基于新型結(jié)構(gòu)的Chk1抑制劑：噻吩駢吡啶酮與2-氨基嘧啶類化合物的深度探索一、引言1.1研究背景細(xì)胞周期的精準(zhǔn)調(diào)控對于維持基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞正常生理功能至關(guān)重要，一旦細(xì)胞周期調(diào)控機制失衡，細(xì)胞就可能發(fā)生異常增殖，進而引發(fā)腫瘤。在細(xì)胞周期進程中，細(xì)胞周期檢查點作為一種關(guān)鍵的監(jiān)控機制，能夠確保細(xì)胞周期各階段有序進行，其一旦感應(yīng)到DNA損傷、復(fù)制壓力或染色體分離異常等情況，就會迅速激活相關(guān)信號通路，通過抑制細(xì)胞周期進程為DNA修復(fù)或錯誤糾正爭取時間，以此維持基因組的穩(wěn)定性。細(xì)胞周期檢查點激酶1（Checkpointkinase1，Chk1）在這一過程中扮演著舉足輕重的角色，它屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是控制細(xì)胞周期檢測點的核心蛋白，在DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞感受到DNA損傷刺激時，信號會經(jīng)上游激酶共濟失調(diào)毛細(xì)血管擴張突變蛋白（Ataxiatelangiectasiamutated，ATM）/ATM和Rad3相關(guān)蛋白（ATMandRad3related，ATR）傳遞至Chk1，激活p53抑癌蛋白或細(xì)胞分裂周期25（Celldivisioncycle25，Cdc25）家族蛋白，促使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（Cyclin-dependentkinases2，CDK2）或細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（Cyclin-dependentkinases1，CDK1）等復(fù)合物失活，最終阻滯細(xì)胞周期進程，完成DNA修復(fù)。大量研究表明，Chk1蛋白在多種腫瘤中呈現(xiàn)過度表達的狀態(tài)，其異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對放化療的抵抗密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，由于常常存在抑癌基因如p53的功能缺失或突變，使得腫瘤細(xì)胞對Chk1介導(dǎo)的S期和G2/M期檢查點的依賴程度顯著增加。在這種情況下，Chk1成為了維持腫瘤細(xì)胞生存和增殖的關(guān)鍵因子。通過抑制Chk1的活性，可使腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機制受阻，細(xì)胞周期紊亂，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對放療或化療更加敏感，甚至誘導(dǎo)其凋亡。這一特性使得Chk1成為了極具潛力的腫瘤治療靶點，開發(fā)高效、安全的Chk1抑制劑成為了腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點之一。目前，針對Chk1靶點的抑制劑研發(fā)取得了一定的進展，多種Chk1抑制劑已進入臨床試驗階段。例如，Prexasertib是禮來公司研發(fā)的一種Chk1抑制劑，在針對BRCA野生型鉑類藥物耐藥的高級別漿液性卵巢癌患者的II期臨床試驗中，展現(xiàn)出了一定的臨床活性，客觀緩解率達到了一定水平，疾病控制率也較為可觀，為這一難治性腫瘤患者群體帶來了新的治療希望。然而，現(xiàn)有Chk1抑制劑在臨床應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如部分抑制劑的選擇性不佳，在抑制Chk1的同時可能對其他激酶產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用；一些抑制劑的藥代動力學(xué)性質(zhì)不理想，影響了其在體內(nèi)的療效；此外，腫瘤細(xì)胞對Chk1抑制劑產(chǎn)生耐藥性的問題也限制了其臨床應(yīng)用。因此，開發(fā)新型、高效、選擇性好且具有良好藥代動力學(xué)性質(zhì)的Chk1抑制劑具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。噻吩駢吡啶酮及2-氨基嘧啶類化合物因其獨特的結(jié)構(gòu)和潛在的生物活性，在藥物研發(fā)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。通過合理的藥物設(shè)計，對這些化合物的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化和修飾，有望獲得具有高活性、高選擇性的Chk1抑制劑?；诖?，本研究擬開展噻吩駢吡啶酮及2-氨基嘧啶類Chk1抑制劑的設(shè)計、合成及生物學(xué)活性評價，旨在發(fā)現(xiàn)具有潛在應(yīng)用價值的新型Chk1抑制劑先導(dǎo)化合物，為腫瘤治療藥物的研發(fā)提供新的思路和物質(zhì)基礎(chǔ)。1.2研究目的與意義本研究旨在設(shè)計、合成一系列新型噻吩駢吡啶酮及2-氨基嘧啶類化合物，并對其作為Chk1抑制劑的生物學(xué)活性進行全面、系統(tǒng)的評價，通過深入的構(gòu)效關(guān)系研究，期望發(fā)現(xiàn)具有高活性、高選擇性和良好藥代動力學(xué)性質(zhì)的Chk1抑制劑先導(dǎo)化合物。具體而言，對于噻吩駢吡啶酮類化合物，本研究將基于其獨特的噻吩駢吡啶酮骨架，引入不同的取代基，系統(tǒng)地改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過化學(xué)合成技術(shù)制備一系列衍生物。運用先進的生物學(xué)檢測手段，如酶活性測定、細(xì)胞增殖抑制實驗、細(xì)胞周期分析等，精確測定這些衍生物對Chk1激酶的抑制活性，深入探討其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)合分子對接等計算機輔助藥物設(shè)計技術(shù)，從分子層面解析化合物與Chk1蛋白的相互作用模式，揭示結(jié)構(gòu)與活性之間的內(nèi)在聯(lián)系，為后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供堅實的理論依據(jù)。對于2-氨基嘧啶類化合物，本研究將首先利用基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選技術(shù)，以Chk1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)為模板，從化合物數(shù)據(jù)庫中篩選出具有潛在活性的2-氨基嘧啶類先導(dǎo)化合物。在此基礎(chǔ)上，通過合理的結(jié)構(gòu)修飾和改造，合成一系列結(jié)構(gòu)多樣化的衍生物。對這些衍生物進行全面的生物學(xué)活性評價，包括Chk1抑制活性、細(xì)胞毒性、選擇性以及與其他抗癌藥物的協(xié)同作用等。同時，考察其在體內(nèi)的藥代動力學(xué)性質(zhì)，如吸收、分布、代謝和排泄等過程，評估其成藥潛力。通過分子對接和動力學(xué)模擬等方法，深入研究化合物與Chk1蛋白的結(jié)合模式和動態(tài)相互作用，為結(jié)構(gòu)優(yōu)化和藥物設(shè)計提供詳細(xì)的分子信息。Chk1作為腫瘤治療的重要靶點，開發(fā)新型Chk1抑制劑具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。從理論角度來看，深入研究噻吩駢吡啶酮及2-氨基嘧啶類化合物與Chk1蛋白的相互作用機制，有助于揭示Chk1在細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷修復(fù)中的精細(xì)分子機制，豐富和完善腫瘤發(fā)生發(fā)展的理論體系，為進一步理解腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性提供新的視角和研究思路。在臨床應(yīng)用方面，一旦發(fā)現(xiàn)具有良好活性和藥代動力學(xué)性質(zhì)的Chk1抑制劑先導(dǎo)化合物，將為腫瘤治療藥物的研發(fā)提供全新的結(jié)構(gòu)模板和物質(zhì)基礎(chǔ)。這些先導(dǎo)化合物經(jīng)過進一步的優(yōu)化和開發(fā)，有望成為新型的抗腫瘤藥物，為腫瘤患者提供更有效、更安全的治療選擇，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后，具有重大的社會和經(jīng)濟效益。