ICS65.020.01

CCSB31

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2855—2023

馬鈴薯腐爛莖線蟲的qPCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

CodeofpracticeforqPCRdetectionofditylenchusdestructor

2023-01-28發(fā)布2023-02-28實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2855—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC20）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、鄂爾多斯市農(nóng)牧技術(shù)推廣中心、內(nèi)

蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心、鄂托克前旗農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心。

本文件主要起草人：席先梅、張力群、霍宏麗、陳偉、苗春樂、融曉君、路奇、尤俊文、張曉霞、

賀小勇、孔慶全、張冬梅、田曉燕。

I

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馬鈴薯腐爛莖線蟲的qPCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了利用qPCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲檢測(cè)的試劑、儀器、樣品處理、DNA提取、結(jié)

果記錄和樣品保存等內(nèi)容。

本文件適用于土壤和馬鈴薯植物樣品中腐爛莖線蟲的qPCR檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

NY/T1121.1土壤檢測(cè)第1部分：土壤樣品的采集、處理和儲(chǔ)存

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

腐爛莖線蟲ditylenchusdestructor

腐爛莖線蟲屬于線蟲門（Nematoda）、側(cè)尾腺綱（Secernrntea）、墊刃目（Tylenchida）、?？?/p>

（Anguinidae）、莖線蟲屬（Ditylenchus），是危害馬鈴薯的重要病原線蟲，可引起馬鈴薯葉片黃化、

萎蔫、塊莖干腐等癥狀，導(dǎo)致減產(chǎn)和品質(zhì)降低。參見附錄A。

定量PCRquantitativePCR

定量PCR技術(shù)（quantitativePCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與靶標(biāo)DNA結(jié)合的熒光基團(tuán)，

依據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)初始靶標(biāo)DNA模板量進(jìn)行定量分析的技術(shù)。

根據(jù)熒光信號(hào)來源可分為染料法和探針法。

4試劑和儀器

試劑

4.1.1除特別規(guī)定外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中相關(guān)規(guī)定。

4.1.2土壤提取緩沖液：1MTris-HCl，0.1MEDTA，1.5MNaCl，2%CTAB，0.1MNaH2PO4/Na2HPO4，

pH=8.0。

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4.1.3CTAB緩沖液：2%CTAB，1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，0.02MEDTA，pH=8.0。E緩沖液：10

mMTris-HCl，1mMEDTA，pH=8.0。

4.1.4TE緩沖液：10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH=8.0。

4.1.5其他試劑包括Tris飽和酚（pH=7.8），氯仿，異丙醇，無水乙醇，70%乙醇，20%SDS，rTaqDNA

聚合酶（5U/μL）及其緩沖液，25mM氯化鎂（MgCl2）溶液，dNTPs溶液（含dATP,dTTP,dCTP,dGTP

各2.5mM），0.1%牛血清蛋白（bovineserumalbumin，BSA）。

儀器

超微量分光光度計(jì)，真空抽干儀，普通天平（感量0.01g），高速離心機(jī)，4℃冰箱，醫(yī)用冰箱（-

20℃），超低溫冰箱（-80℃），制冰機(jī)，水浴鍋，渦旋振蕩儀，磁力攪拌器，高壓滅菌鍋，定量熒

光PCR儀，金屬浴，超凈工作臺(tái)，pH計(jì)，移液器（2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μ

L），土壤取樣器（內(nèi)徑小于等于2cm），研缽及研杵，土壤粉碎機(jī)。

材料

離心管（1.5mL，2mL，50mL），PCR管（200μL），吸頭（10μL，200μL，1000μL），量

筒（50mL）。

5樣品處理及DNA提取

土壤樣品采集、前處理及DNA提取

5.1.1土壤樣品采集

土壤樣品采集方法采用NY/T1121.1。取樣時(shí)應(yīng)使用內(nèi)徑小于等于2cm的土壤取樣器，取樣深度為

15cm～20cm，“W”型取樣15點(diǎn)～20點(diǎn)，每份土樣重量以500g～1000g為宜。

5.1.2土壤樣品前處理

土壤樣品采集后應(yīng)及時(shí)進(jìn)行干燥處理，可于室內(nèi)環(huán)境自然風(fēng)干，風(fēng)干過程中避免陽光直曬和高溫高

