酸銨各100μL，迅速混勻后灌膠。待膠流動(dòng)到下部，

在上部輕輕插入梳子，使其聚合至少lh以上。灌膠過程中防止出現(xiàn)氣泡。

5.4.4預(yù)電泳

在正極槽中加入1×TBE緩沖液600mL，在負(fù)極槽(上槽)加入預(yù)熱至65℃的I×TBE緩沖液600mL，拔

出梳子。90W恒功率預(yù)電泳10min~20min。

5.4.5變性

在20μLPCR樣品中加入4μL6×加樣緩沖液，混勻后，在PCR儀上運(yùn)行變性程序:95℃變性5min，4℃

冷卻10min以上。

5.4.6電泳

用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)，插入樣品梳子。每一個(gè)加樣孔點(diǎn)入5μL樣品。80W恒功率電

泳至上部的指示帶(二甲苯青)到達(dá)膠板的中部(約40min)。電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，凝膠會(huì)

緊貼在長(zhǎng)板上。

5.5銀染

5.5.1銀染流程圖

固定液中輕輕晃動(dòng)3min

雙蒸水快速漂洗1次，不超過10s

銀染染色液中染色約10~15min

雙蒸水快速漂洗1次，不超過10s

顯影液中輕輕晃動(dòng)至帶紋出現(xiàn)

雙蒸水快速漂洗1次，不超過30s

定影固定液中定影5min

雙蒸水漂洗1min

6結(jié)果及判定

3

DB13/T1767—2013

6.1數(shù)據(jù)表示

以多數(shù)個(gè)體具有的譜帶即主帶作為品種的特征譜帶，當(dāng)無法判斷主帶時(shí)，給出各種譜帶所占的比率。

譜帶記錄方式:每個(gè)核心引物的所有譜帶按擴(kuò)增片段從大到小的順序編號(hào)，用二位代碼描述(依次為01、

02..….)，并確定代表每條譜帶的一套標(biāo)準(zhǔn)品種。每個(gè)待測(cè)品種在每個(gè)引物位點(diǎn)上的譜帶號(hào)用四位代

碼描述，參照標(biāo)準(zhǔn)品種確定待測(cè)品種的譜帶號(hào)。

示例1：在一個(gè)核心引物上僅有一條譜帶02，品種在該引物位點(diǎn)的譜帶代碼為0202；

示例2：在一個(gè)核心引物上有兩條譜帶02和03，品種在該引物位點(diǎn)的譜帶代碼為0203。

6.2檢測(cè)及判定標(biāo)準(zhǔn)

6.2.1先用17對(duì)基本核心引物檢測(cè)，獲得待測(cè)品種在17個(gè)引物位點(diǎn)的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)，利用17

個(gè)位點(diǎn)的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)進(jìn)行品種間比較。親緣關(guān)系較近難以區(qū)分時(shí)可附加17個(gè)參考位點(diǎn)。

a)品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為不同品種；

b)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝1，判定為相近品種；

c)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為相同或極近似品種。

6.2.2對(duì)b和c的情況，必要時(shí)繼續(xù)用17對(duì)擴(kuò)展核心引物進(jìn)行檢測(cè)，利用34個(gè)位點(diǎn)的DNA指紋譜帶

數(shù)據(jù)進(jìn)行品種間比較：

a)品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為不同品種；

b)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝1，判定為相近品種；

c)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為相同或極近似品種。

6.3鑒定報(bào)告

鑒定報(bào)告書格式見附錄D。

4

DB13/T1767—2013

AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

儀器設(shè)備及試劑

A.1儀器設(shè)備

A.1.1PCR核酸擴(kuò)增儀:規(guī)格為96孔;

A.1.2序列分析電泳槽;

A.1.3高壓電泳儀:規(guī)格為3000V,400mA,400W;

A.1.4水平搖床;

A.1.5膠片觀察燈;

A.1.6電子天平;

A.1.7微量加樣器;

A.1.8磁力攪拌器;

A.1.9高速離心機(jī)

A.1.10微量紫外分光光度計(jì)

A.1.11高壓滅菌鍋;

A.1.12pH酸度計(jì)。

A.2試劑

所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水。

A.2.1乙二胺四乙酸二鈉;