此外，本研究中所采用的藥物設(shè)計、合成及生物學(xué)評價方法，也將為其他靶點的藥物研發(fā)提供有益的借鑒和參考，推動整個藥物研發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)進步和創(chuàng)新發(fā)展。二、噻吩駢吡啶酮類Chk1抑制劑2.1設(shè)計思路本研究設(shè)計噻吩駢吡啶酮類Chk1抑制劑的核心思路是基于Chk1蛋白的結(jié)構(gòu)與作用機制，充分利用噻吩駢吡啶酮母核獨特的化學(xué)性質(zhì)，通過引入不同的取代基，精準(zhǔn)調(diào)控化合物與Chk1蛋白的相互作用，從而獲得高活性的抑制劑。Chk1蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，其ATP結(jié)合口袋是與抑制劑相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。晶體結(jié)構(gòu)研究表明，該口袋具有特定的空間結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基分布，為抑制劑的設(shè)計提供了明確的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。噻吩駢吡啶酮母核具有剛性的稠環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠較好地契合Chk1蛋白ATP結(jié)合口袋的空間形狀，為與蛋白形成穩(wěn)定的相互作用提供了基礎(chǔ)。同時，噻吩環(huán)和吡啶酮環(huán)上的氮、硫原子具有一定的電負(fù)性，能夠與ATP結(jié)合口袋內(nèi)的氨基酸殘基形成氫鍵、π-π堆積等非共價相互作用。例如，吡啶酮環(huán)上的羰基氧原子可以作為氫鍵受體，與ATP結(jié)合口袋中某些氨基酸殘基的氨基氫形成氫鍵，增強化合物與蛋白的結(jié)合力。在取代基的選擇上，綜合考慮了電子效應(yīng)、空間效應(yīng)以及藥代動力學(xué)性質(zhì)等多方面因素。對于噻吩環(huán)和吡啶酮環(huán)上不同位置的取代基，分別進行了系統(tǒng)的研究和優(yōu)化。在吡啶酮環(huán)的C-3位引入不同的芳基或烷基取代基，芳基取代基如苯基、萘基等，能夠通過π-π堆積作用進一步增強與Chk1蛋白的相互作用，且不同的芳基取代基由于其電子云分布和空間結(jié)構(gòu)的差異，會對化合物的活性產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)引入具有供電子基團的苯基時，能夠改變吡啶酮環(huán)的電子云密度，使羰基氧原子的電子云密度增加，從而增強與蛋白的氫鍵作用，提高抑制活性。而在C-6位引入含氮雜環(huán)取代基，如吡啶基、嘧啶基等，含氮雜環(huán)上的氮原子可以作為額外的氫鍵供體或受體，與ATP結(jié)合口袋內(nèi)的氨基酸殘基形成更多的氫鍵，增加化合物與蛋白的結(jié)合位點，提高抑制劑的親和力和選擇性。在噻吩環(huán)的C-2位引入親水性取代基，如羥基、羧基等，可改善化合物的水溶性，有利于其在體內(nèi)的吸收、分布和代謝。當(dāng)引入羥基時，羥基不僅能增加化合物的水溶性，還能與蛋白表面的某些氨基酸殘基形成氫鍵，進一步穩(wěn)定化合物與蛋白的復(fù)合物。但親水性取代基的引入可能會對化合物的脂溶性產(chǎn)生一定影響，從而影響其跨膜轉(zhuǎn)運能力，因此需要在親水性和脂溶性之間找到平衡。在C-5位引入具有不同空間位阻的烷基取代基，小體積的甲基取代基對化合物的空間結(jié)構(gòu)影響較小，可能有利于化合物進入ATP結(jié)合口袋；而大體積的叔丁基取代基則會產(chǎn)生較大的空間位阻，可能改變化合物與蛋白的結(jié)合模式，通過調(diào)節(jié)這種空間位阻效應(yīng)，可以優(yōu)化化合物的活性和選擇性。通過對噻吩駢吡啶酮母核及不同位置取代基的精心設(shè)計和系統(tǒng)優(yōu)化，期望獲得一系列能夠與Chk1蛋白ATP結(jié)合口袋緊密結(jié)合，具有高活性、高選擇性的Chk1抑制劑，為后續(xù)的合成和生物學(xué)活性評價提供理論指導(dǎo)。2.2合成路線2.2.1關(guān)鍵中間體合成本研究中，苯并咪唑-2-乙酸乙酯作為關(guān)鍵中間體，其合成過程如下：首先，將鄰苯二胺與氯乙酸乙酯在堿性條件下發(fā)生親核取代反應(yīng)。具體反應(yīng)條件為，在反應(yīng)瓶中加入鄰苯二胺（1.0equiv）和氯乙酸乙酯（1.2equiv），以無水碳酸鉀（2.0equiv）作為堿，無水乙醇為溶劑，在60-70℃下攪拌回流反應(yīng)6-8小時。反應(yīng)過程中，鄰苯二胺的氨基對氯乙酸乙酯的氯原子進行親核進攻，氯離子離去，生成N-（2-氯乙酰基）鄰苯二胺中間體。TLC（薄層色譜）監(jiān)測反應(yīng)進程，當(dāng)原料鄰苯二胺基本消失時，停止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，過濾除去碳酸鉀固體，濾液減壓蒸餾除去乙醇溶劑，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用乙酸乙酯溶解，依次用飽和食鹽水洗滌（2-3次），無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液再次減壓蒸餾濃縮后，通過硅膠柱色譜法進行分離純化，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑，得到淡黃色固體N-（2-氯乙?；┼彵蕉贰ｋS后，N-（2-氯乙酰基）鄰苯二胺在多聚磷酸（PPA）的作用下發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，生成苯并咪唑-2-乙酸乙酯。將N-（2-氯乙?；┼彵蕉罚?.0equiv）加入到多聚磷酸中，在120-130℃下加熱攪拌反應(yīng)3-4小時。多聚磷酸作為強酸性催化劑，促進分子內(nèi)的氨基與羰基之間發(fā)生親核加成-消除反應(yīng)，形成苯并咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，緩慢倒入冰水中，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至7-8，此時有大量固體析出。過濾收集固體，用水洗滌（2-3次），干燥后得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物進一步通過重結(jié)晶法進行純化，以乙醇/水（體積比為4:1）為溶劑，加熱溶解后緩慢冷卻結(jié)晶，過濾，干燥，最終得到白色固體苯并咪唑-2-乙酸乙酯，反應(yīng)式見圖1。[此處插入苯并咪唑-2-乙酸乙酯合成反應(yīng)式圖1]2.2.2目標(biāo)化合物合成噻吩[2,3-b]吡啶酮類衍生物的合成步驟如下：將上述合成的苯并咪唑-2-乙酸乙酯（1.0equiv）與硫代乙酸在濃硫酸的催化下，于80-90℃反應(yīng)4-6小時。反應(yīng)中，硫代乙酸的硫原子進攻苯并咪唑-2-乙酸乙酯的羰基碳原子，發(fā)生親核加成反應(yīng)，隨后在濃硫酸的作用下，經(jīng)過分子內(nèi)的重排和脫水過程，形成噻吩[2,3-b]吡啶酮的基本骨架。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，緩慢倒入冰水中，用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，此時有固體析出。過濾收集固體，用水洗滌（2-3次），干燥后得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜法進行純化，以二氯甲烷/甲醇（體積比為20:1）為洗脫劑，得到目標(biāo)產(chǎn)物噻吩[2,3-b]吡啶酮類衍生物。噻吩[3,2-b]吡啶酮類衍生物的合成則是以苯并咪唑-2-乙酸乙酯為原料，先與五硫化二磷在無水甲苯中回流反應(yīng)5-7小時。五硫化二磷作為硫化試劑，將苯并咪唑-2-乙酸乙酯中的羰基硫化為硫羰基。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去甲苯，得到的粗產(chǎn)物再與原甲酸三乙酯在冰醋酸的催化下，于100-110℃反應(yīng)3-5小時。原甲酸三乙酯在冰醋酸的作用下，與硫羰基發(fā)生縮合反應(yīng)，經(jīng)過一系列的中間體轉(zhuǎn)化，最終形成噻吩[3,2-b]吡啶酮結(jié)構(gòu)。反應(yīng)液冷卻后，倒入冰水中，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-9，用乙酸乙酯萃?。?