濕環(huán)境。此外，土壤樣品也可于干燥箱中（≤40℃）進(jìn)行24h烘干。

去除土壤樣品中的石塊，沙礫，塑料薄膜等成分，保留植物組織，使用土壤粉碎機(jī)破碎干燥土壤樣

品。使用翻拌法對(duì)土壤樣品進(jìn)行混勻，即使用玻璃棒或塑料棒將土樣平鋪于玻璃板或紙張上，用鏟子進(jìn)

行對(duì)角翻拌，重復(fù)20次以上?；靹蚝蟮耐寥罉悠访芊夂笥陉帥龈稍锾幈４妗Ｃ糠輼悠诽幚硗戤吅笮鑼?duì)土

壤粉碎機(jī)，玻璃棒和玻璃板等儀器工具進(jìn)行清洗和消毒以避免樣品間交叉污染。

5.1.3土壤樣品DNA提取

取6.2.2中經(jīng)前處理的土壤樣品，按照四分法進(jìn)行取樣，將土樣平鋪于塑料薄膜或紙張上，呈四方

形，根據(jù)對(duì)角線將土樣分成四份，對(duì)角兩份分別合并為一份，取其中一份繼續(xù)進(jìn)行四分法，直到獲得所

需數(shù)量為止。

每份土樣取3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取10g土樣于50mL離心管中，加入20mL土壤提取緩沖液，渦旋震

蕩使之充分混勻，取1.2mL土壤懸浮液于2mL離心管中，加入300μL20%SDS溶液，渦旋混勻后于65℃

水浴2h，期間每10min顛倒混勻一次，水浴完畢后12000rpm離心5min，取600μL上清于新的2mL離

心管中，加入600μL氯仿，震蕩混勻，12000rpm離心10min，取550μL上清于新的2mL離心管中，

加入550μLTris飽和酚，震蕩混勻，12000rpm離心10min，取500μL上清于新的2mL離心管中，加

入500μL氯仿，震蕩混勻，12000rpm離心10min，取500μL上清于新的1.5mL離心管中，加入350

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μL異丙醇，顛倒混勻后12000rpm離心15min，去上清，加入1mL70%乙醇，顛倒混勻，12000rpm離

心5min，去上清后真空抽干，溶解于100μLTE緩沖液中，進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以實(shí)驗(yàn)室保存的土壤作為陽性對(duì)照。

植物樣品處理及DNA提取

5.2.1植物樣品采集與處理

一塊地取發(fā)病植物根莖基部及塊莖，將樣品保存于4℃冰箱中。DNA提取時(shí)將馬鈴薯植株待測(cè)部位

的組織切成1cm見方小塊，樣品需現(xiàn)用現(xiàn)取。

5.2.2植物樣品DNA提取

每份植物樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)稱取0.2g待測(cè)植物樣品，用液氮研磨成粉末狀，并將粉末盡

可能轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，迅速加入1mLCTAB緩沖液，渦旋混勻后于65℃水浴1h，期間每5min顛倒

混勻一次，水浴完畢后12000rpm離心10min，將上清移至新的2mL離心管中，加入1mL氯仿，震蕩混

勻，12000rpm離心10min，將上清移至新的2mL離心管中，加入1mLTris飽和酚，震蕩混勻，12000

rpm離心10min，將上清移至新的2mL離心管中，加入1mL氯仿，震蕩混勻，12000rpm離心10min，將

上清移至新的2mL離心管中，加入700μL異丙醇，顛倒混勻后12000rpm離心15min，去上清，加入1

mL70%乙醇，顛倒混勻，12000rpm離心5min，去上清后真空抽干，溶解于100μLTE緩沖液中，進(jìn)行

純度和濃度檢測(cè)后于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ詫?shí)驗(yàn)室保存的植株作為陽性對(duì)照。

qPCR檢測(cè)

5.3.1qPCR引物及探針

用于腐爛莖線蟲定量PCR的特異性引物核苷酸序列為：DdF:5’-CACGTCTGATTCAGGGTCGTAAATA-3’；

DdR:5’-AGAAACACGTGCTAGGCCAAAG-3’。

用于腐爛莖線蟲定量PCR的TaqMan探針核苷酸序列為：DdP:5’-FAM-CAGCGGTCCGCACAGG-3’-NFQ-

MGB。

引物擴(kuò)增樣品的ITS區(qū)，擴(kuò)增片段大小為96bp。

5.3.2qPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

腐爛莖線蟲qPCR反應(yīng)體系如表1所示。反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃15s，60℃30s，共45