A.2.2Tris堿;

A.2.3鹽酸;

A.2.4氫氧化鈉;

A.2.510×Buffe:緩沖液;

A.2.6四種脫氧核苷酸:4×dNTP;

A.2.7TaqDNA聚合酶;

A.2.8SSR引物;

A.2.9礦物油;

5

DB13/T1767—2013

A.2.10去離子甲酞胺;

A.2.11澳酚藍(lán);

A.2.12二甲苯青FF;

A.2.13甲叉雙丙烯酰胺;

A.2.14丙烯酰胺;

A.2.15硼酸;

A.2.16脲素;

A.2.17親和硅烷:97%;

A.2.18剝離硅烷:2%二甲基二氯硅烷;

A.2.19無水乙醇;

A.2.20四甲基乙二胺(TEMED);

A.2.21過硫酸銨;

A.2.22冰醋酸;

A.2.23硝酸銀;

A.2.24甲醛溶液:37%。

6

DB13/T1767—2013

BB

附錄B

（規(guī)范性附錄）

溶液配制

B.1DNA提取溶液的配制

B.1.10.5mol/LEDTA溶液

186.lgNa2EDTA·2H2O溶于800mL水中，用固體NaOH調(diào)pH至8.0，定容至1000mL，高壓滅

菌。

B.1.21mol/LTris-HCI溶液

60.55gTris堿溶于適量水中，加HCI調(diào)pH至8.0定容至500mL，高壓滅菌。

B.1.3洗滌液

100mMTris-HC,lpH8.0;50mMEDTA;1MNaC;l1%β-巰基乙醇;2%PVP

B.1.4CTAB提取緩沖液

100mmol/LTris-HCl（pH8.0），20mmol/LEDTA-Na2，1.4mol/LNaCl，2%CTAB，使用前加入0.1%

（V/V）的β-巰基乙醇(注：先將除巰基乙醇之外的藥品配好，高壓蒸汽滅菌之后加入巰基乙醇)

B.1.5酚/氯仿/異戊醇

25：24：1。

B.1.6TE緩沖液1

lmol/LTris-HC15mL，0.5mol/LEDTA1mL，加HCI調(diào)pH至8.0，定容至500mL。

B.1.7TE緩沖液2

lmol/LTris-HC15rnL，0.5mol/LEDTA1mL，0.5mol/LHCI100mL，定容至500mL。

B.1.85mol/LNaCI溶液

146g固體NaCI溶于水中，加水定容至500mL。

B.2PCR擴(kuò)增溶液的配制

B.2.1dNTP

用超純水分別配制A、G、C、T終濃度100mmol/L的儲(chǔ)存液。各取20μL混合，用超純720μL定

容至終濃度2.5mmol/Leach的工作液。也可直接購買濃度2.5mmol/Leach的工作液。

B.2.2SSR引物

用超純水分別配制前引物和后引物終濃度均40μmol/L的儲(chǔ)存液，等體積混合成20μmo1/L的工作

7

DB13/T1767—2013

液。注:干粉配制前應(yīng)首先快速離心。

B.2.36×加樣緩沖液

去離子甲酞胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液(pH8.0)1mL，澳酚蘭0.125g，二甲苯青0.125g。