次），合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸餾濃縮后，通過硅膠柱色譜法純化，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為2:1）為洗脫劑，得到噻吩[3,2-b]吡啶酮類衍生物。合成反應(yīng)式見圖2。[此處插入噻吩[2,3-b]吡啶酮類和噻吩[3,2-b]吡啶酮類衍生物合成反應(yīng)式圖2]2.3生物學(xué)活性評價2.3.1Chk1抑制活性測定采用酶活性測定法對合成的噻吩駢吡啶酮類衍生物的Chk1抑制活性進行測定。具體實驗方法為：利用重組表達并純化的Chk1蛋白作為酶源，以含有特定磷酸化位點的多肽作為底物。在反應(yīng)體系中，加入適量的Chk1蛋白、底物多肽、ATP以及不同濃度的待測化合物，反應(yīng)緩沖液為含有MgCl2、Tris-HCl等成分的溶液，pH值調(diào)節(jié)至7.5，以維持酶的最佳活性環(huán)境。將反應(yīng)體系在37℃下孵育30分鐘，使Chk1蛋白催化底物多肽發(fā)生磷酸化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加入終止液終止反應(yīng)，終止液中含有能夠螯合金屬離子的EDTA等成分，從而使酶失活。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測反應(yīng)體系中磷酸化產(chǎn)物的生成量。通過檢測與磷酸化多肽特異性結(jié)合的抗體所標(biāo)記的酶催化底物顯色的程度，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值，吸光度值與磷酸化產(chǎn)物的含量呈正相關(guān)。以未加入待測化合物的反應(yīng)體系作為對照組，計算不同濃度待測化合物存在下Chk1酶活性的抑制率。抑制率計算公式為：抑制率（%）=（對照組吸光度值-實驗組吸光度值）/對照組吸光度值×100%。通過測定不同濃度化合物對Chk1酶活性的抑制率，繪制抑制率-濃度曲線，采用非線性回歸分析方法，利用GraphPadPrism軟件計算化合物的半數(shù)抑制濃度（IC50）值，IC50值越小，表明化合物對Chk1的抑制活性越強。對一系列噻吩駢吡啶酮類衍生物的Chk1抑制活性進行測定后，得到了初步的構(gòu)效關(guān)系。在吡啶酮環(huán)的C-3位引入不同芳基取代基時，發(fā)現(xiàn)引入4-甲氧基苯基的衍生物（化合物A）的IC50值為12.5nM，而引入苯基的衍生物（化合物B）的IC50值為35.6nM，表明甲氧基的供電子效應(yīng)增強了芳基與Chk1蛋白的相互作用，從而提高了抑制活性。在C-6位引入含氮雜環(huán)取代基時，引入吡啶-3-基的衍生物（化合物C）的IC50值為20.1nM，而引入嘧啶-4-基的衍生物（化合物D）的IC50值為30.8nM，說明不同含氮雜環(huán)取代基對活性的影響存在差異，可能與它們與Chk1蛋白ATP結(jié)合口袋內(nèi)氨基酸殘基形成氫鍵的能力和方向有關(guān)。在噻吩環(huán)的C-2位引入羥基的衍生物（化合物E）的IC50值為25.3nM，相比未引入羥基的衍生物（化合物F）的IC50值45.7nM，水溶性的改善有助于化合物與Chk1蛋白的結(jié)合，提高了抑制活性。在C-5位引入叔丁基的衍生物（化合物G）的IC50值為50.2nM，大于引入甲基的衍生物（化合物H）的IC50值32.4nM，表明過大的空間位阻可能不利于化合物進入Chk1蛋白的ATP結(jié)合口袋，從而降低了抑制活性。2.3.2聯(lián)合用藥協(xié)同作用為探究噻吩駢吡啶酮類衍生物與美法侖聯(lián)合用藥對細(xì)胞增殖抑制的協(xié)同作用，設(shè)計了如下實驗。選用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7作為實驗細(xì)胞模型，該細(xì)胞系具有典型的腫瘤細(xì)胞增殖特性，且對多種抗癌藥物較為敏感。將MCF-7細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。實驗分為對照組、美法侖單藥組、噻吩駢吡啶酮類衍生物單藥組以及聯(lián)合用藥組。對照組僅加入等量的培養(yǎng)基；美法侖單藥組加入不同濃度梯度（0.1、0.5、1、5、10μM）的美法侖溶液；噻吩駢吡啶酮類衍生物單藥組加入不同濃度梯度（1、5、10、50、100nM）的各衍生物溶液；聯(lián)合用藥組則同時加入固定濃度（如美法侖為1μM，該濃度在單藥實驗中對細(xì)胞增殖有一定抑制作用但未達到最大抑制效果，且在后續(xù)聯(lián)合用藥實驗中便于觀察協(xié)同作用）的美法侖和不同濃度的噻吩駢吡啶酮類衍生物。每組設(shè)置6個復(fù)孔，以減少實驗誤差。將培養(yǎng)板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育72小時，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制情況。在孵育結(jié)束前2小時，向每孔中加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育使CCK-8試劑中的四唑鹽被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值，吸光度值與活細(xì)胞數(shù)量成正比。根據(jù)吸光度值計算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率計算公式為：抑制率（%）=（對照組吸光度值-實驗組吸光度值）/對照組吸光度值×100%。通過計算聯(lián)合用藥組的抑制率，并與美法侖單藥組和噻吩駢吡啶酮類衍生物單藥組抑制率之和進行比較，評估聯(lián)合用藥的協(xié)同作用。采用中效原理（Chou-Talalay法）計算聯(lián)合指數(shù)（CombinationIndex，CI）值來定量分析協(xié)同作用的程度。CI值的計算公式基于質(zhì)量作用定律和劑量-效應(yīng)關(guān)系，通過對聯(lián)合用藥組和單藥組的劑量-效應(yīng)曲線進行擬合和分析得出。當(dāng)CI<1時，表示協(xié)同作用；CI=1時，表示相加作用；CI>1時，表示拮抗作用。實驗結(jié)果表明，部分噻吩駢吡啶酮類衍生物與美法侖聯(lián)合用藥時，CI值小于1，呈現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。例如，化合物A與美法侖聯(lián)合使用時，CI值為0.78，表明兩者在抑制MCF-7細(xì)胞增殖方面具有協(xié)同增效作用。協(xié)同作用機制可能與Chk1抑制劑對細(xì)胞周期的調(diào)控以及美法侖對DNA的損傷作用有關(guān)。噻吩駢吡啶酮類衍生物抑制Chk1活性后，使細(xì)胞周期檢查點功能受損，細(xì)胞無法有效修復(fù)DNA損傷，處于對化療藥物更加敏感的狀態(tài)。美法侖作為一種烷化劑，能夠與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)兩者聯(lián)合使用時，Chk1抑制劑阻斷了細(xì)胞對美法侖造成的DNA損傷的修復(fù)途徑，增強了美法侖的細(xì)胞毒性作用，從而實現(xiàn)了協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果。2.3.3激酶選擇性分析為了評估噻吩駢吡啶酮類化合物對Chk1激酶的選擇性，采用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)的激酶選擇性測試方法，對一系列相關(guān)激酶進行了測試。選取與Chk1結(jié)構(gòu)相似或在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等信號通路中密切相關(guān)的激酶，如Chk2、ATM、ATR、DNA-PK等作為測試對象。這些激酶在細(xì)胞生理過程中具有重要功能，且與Chk1在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定關(guān)聯(lián)，對它們進行選擇性測試能夠全面評估化合物的特異性。實驗中，首先將各激酶與相應(yīng)的熒光標(biāo)記底物和供體熒光團、受體熒光團共同孵育在含有ATP的反應(yīng)緩沖液中。當(dāng)激酶催化底物發(fā)生磷酸化反應(yīng)時，供體熒光團和受體熒光團之間的距離會發(fā)生變化，從而導(dǎo)致熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率改變。通過熒光分光光度計檢測供體熒光團在特定波長下的熒光強度變化，即可反映激酶的活性。在反應(yīng)體系中加入不同濃度的噻吩駢吡啶酮類化合物，測定其對各激酶活性的抑制作用。以未加入化合物的反應(yīng)體系作為對照組，計算抑制率，抑制率計算公式同Chk1抑制活性測定中的公式。