個(gè)循環(huán)。

反應(yīng)體系中各試劑的量在保持濃度不變的前提下可隨總體積進(jìn)行調(diào)整，也可使用商業(yè)化qPCR試劑

盒，按照說明書進(jìn)行體系配制。

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表1腐爛莖線蟲qPCR反應(yīng)體系（25μL）

組分體積

rTaq(5U/μL)0.5μL

MgCl2(25mM)3μL

10×PCRBuffer(Mg2+free)2.5μL

dNTPs(各2.5mM)2μL

引物DdF(10μM)1μL

引物DdR(10μM)1μL

探針DdP(10μM)1μL

0.1%BSA5μL

DNA模板5μL

ddH2O補(bǔ)至25μL

5.3.3樣品檢測(cè)

根據(jù)6.4.3所述反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，以6.2.3和6.3.2中所提取的土壤樣品和植物樣品DNA原液，10

倍稀釋液或50倍稀釋液為模板，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)技術(shù)重復(fù)。

陽性對(duì)照中添加腐爛莖線蟲基因組DNA為模板，濃度為1ng/μL。

陰性對(duì)照中添加ddH2O作為qPCR反應(yīng)模板。

5.3.4質(zhì)量控制

正常陽性對(duì)照呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線且Ct值小于30，正常陰性對(duì)照無擴(kuò)增信號(hào)，則表明反應(yīng)體系工作

正常，否則應(yīng)重新進(jìn)行檢測(cè)。

5.3.5結(jié)果判定

最小檢測(cè)濃度為每個(gè)反應(yīng)體系5個(gè)靶標(biāo)片段拷貝，在反應(yīng)體系正常工作的前提下，根據(jù)Ct值進(jìn)行結(jié)

果判定：

——待測(cè)樣品DNA原液或任一濃度稀釋液檢測(cè)結(jié)果Ct＜35，判定該樣品中檢出腐爛莖線蟲；

——待測(cè)樣品DNA原液及所有稀釋液檢測(cè)結(jié)果均為Ct≥40，判定該樣品中未檢出腐爛莖線蟲；

——待測(cè)樣品DNA原液及稀釋液檢測(cè)所得最小Ct值范圍為35≤Ct＜40時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)

果仍為Ct＜40并有明顯的對(duì)數(shù)擴(kuò)增期，則判定該樣品中可檢出腐爛莖線蟲，否則該樣品中

未檢出腐爛莖線蟲。

6結(jié)果記錄

樣品檢測(cè)結(jié)果記錄入馬鈴薯腐爛莖線蟲樣品檢測(cè)結(jié)果記錄表格（見表2）。

表2馬鈴薯莖線蟲樣品檢測(cè)結(jié)果記錄表格

樣品編號(hào)樣品名稱采樣時(shí)間采樣地點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

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7樣品保存

所有樣品需至少妥善保存6個(gè)月。如馬鈴薯腐爛莖線蟲檢測(cè)結(jié)果為陽性，該樣品至少保存1年，以備

后續(xù)研究和生產(chǎn)需要。保存期滿后，馬鈴薯腐爛莖線蟲檢測(cè)陽性的樣本經(jīng)高壓蒸汽滅菌后丟棄。

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A

A

附錄A

（資料性）

馬鈴薯腐爛莖線蟲的主要形態(tài)特征、生物學(xué)特性及危害

A.1主要形態(tài)特征

線蟲蟲體呈線型且細(xì)長(zhǎng)，兩端稍尖，尾部狹小圓錐形（見圖A.1-B、E），線蟲唇區(qū)低平，口針細(xì)小

（見圖A.1-A），長(zhǎng)度約為10μm～14μm，食道腺?gòu)谋趁媛愿采w到腸的前端，雌蟲陰門清晰稍突起，

后陰子宮囊較長(zhǎng)，常延伸到肛陰距的3/4處（見圖A.1-C）；雄蟲交合刺略向腹面彎曲，基部膨大；交合

傘從交合刺前端的水平處向后延伸至尾長(zhǎng)的1/3處（見圖A.1-B）。

圖A.1馬鈴薯腐爛莖線蟲形態(tài)特征

A.2生物學(xué)特性

該線蟲可在5℃～34℃下發(fā)育繁殖，最適溫度為20℃～27℃。在27℃～28℃下完成生活史需

要18d，20℃～24℃時(shí)需要20d～26d，在6℃～10℃時(shí)需要68d高溫在35℃以上即停止活動(dòng)，

42℃干熱處理24h或49℃溫水浸泡10min則全部死亡