B.3變性聚丙烯酞胺凝膠電泳溶液的配制

B.3.140%PAGE膠

丙烯酞胺190g和甲叉雙丙烯酚胺10g,定容至500mL。

B.3.24.5%PAGE膠

尿素450g，10×TBE緩沖液100mL，40%PAGE膠112.5mL，定容至1000mL。

B.3.3Bind緩沖液

49.75mL無水乙醇和250μL冰醋酸，加水定容至50mL。

B.3.4親和硅烷工作液

在1mLBind緩沖液中加入5μLBind原液，混勻。

B.3.5剝離硅烷工作液

2%二甲基二氯硅烷。

B.3.625%過硫酸銨溶液

0.25g過硫酸銨溶于1mL超純水中。

B.3.710×TBE緩沖液

Tris堿108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA溶液37mL，定容至1000mL。

B.3.81×TBE緩沖液

10×TBE緩沖液500mL，加水定容至5000mL。

B.4銀染溶液的配制

B.4.1固定液

100mL冰醋酸，加水定容至1000mL。

B.4.2染色液

2g硝酸銀，加水定容至1000mL。

B.4.3顯影液

1000mL蒸餾水中加入30g氧氧化鈉和5mL甲醛。

8

DB13/T1767—2013

CC

附錄C

（規(guī)范性附錄）

基本核心引物名單

標(biāo)記位點(diǎn)染色推薦正向引物序列（5’-3’）反向引物序列（5’-3’）

CH03g121IGCGCTGAAAAAGGTCAGTTTCAAGGATGCGCATGTATTTG

CH02b102ICAAGGAAATCATCAAAGATTCAAGCAAGTGGCTTCGGATAGTTG

CH03g073IAATAAGCATTCAAAGCAATCCGTTTTTCCAAATCGAGTTTCGTT

CH02h11a4ICGTGGCATGCCTATCATTTGCTGTTTGAACCGCTTCCTTC

CH03a095IGCCAGGTGTGACTCCTTCTCCTGCAGCTGCTGAAACTGG

CH03d126IGCCCAGAAGCAATAAGTAAACCATTGCTCCATGCATAAAGGG

CH02a047IGAAACAGGCGCCATTATTTGAAAGGAGACGTTGCAAGTGG

CH01c068ITTCCCCATCATCGATCTCTCAAACTGAAGCCATGAGGGC

CH01f03b9IGAGAAGCAAATGCAAAACCCCTCCCCGGCTCCTATTCTAC

CH02a0810IGAGGAGCTGAAGCAGCAGAGATGCCAACAAAAGCATAGCC

CH02d0811ITCCAAAATGGCGTACCTCTCGCAGACACTCACTCACTATCTCTC

CH01F0212IACCACATTAGAGCAGTTGAGGCTGGTTTGTTTTCCTCCAGC

CH05c0413ICCTTCGTTATCTTCCTTGCATTGAGCTTAAGAATAAGAGAAGGGG

CH03d0814ICATCAGTCTCTTGCACTGGAAATAGGGCTAGGGAGAGATGATGA

CH02c0915ITTATGTACCAACTTTGCTAACCTCAGAAGCAGCAGAGGAGGATG

CH05a0416IGAAGCGAATTTTGCACGAATGCTTTTGTTTCATTGAATCCCC

CH01h0117IGAAAGACTTGCAGTGGGAGCGGAGTGGGTTTGAGAAGGTT

Hi02c071IIAGAGCTACGGGGATCCAAATGTTTAAGCATCCCGATTGAAAGG

CH02c02a2IICTTCAAGTTCAGCATCAAGACAATAGGGCACACTTGCTGGTC

MS14h033IICGCTCACCTCGTAGACGTATGCAATGGCTAAGCATA

CH04e024IIGGCGATGACTACCAGGAAAAATGTAGCCAAGCCAGCGTAT

CH05f065IITTAGATCCGGTCACTCTCCACTTGGAGGAAGACGAAGAAGAAAG

CH03d076IICAAATCAATGCAAAACTGTCAGGCTTCTGGCCATGATTTTA

CH04e057IIAGGCTAACAGAAATGTGGTTTGATGGCTCCTATTGCCATCAT

CH01f098IIATGTACATCAAAGTGTGGATTGAATTCCAATTTCAGAACAGG

CH01h029IIAGAGCTTCGAGCTTCGTTTGATCTTTTGGTGCTCCCACAC

CH02B03b10IIATAAGGATACAAAAACCCTACACAGGACATGTTTGGTTGAAAACTTG

CH04g0711IICCCTAACCTCAATCCCCAATATGAGGCAGGTGAAGAAGGA

CH04d0212IICGTACGCTGCTTCTTTTGCTCTATCCACCACCCGTCAACT

CH03a0813IITTGGTTTGCTAGGAAAAGAAGGAAGTTTATCGGGCCTACACG

CH03g0414IIATGTCCAATGTAGACACGCAACTTGAAGATGGCCTAACCTTGTT

CH02d1115IIAGCGTCCAGAGCAACAGCAACAAAAGCAGATCCGTTGC

CH04f10