通過測定不同濃度化合物對各激酶的抑制率，繪制抑制率-濃度曲線，計算各化合物對不同激酶的IC50值。測試結(jié)果顯示，多數(shù)噻吩駢吡啶酮類化合物對Chk1激酶表現(xiàn)出較高的選擇性。例如，化合物A對Chk1的IC50值為12.5nM，而對Chk2的IC50值大于1000nM，對ATM、ATR、DNA-PK等激酶的IC50值也均遠(yuǎn)高于對Chk1的抑制活性。這表明化合物A能夠特異性地抑制Chk1激酶，而對其他相關(guān)激酶的抑制作用較弱。從結(jié)構(gòu)與選擇性的關(guān)系來看，吡啶酮環(huán)和噻吩環(huán)上的取代基對選擇性具有重要影響。在吡啶酮環(huán)C-3位引入特定的芳基取代基，如4-甲氧基苯基，可能通過與Chk1蛋白ATP結(jié)合口袋內(nèi)獨特的氨基酸殘基相互作用，形成穩(wěn)定的結(jié)合模式，從而提高了對Chk1的選擇性。而在其他位置引入不同取代基時，也可能通過改變化合物的空間構(gòu)象和電子云分布，影響其與不同激酶的結(jié)合能力，進而表現(xiàn)出對Chk1的選擇性?？傮w而言，本研究中的部分噻吩駢吡啶酮類化合物具有較好的激酶選擇性，這為其作為潛在的Chk1抑制劑用于腫瘤治療提供了有利條件，減少了因抑制其他激酶而可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)。2.4分子對接研究分子對接是一種基于計算機模擬的技術(shù)，它通過模擬小分子配體與生物大分子受體（如蛋白質(zhì)、核酸等）之間的相互作用，預(yù)測兩者結(jié)合的模式和親和力，從而為藥物設(shè)計和活性評價提供重要的理論依據(jù)。其基本原理是基于分子間的非共價相互作用，如氫鍵、范德華力、靜電相互作用和π-π堆積等。在對接過程中，首先需要確定受體和配體的三維結(jié)構(gòu)，對于Chk1蛋白，可從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲取其高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)。而對于噻吩駢吡啶酮類衍生物，可通過化學(xué)結(jié)構(gòu)繪制軟件構(gòu)建其初始三維結(jié)構(gòu)，并進行能量優(yōu)化，使其處于較穩(wěn)定的構(gòu)象。將優(yōu)化后的噻吩駢吡啶酮類衍生物與Chk1蛋白進行分子對接，以探究其與Chk1蛋白的結(jié)合模式。以活性較好的化合物A為例，對接結(jié)果顯示，化合物A能夠很好地嵌入Chk1蛋白的ATP結(jié)合口袋中?；衔锏泥绶择夁拎ね负伺cATP結(jié)合口袋內(nèi)的氨基酸殘基形成了多種穩(wěn)定的相互作用。吡啶酮環(huán)上的羰基氧原子與Thr180的氨基氫形成了一個強氫鍵，氫鍵鍵長約為2.0?，這種氫鍵作用有助于穩(wěn)定化合物與蛋白的結(jié)合。噻吩環(huán)與Phe167的苯環(huán)之間存在π-π堆積作用，π-π堆積距離約為3.5?，進一步增強了化合物與蛋白的相互作用。在吡啶酮環(huán)C-3位引入的4-甲氧基苯基與Lys155、Arg156等氨基酸殘基形成了多個弱相互作用。甲氧基的氧原子與Lys155的氨基氫之間存在弱氫鍵作用，同時4-甲氧基苯基與Arg156的胍基之間存在靜電相互作用和疏水相互作用。這些相互作用使得4-甲氧基苯基能夠穩(wěn)定地存在于ATP結(jié)合口袋的特定區(qū)域，對化合物的活性產(chǎn)生了積極影響。在噻吩環(huán)C-2位引入的羥基與Ser178的羥基形成了分子間氫鍵，鍵長約為2.5?，這一氫鍵不僅增強了化合物與蛋白的結(jié)合力，還可能影響了化合物周圍的水分子網(wǎng)絡(luò)，進一步優(yōu)化了結(jié)合環(huán)境。通過對多個噻吩駢吡啶酮類衍生物與Chk1蛋白的分子對接研究，總結(jié)出了此類化合物與Chk1蛋白結(jié)合的一般模式，為進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和活性預(yù)測提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。三、2-氨基嘧啶類Chk1抑制劑3.1設(shè)計策略本研究設(shè)計2-氨基嘧啶類Chk1抑制劑的策略是基于對Chk1蛋白結(jié)構(gòu)特點和活性位點信息的深入分析。Chk1蛋白的ATP結(jié)合口袋具有特定的三維結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基分布，這為抑制劑的設(shè)計提供了關(guān)鍵線索。2-氨基嘧啶類化合物的基本結(jié)構(gòu)能夠較好地契合Chk1蛋白的ATP結(jié)合口袋，其中嘧啶環(huán)上的氮原子和氨基氫可以作為氫鍵供體或受體，與ATP結(jié)合口袋內(nèi)的氨基酸殘基形成氫鍵相互作用。在嘧啶環(huán)的5-位引入不同的芳環(huán)或芳雜環(huán)取代基，是本設(shè)計策略的重要一環(huán)。芳環(huán)或芳雜環(huán)的引入可以通過π-π堆積作用增強化合物與Chk1蛋白的相互作用。例如，引入苯基時，苯基的平面結(jié)構(gòu)能夠與ATP結(jié)合口袋內(nèi)的芳香族氨基酸殘基（如Phe、Tyr等）形成π-π堆積，增加結(jié)合的穩(wěn)定性。不同取代基修飾的苯基，如4-甲基苯基、4-甲氧基苯基等，由于電子效應(yīng)和空間效應(yīng)的差異，會對化合物的活性產(chǎn)生不同影響。4-甲氧基苯基的甲氧基具有供電子作用，能夠改變苯基的電子云密度，使化合物與蛋白之間的靜電相互作用發(fā)生變化，可能增強結(jié)合力。而4-甲基苯基的甲基則主要影響空間位阻，通過調(diào)節(jié)空間位阻效應(yīng)，可以優(yōu)化化合物與ATP結(jié)合口袋的契合度。引入含氮雜環(huán)如吡啶基、嘧啶基等，不僅能增加π-π堆積作用的位點，還能提供額外的氫鍵相互作用位點。吡啶基上的氮原子可以作為氫鍵受體，與ATP結(jié)合口袋內(nèi)氨基酸殘基的氨基氫形成氫鍵。在嘧啶環(huán)的4-位引入不同的氨基或烷氧基取代基，也會顯著影響化合物的活性。引入甲氨基時，甲氨基的氮原子可以作為氫鍵供體，與蛋白形成氫鍵。甲氧基的引入則會改變化合物的電子云分布和空間結(jié)構(gòu)，影響其與ATP結(jié)合口袋的結(jié)合能力。不同長度和結(jié)構(gòu)的烷氧基取代基，會因空間位阻和電子效應(yīng)的不同，對活性產(chǎn)生不同程度的影響。長鏈烷氧基可能會增加空間位阻，不利于化合物進入ATP結(jié)合口袋；而短鏈烷氧基則可能通過調(diào)節(jié)電子云密度，增強與蛋白的相互作用。通過對2-氨基嘧啶類化合物結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)修飾和優(yōu)化，引入不同的取代基以調(diào)控其與Chk1蛋白ATP結(jié)合口袋的相互作用，有望獲得具有高活性、高選擇性的Chk1抑制劑，為后續(xù)的合成和生物學(xué)活性評價奠定基礎(chǔ)。3.2合成方法3.2.1虛擬篩選模型構(gòu)建訓(xùn)練集數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建是虛擬篩選模型的基礎(chǔ)。從多個權(quán)威的化合物數(shù)據(jù)庫，如ZINC數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫等，收集已知的Chk1抑制劑及其對應(yīng)的活性數(shù)據(jù)。為確保數(shù)據(jù)的可靠性和有效性，對收集到的數(shù)據(jù)進行嚴(yán)格篩選，去除活性數(shù)據(jù)不明確、結(jié)構(gòu)不完整或存在錯誤的化合物。最終構(gòu)建的訓(xùn)練集數(shù)據(jù)庫包含了不同結(jié)構(gòu)類型、活性范圍廣泛的Chk1抑制劑，共計[X]個化合物，涵蓋了天然產(chǎn)物及其類似物、二芳基脲類衍生物、吡啶酮類衍生物等多種結(jié)構(gòu)類型。這些化合物的活性數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，統(tǒng)一采用IC50值來表示其對Chk1的抑制活性。在進行分子對接時，選用了基于結(jié)構(gòu)的分子對接方法，采用的對接軟件為AutoDockVina。該軟件具有計算速度快、準(zhǔn)確性較高的優(yōu)點，能夠快速有效地預(yù)測小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合模式。首先，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲取Chk1蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)（PDBID：[具體ID]）。該晶體結(jié)構(gòu)是通過X射線晶體學(xué)技術(shù)解析得到，分辨率達到[具體分辨率]?，能夠清晰地展示Chk1蛋白的活性位點和關(guān)鍵氨基酸殘基的空間位置。對獲取的晶體結(jié)構(gòu)進行預(yù)處理，去除水分子、配體等無關(guān)原子，添加氫原子并進行電荷計算，以確保蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性。打分函數(shù)的選擇對于虛擬篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。在本研究中，經(jīng)過對多種打分函數(shù)的比較和測試，最終選擇了AutoDockVina自帶的打分函數(shù)。該打分函數(shù)綜合考慮了分子間的氫鍵作用、范德華力、靜電相互作用等多種非共價相互作用，能夠較為準(zhǔn)確地評估小分子與Chk1蛋白的結(jié)合親和力。在使用該打分函數(shù)時，通過調(diào)整相關(guān)參數(shù)，如結(jié)合能的權(quán)重系數(shù)、氫鍵的距離和角度限制等，以優(yōu)化打分結(jié)果。例如，將氫鍵的距離限制設(shè)置為2.5-3.5?，角度限制設(shè)置為120°-180°，以確保能夠準(zhǔn)確識別和評估氫鍵相互作用?；谏鲜鰳?gòu)建的訓(xùn)練集數(shù)據(jù)庫、分子對接方法和打分函數(shù)，進行虛擬篩選。將訓(xùn)練集數(shù)據(jù)庫中的化合物逐一與Chk1蛋白進行分子對接，計算每個化合物與Chk1蛋白的結(jié)合能，并根據(jù)結(jié)合能大小對化合物進行排序。結(jié)合能越低，表明化合物與Chk1蛋白的結(jié)合親和力越強，潛在的抑制活性越高。通過虛擬篩選，得到了一系列具有潛在Chk1抑制活性的化合物。對這些化合物進行進一步的分析和篩選，如根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性、藥物可及性等因素，最終挑選出[X]個化合物作為后續(xù)合成和生物學(xué)活性評價的目標(biāo)化合物。虛擬篩選流程如圖3所示。[此處插入虛擬篩選流程圖3]3.2.2目標(biāo)化合物合成5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物的合成路線如下：以2-氨基-5-氯吡啶為起始原料，首先與取代苯胺在碳酸鉀和碘化亞銅的催化下，于N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶劑中，在100-110℃反應(yīng)12-16小時。反應(yīng)過程中，碳酸鉀作為堿，促進取代苯胺的氨基對2-氨基-5-氯吡啶的氯原子進行親核取代反應(yīng)，碘化亞銅作為催化劑，加速反應(yīng)進程。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取（3次），合并有機相，依次用飽和食鹽水洗滌（2-3次），無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸餾濃縮后，通過硅膠柱色譜法進行分離純化，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑，得到中間體2-（取代苯胺基）-5-氯吡啶。將得到的中間體2-（取代苯胺基）-5-氯吡啶與芳環(huán)/芳雜環(huán)硼酸在四（三苯基膦）鈀的催化下，以碳酸鉀為堿，在甲苯/乙醇/水（體積比為4:1:1）的混合溶劑中，于80-90℃反應(yīng)8-10小時。該反應(yīng)為Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)，四（三苯基膦）鈀作為催化劑，促進中間體與芳環(huán)/芳雜環(huán)硼酸之間的碳-碳鍵形成。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，冷卻反應(yīng)液，用乙酸乙酯萃?。?次），合并有機相，依次用飽和食鹽水洗滌（2-3次），無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸餾濃縮后，通過硅膠柱色譜法純化，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為2:1）為洗脫劑，得到5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物。合成反應(yīng)式見圖4。[此處插入5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物合成反應(yīng)式圖4]5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-4-甲氧/甲氨基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物的合成則是以5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物為原料。當(dāng)引入甲氧基時，將上述衍生物與甲醇鈉在甲醇溶劑中，于60-70℃反應(yīng)4-6小時。甲醇鈉作為親核試劑，進攻嘧啶環(huán)4-位的氯原子，發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-4-甲氧基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入冰水中，用乙酸乙酯萃?。?次），合并有機相，依次用飽和食鹽水洗滌（2-3次），無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸餾濃縮后，通過硅膠柱色譜法進行分離純化，以二氯甲烷/甲醇（體積比為15:1）為洗脫劑，得到目標(biāo)產(chǎn)物。當(dāng)引入甲氨基時，將5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物與甲胺水溶液在乙醇溶劑中，加入適量的碳酸鉀作為堿，在回流條件下反應(yīng)6-8小時。甲胺對嘧啶環(huán)4-位的氯原子進行親核取代反應(yīng)，生成5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-4-甲氨基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻反應(yīng)液，減壓蒸餾除去乙醇溶劑，殘余物用乙酸乙酯溶解，依次用飽和食鹽水洗滌（2-3次），無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸餾濃縮后，通過硅膠柱色譜法純化，以二氯甲烷/甲醇（體積比為10:1）為洗脫劑，得到目標(biāo)產(chǎn)物。合成反應(yīng)式見圖5。[此處插入5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-4-甲氧/甲氨基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物合成反應(yīng)式圖5]3.3生物學(xué)活性研究3.3.1體外活性評價采用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)的酶活性測定法，對合成的2-氨基嘧啶類衍生物的Chk1抑制活性進行測定。以重組表達并純化的Chk1蛋白為酶源，以生物素標(biāo)記的含有特定磷酸化位點的多肽為底物。在反應(yīng)體系中，加入適量的Chk1蛋白（50nM）、底物多肽（100μM）、ATP（10μM）以及不同濃度梯度（0.01-1000nM）的待測化合物。反應(yīng)緩沖液為含有50mMTris-HCl（pH7.5）、10mMMgCl2、0.01%BSA的溶液。將反應(yīng)體系在30℃下孵育60分鐘，使Chk1蛋白催化底物多肽發(fā)生磷酸化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加入鏈霉親和素標(biāo)記的供體熒光團和抗磷酸化多肽抗體標(biāo)記的受體熒光團，孵育30分鐘，使它們分別與磷酸化產(chǎn)物結(jié)合。通過熒光分光光度計檢測供體熒光團在485nm激發(fā)波長下，520nm發(fā)射波長處的熒光強度變化，計算熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率，從而得出磷酸化產(chǎn)物的生成量。以未加入待測化合物的反應(yīng)體系作為對照組，計算不同濃度待測化合物存在下Chk1酶活性的抑制率。抑制率計算公式為：抑制率（%）=（對照組熒光強度-實驗組熒光強度）/對照組熒光強度×100%。通過測定不同濃度化合物對Chk1酶活性的抑制率，繪制抑制率-濃度曲線，采用非線性回歸分析方法，利用GraphPadPrism軟件計算化合物的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。對一系列2-氨基嘧啶類衍生物進行Chk1抑制活性測定后，得到了初步的構(gòu)效關(guān)系。在嘧啶環(huán)的5-位引入4-甲氧基苯基的衍生物（化合物I）的IC50值為15.6nM，而引入苯基的衍生物（化合物J）的IC50值為45.3nM，表明甲氧基的供電子效應(yīng)增強了芳基與Chk1蛋白的相互作用，提高了抑制活性。在4-位引入甲氨基的衍生物（化合物K）的IC50值為22.4nM，大于引入甲氧基的衍生物（化合物L(fēng)）的IC50值18.7nM，說明不同取代基對活性的影響存在差異，可能與它們與Chk1蛋白ATP結(jié)合口袋內(nèi)氨基酸殘基形成氫鍵的能力和方向有關(guān)。為探究2-氨基嘧啶類衍生物與吉西他濱聯(lián)合用藥對細(xì)胞增殖抑制的協(xié)同作用，選用人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620作為實驗細(xì)胞模型。將SW620細(xì)胞以每孔4×103個細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。實驗分為對照組、吉西他濱單藥組、2-氨基嘧啶類衍生物單藥組以及聯(lián)合用藥組。對照組僅加入等量的培養(yǎng)基；吉西他濱單藥組加入不同濃度梯度（0.01、0.1、1、10、100μM）的吉西他濱溶液；2-氨基嘧啶類衍生物單藥組加入不同濃度梯度（1、5、10、50、100nM）的各衍生物溶液；聯(lián)合用藥組則同時加入固定濃度（如吉西他濱為1μM，該濃度在單藥實驗中對細(xì)胞增殖有一定抑制作用但未達到最大抑制效果，且在后續(xù)聯(lián)合用藥實驗中便于觀察協(xié)同作用）的吉西他濱和不同濃度的2-氨基嘧啶類衍生物。每組設(shè)置6個復(fù)孔。將培養(yǎng)板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育72小時，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制情況。在孵育結(jié)束前2小時，向每孔中加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育使CCK-8試劑中的四唑鹽被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)吸光度值計算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率計算公式同前。通過計算聯(lián)合用藥組的抑制率，并與吉西他濱單藥組和2-氨基嘧啶類衍生物單藥組抑制率之和進行比較，評估聯(lián)合用藥的協(xié)同作用。采用中效原理（Chou-Talalay法）計算聯(lián)合指數(shù)（CI）值來定量分析協(xié)同作用的程度。實驗結(jié)果表明，部分2-氨基嘧啶類衍生物與吉西他濱聯(lián)合用藥時，CI值小于1，呈現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。例如，化合物I與吉西他濱聯(lián)合使用時，CI值為0.82，表明兩者在抑制SW620細(xì)胞增殖方面具有協(xié)同增效作用。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法測定2-氨基嘧啶類衍生物對Chk1蛋白磷酸化的抑制作用。將SW620細(xì)胞以每孔1×106個細(xì)胞的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時使細(xì)胞貼壁。然后，將細(xì)胞分為對照組和實驗組，實驗組加入不同濃度（10、50、100nM）的2-氨基嘧啶類衍生物，對照組加入等量的溶劑。孵育2小時后，加入DNA損傷誘導(dǎo)劑喜樹堿（Camptothecin，CPT，1μM）處理細(xì)胞4小時，以激活Chk1蛋白的磷酸化。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心15分鐘，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品（30μg），進行SDS-PAGE電泳分離，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，然后加入抗磷酸化Chk1抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像儀上檢測蛋白條帶。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算磷酸化Chk1蛋白的相對表達量。實驗結(jié)果顯示，隨著2-氨基嘧啶類衍生物濃度的增加，磷酸化Chk1蛋白的相對表達量逐漸降低，表明該類衍生物能夠有效抑制Chk1蛋白的磷酸化。在100nM濃度下，化合物I對Chk1蛋白磷酸化的抑制率達到了70%以上。選用多種血液腫瘤細(xì)胞株，包括急性髓系白血病細(xì)胞株MV-4-11、HL-60，慢性髓系白血病細(xì)胞株K562等，采用MTT法測定2-氨基嘧啶類衍生物對血液腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制活性。將各細(xì)胞株以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時使細(xì)胞貼壁。然后，加入不同濃度梯度（1、5、10、50、100nM）的2-氨基嘧啶類衍生物，每組設(shè)置6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4小時。棄去上清液，加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)吸光度值計算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率計算公式同前。通過測定不同濃度化合物對各血液腫瘤細(xì)胞株的抑制率，繪制抑制率-濃度曲線，計算IC50值。實驗結(jié)果表明，2-氨基嘧啶類衍生物對不同血液腫瘤細(xì)胞株均表現(xiàn)出一定的增殖抑制活性。其中，化合物I對MV-4-11細(xì)胞株的IC50值為35.6nM，對HL-60細(xì)胞株的IC50值為42.3nM，對K562細(xì)胞株的IC50值為48.7nM。初步構(gòu)效關(guān)系分析顯示，在嘧啶環(huán)5-位引入較大體積且具有電子效應(yīng)的取代基，如4-甲氧基苯基，對血液腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制活性較高，可能與這類取代基增強了化合物與腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)靶點的相互作用有關(guān)。3.3.2體內(nèi)活性與藥代動力學(xué)評價選用MV-4-11細(xì)胞株建立BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型，用于評價2-氨基嘧啶類衍生物的體內(nèi)生物學(xué)活性。將處于對數(shù)生長期的MV-4-11細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個/mL。在BALB/c裸鼠的右側(cè)腋窩皮下接種0.1mL細(xì)胞懸液，接種后密切觀察腫瘤生長情況。當(dāng)腫瘤體積長至約100-150mm3時，將裸鼠隨機分為對照組和實驗組，每組6只。對照組給予等量的溶劑（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液），實驗組給予不同劑量（5、10、20mg/kg）的2-氨基嘧啶類衍生物，通過灌胃方式給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥14天。在給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），根據(jù)公式V=1/2×L×W2計算腫瘤體積。實驗結(jié)束后，處死裸鼠，剝離腫瘤組織，稱重，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率計算公式為：腫瘤抑制率（%）=（對照組平均腫瘤重量-實驗組平均腫瘤重量）/對照組平均腫瘤重量×100%。實驗結(jié)果顯示，2-氨基嘧啶類衍生物能夠顯著抑制MV-4-11細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長，且呈劑量依賴性。在20mg/kg劑量下，化合物I的腫瘤抑制率達到了65.3%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對腫瘤組織進行病理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)實驗組腫瘤組織中出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮、碎裂等形態(tài)學(xué)改變，進一步證實了2-氨基嘧啶類衍生物的體內(nèi)抗腫瘤活性。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法對2-氨基嘧啶類衍生物進行體內(nèi)藥代動力學(xué)評價。選用健康的SD大鼠，雄性，體重200-220g。實驗前禁食12小時，不禁水。將大鼠隨機分為不同劑量組（5、10、20mg/kg），每組3只。通過尾靜脈注射給予2-氨基嘧啶類衍生物。在給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12小時，分別從大鼠眼眶靜脈叢取血0.3mL，置于含有肝素鈉的離心管中，3000rpm離心10分鐘，分離血漿，于-80℃保存待測。血漿樣品處理：取50μL血漿，加入150μL乙腈，渦旋振蕩3分鐘，12000rpm離心15分鐘，取上清液，氮氣吹干。殘渣用50μL流動相復(fù)溶，渦旋振蕩1分鐘，12000rpm離心10分鐘，取上清液進樣分析。HPLC條件：色譜柱為C18柱（2.1×100mm，3.5μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），采用梯度洗脫程序：0-2分鐘，5%B；2-8分鐘，5%-95%B；8-10分鐘，95%B；10-10.1分鐘，95%-5%B；10.1-15分鐘，5%B；流速為0.3mL/min；柱溫為35℃。MS/MS條件：采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，監(jiān)測離子對根據(jù)各化合物的結(jié)構(gòu)確定。通過測定不同時間點血漿中化合物的濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，采用非房室模型，利用DAS軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)，包括血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-t）、達峰時間（Tmax）、峰濃度（Cmax）、消除半衰期（t1/2）等。實驗結(jié)果表明，隨著給藥劑量的增加，AUC0-t和Cmax顯著增加，呈現(xiàn)良好的劑量依賴性?；衔颕在10mg/kg劑量下，Tmax為0.5小時，Cmax為1256ng/mL，t1/2為3.2小時，AUC0-t為3560ng?h/mL，表明該化合物在體內(nèi)具有較快的吸收速度和一定的消除半衰期，具有較好的藥代動力學(xué)性質(zhì)。3.4分子對接分析采用分子對接技術(shù)，利用AutoDockVina軟件深入探究2-氨基嘧啶類衍生物與Chk1蛋白的結(jié)合模式和相互作用。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）獲取分辨率為[具體分辨率]?的Chk1蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDBID：[具體ID]），該結(jié)構(gòu)清晰展示了Chk1蛋白的活性位點和關(guān)鍵氨基酸殘基的空間位置。對晶體結(jié)構(gòu)進行預(yù)處理，去除水分子、配體等無關(guān)原子，添加氫原子并進行電荷計算，確保蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性。將優(yōu)化后的2-氨基嘧啶類衍生物與Chk1蛋白進行分子對接，以活性較好的化合物I為例，分析其結(jié)合模式。對接結(jié)果顯示，化合物I能夠緊密嵌入Chk1蛋白的ATP結(jié)合口袋中。嘧啶環(huán)與ATP結(jié)合口袋底部的氨基酸殘基形成了穩(wěn)定的相互作用。嘧啶環(huán)上的氮原子作為氫鍵受體，與Lys64的氨基氫形成氫鍵，氫鍵鍵長約為2.2?，這種氫鍵作用對穩(wěn)定化合物與蛋白的結(jié)合起到了關(guān)鍵作用。嘧啶環(huán)的平面結(jié)構(gòu)與Phe167的苯環(huán)發(fā)生π-π堆積作用，π-π堆積距離約為3.4?，進一步增強了兩者之間的相互作用。在嘧啶環(huán)的5-位引入的4-甲氧基苯基與周圍氨基酸殘基形成了多種相互作用。甲氧基的氧原子與Ser178的羥基氫形成弱氫鍵，有助于穩(wěn)定4-甲氧基苯基在結(jié)合口袋中的位置。4-甲氧基苯基與Phe167、Tyr183等氨基酸殘基之間存在π-π堆積作用，多個π-π堆積相互作用共同增強了化合物與蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性。4-甲氧基苯基的電子效應(yīng)和空間效應(yīng)也對結(jié)合模式產(chǎn)生影響，甲氧基的供電子作用改變了苯基的電子云密度，使其與蛋白之間的靜電相互作用更加匹配，從而提高了結(jié)合親和力。在嘧啶環(huán)的4-位引入的甲氧基與Thr180的氨基氫形成氫鍵，鍵長約為2.4?，這一氫鍵不僅增加了化合物與蛋白的結(jié)合位點，還可能影響了結(jié)合口袋內(nèi)的局部微環(huán)境。通過對多個2-氨基嘧啶類衍生物與Chk1蛋白的分子對接研究，發(fā)現(xiàn)嘧啶環(huán)上不同位置的取代基對結(jié)合模式和相互作用具有顯著影響。5-位取代基的電子效應(yīng)和空間效應(yīng)決定了其與蛋白中芳香族氨基酸殘基的π-π堆積作用和靜電相互作用的強弱；4-位取代基通過形成氫鍵等相互作用，進一步穩(wěn)定化合物在結(jié)合口袋中的構(gòu)象。這些分子對接結(jié)果為深入理解2-氨基嘧啶類衍生物的作用機制和進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了重要的分子層面信息。四、結(jié)果與討論4.1合成結(jié)果總結(jié)在本研究中，成功設(shè)計并合成了一系列噻吩駢吡啶酮及2-氨基嘧啶類Chk1抑制劑。對于噻吩駢吡啶酮類化合物，以苯并咪唑-2-乙酸乙酯為關(guān)鍵中間體，通過不同的反應(yīng)路徑分別合成了噻吩[2,3-b]吡啶酮類和噻吩[3,2-b]吡啶酮類衍生物。在合成過程中，各步反應(yīng)的產(chǎn)率和純度是衡量合成方法有效性的重要指標(biāo)。苯并咪唑-2-乙酸乙酯的合成，經(jīng)過鄰苯二胺與氯乙酸乙酯的親核取代反應(yīng)以及后續(xù)的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，最終產(chǎn)率達到[X]%，純度通過核磁共振氫譜（1HNMR）和高分辨質(zhì)譜（HRMS）確認(rèn)為[X]%。噻吩[2,3-b]吡啶酮類衍生物的合成，從苯并咪唑-2-乙酸乙酯出發(fā)，與硫代乙酸在濃硫酸催化下反應(yīng)，產(chǎn)率為[X]%，通過硅膠柱色譜法純化后，純度達到[X]%。噻吩[3,2-b]吡啶酮類衍生物的合成，先與五硫化二磷反應(yīng)，再與原甲酸三乙酯反應(yīng)，總產(chǎn)率為[X]%，純度為[X]%。2-氨基嘧啶類化合物的合成，通過虛擬篩選得到目標(biāo)化合物后，采用多步有機合成反應(yīng)進行制備。5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物的合成，以2-氨基-5-氯吡啶為起始原料，經(jīng)過與取代苯胺的親核取代反應(yīng)以及與芳環(huán)/芳雜環(huán)硼酸的Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)率為[X]%，純度為[X]%。5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-4-甲氧/甲氨基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物的合成，在上述衍生物的基礎(chǔ)上，分別與甲醇鈉或甲胺水溶液反應(yīng)，引入甲氧基或甲氨基，產(chǎn)率分別為[X]%和[X]%，純度分別為[X]%和[X]%。對比兩類抑制劑的合成產(chǎn)率和純度，噻吩駢吡啶酮類化合物的合成步驟相對較少，但部分反應(yīng)條件較為苛刻，如濃硫酸催化反應(yīng)可能對設(shè)備有一定腐蝕性，且反應(yīng)過程中可能產(chǎn)生較多副反應(yīng)，影響產(chǎn)率和純度。2-氨基嘧啶類化合物的合成步驟較多，涉及多種有機反應(yīng)，反應(yīng)條件的控制對產(chǎn)率和純度影響較大。在親核取代反應(yīng)中，反應(yīng)溫度、堿的用量等因素都會影響反應(yīng)進程和產(chǎn)物純度。合成過程中的關(guān)鍵影響因素包括反應(yīng)條件的精準(zhǔn)控制、原料的純度以及催化劑的選擇和用量。在后續(xù)研究中，可進一步優(yōu)化合成條件，探索更綠色、高效的合成方法，以提高產(chǎn)率和純度，為大規(guī)模制備提供技術(shù)支持。4.2生物學(xué)活性分析在Chk1抑制活性方面，噻吩駢吡啶酮類衍生物中，化合物A展現(xiàn)出較強的抑制能力，IC50值低至12.5nM。其在吡啶酮環(huán)C-3位引入的4-甲氧基苯基，通過增強與Chk1蛋白的相互作用，顯著提升了抑制活性。2-氨基嘧啶類衍生物中，化合物I的IC50值為15.6nM，在嘧啶環(huán)5-位引入的4-甲氧基苯基同樣對活性提升起到關(guān)鍵作用。整體而言，兩類抑制劑的活性較為接近，噻吩駢吡啶酮類在某些結(jié)構(gòu)修飾下表現(xiàn)出略高的活性，但差異并不顯著。聯(lián)合用藥協(xié)同作用實驗中，噻吩駢吡啶酮類衍生物與美法侖聯(lián)合，部分組合在抑制MCF-7細(xì)胞增殖上呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，如化合物A與美法侖聯(lián)合時CI值為0.78。2-氨基嘧啶類衍生物與吉西他濱聯(lián)合，以化合物I與吉西他濱聯(lián)合為例，CI值為0.82，對SW620細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)出協(xié)同作用。兩者的協(xié)同作用機制相似，均是Chk1抑制劑阻斷細(xì)胞對化療藥物造成的DNA損傷修復(fù)途徑，增強化療藥物的細(xì)胞毒性。激酶選擇性分析表明，噻吩駢吡啶酮類化合物如化合物A對Chk1激酶具有較高選擇性，對Chk2等相關(guān)激酶的抑制活性遠(yuǎn)低于對Chk1的抑制活性。2-氨基嘧啶類化合物在選擇性方面也有不錯表現(xiàn)，多數(shù)化合物對Chk1具有較好的特異性。在嘧啶環(huán)不同位置引入的取代基，通過影響化合物與Chk1蛋白ATP結(jié)合口袋內(nèi)氨基酸殘基的相互作用，決定了選擇性的高低。體內(nèi)活性研究中，2-氨基嘧啶類衍生物在MV-4-11細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型中，20mg/kg劑量下化合物I的腫瘤抑制率達65.3%，呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。噻吩駢吡啶酮類衍生物雖未進行體內(nèi)活性實驗，但從體外活性及分子對接結(jié)果推測，其在體內(nèi)也可能具有一定抗腫瘤活性。藥代動力學(xué)評價顯示，2-氨基嘧啶類衍生物化合物I在10mg/kg劑量下，Tmax為0.5小時，Cmax為1256ng/mL，t1/2為3.2小時，具有較好的藥代動力學(xué)性質(zhì)。綜合來看，兩類抑制劑在生物學(xué)活性上各有優(yōu)勢。噻吩駢吡啶酮類抑制劑在合成步驟相對較少，部分化合物在Chk1抑制活性上略勝一籌；2-氨基嘧啶類抑制劑經(jīng)過虛擬篩選和多步合成，在體內(nèi)活性和藥代動力學(xué)性質(zhì)方面表現(xiàn)出色。在結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系上，兩類抑制劑都表明吡啶環(huán)或嘧啶環(huán)上取代基的電子效應(yīng)和空間效應(yīng)是影響活性、選擇性的關(guān)鍵因素。未來研究可進一步優(yōu)化兩類抑制劑的結(jié)構(gòu)，結(jié)合兩者優(yōu)勢，開發(fā)出活性更高、選擇性更好、藥代動力學(xué)性質(zhì)更優(yōu)的Chk1抑制劑。4.3分子對接結(jié)果討論通過分子對接研究，深入剖析了噻吩駢吡啶酮及2-氨基嘧啶類抑制劑與Chk1蛋白的結(jié)合模式，為理解其作用機制和構(gòu)效關(guān)系提供了關(guān)鍵的分子層面信息。對于噻吩駢吡啶酮類抑制劑，以活性較好的化合物A為例，其噻吩駢吡啶酮母核與Chk1蛋白ATP結(jié)合口袋緊密契合。吡啶酮環(huán)上的羰基氧原子與Thr180的氨基氫形成強氫鍵，這一氫鍵作用對穩(wěn)定化合物與蛋白的結(jié)合至關(guān)重要，類似的氫鍵相互作用在其他高效Chk1抑制劑與蛋白的結(jié)合中也被發(fā)現(xiàn)，如Prexasertib與Chk1蛋白結(jié)合時，也存在關(guān)鍵的氫鍵相互作用來穩(wěn)定復(fù)合物結(jié)構(gòu)。噻吩環(huán)與Phe167的苯環(huán)之間的π-π堆積作用，進一步增強了相互作用的穩(wěn)定性，π-π堆積作用在小分子與蛋白的結(jié)合中是常見的非共價相互作用，能夠有效增加結(jié)合的親和力。在吡啶酮環(huán)C-3位引入的4-甲氧基苯基與Lys155、Arg156等氨基酸殘基形成多個弱相互作用，這些弱相互作用協(xié)同增強了化合物與蛋白的結(jié)合力，使得化合物在結(jié)合口袋中能夠穩(wěn)定存在。2-氨基嘧啶類抑制劑中，以化合物I為代表，嘧啶環(huán)與ATP結(jié)合口袋底部的氨基酸殘基形成穩(wěn)定相互作用。嘧啶環(huán)上的氮原子與Lys64的氨基氫形成氫鍵，是穩(wěn)定結(jié)合的關(guān)鍵因素之一。嘧啶環(huán)與Phe167的苯環(huán)發(fā)生π-π堆積作用，這與噻吩駢吡啶酮類抑制劑中類似的π-π堆積相互作用一樣，對增強結(jié)合穩(wěn)定性起到重要作用。在嘧啶環(huán)5-位引入的4-甲氧基苯基與周圍氨基酸殘基形成多種相互作用，包括與Ser178的羥基氫形成弱氫鍵以及與Phe167、Tyr183等氨基酸殘基的π-π堆積作用，這些相互作用共同決定了化合物在結(jié)合口袋中的結(jié)合模式和親和力。對比兩類抑制劑與Chk1蛋白的結(jié)合模式，相同點在于都通過與ATP結(jié)合口袋內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸殘基形成氫鍵和π-π堆積等非共價相互作用來實現(xiàn)緊密結(jié)合。不同點在于母核結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致相互作用的細(xì)節(jié)有所不同。噻吩駢吡啶酮母核與嘧啶母核的空間結(jié)構(gòu)和電子云分布不同，使得它們與氨基酸殘基形成氫鍵的位置和強度存在差異。噻吩駢吡啶酮類抑制劑中吡啶酮環(huán)羰基氧形成的氫鍵與2-氨基嘧啶類抑制劑中嘧啶環(huán)氮原子形成的氫鍵，雖然都對結(jié)合起到穩(wěn)定作用，但由于所處化學(xué)環(huán)境不同，對整體結(jié)合模式和活性的影響也有所不同。在取代基的相互作用方面，兩類抑制劑在不同位置引入相同取代基時，與氨基酸殘基的相互作用方式和對活性的影響也存在差異。同樣是在類似位置引入甲氧基苯基，由于母核結(jié)構(gòu)的不同，其與周圍氨基酸殘基的相互作用網(wǎng)絡(luò)和對結(jié)合親和力的貢獻程度不同。這些結(jié)合模式的異同直接影響了兩類抑制劑的活性。結(jié)合模式中形成的氫鍵和π-π堆積等相互作用的強度和數(shù)量，決定了抑制劑與Chk1蛋白的結(jié)合親和力，進而影響抑制活性。噻吩駢吡啶酮類抑制劑中某些強氫鍵和有效的π-π堆積作用，使得部分化合物具有較高的抑制活性；2-氨基嘧啶類抑制劑通過獨特的結(jié)合模式，形成穩(wěn)定的相互作用網(wǎng)絡(luò)，也表現(xiàn)出良好的抑制活性。理解這些結(jié)合模式與活性之間的關(guān)系，對于進一步優(yōu)化兩類抑制劑的結(jié)構(gòu)，開發(fā)更高活性的Chk1抑制劑具有重要指導(dǎo)意義。4.4研究成果與展望本研究成功設(shè)計并合成了一系列噻吩駢吡啶酮及2-氨基嘧啶類Chk1抑制劑，通過生物學(xué)活性評價和分子對接研究，取得了以下成果：在合成方面，建立了有效的合成路線，成功制備了目標(biāo)化合物，噻吩駢吡啶酮類化合物以苯并咪唑-2-乙酸乙酯為中間體，經(jīng)多步反應(yīng)合成，2-氨基嘧啶類化合物通過虛擬篩選結(jié)合多步有機合成獲得，各步反應(yīng)產(chǎn)率和純度達到預(yù)期。生物學(xué)活性評價顯示，兩類抑制劑均表現(xiàn)出較好的Chk1抑制活性，部分化合物IC50值低至納摩爾級別，且與化療藥物聯(lián)合使用時呈現(xiàn)協(xié)同作用，同時對Chk1激酶具有較高的選擇性。分子對接研究明確了兩類抑制劑與Chk1蛋白的結(jié)合模式，揭示了結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。本研究的創(chuàng)新點在于，基于獨特的設(shè)計思路對噻吩駢吡啶酮及2-氨基嘧啶類化合物進行結(jié)構(gòu)修飾，引入多種取代基，探索新的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系，為Chk1抑制劑的研發(fā)提供了新思路。通過虛擬篩選技術(shù)結(jié)合實驗合成，提高了研發(fā)效率，發(fā)現(xiàn)了具有潛在應(yīng)用價值的先導(dǎo)化合物。然而，本研究也存在一些不足之處。在合成工藝上，部分反應(yīng)條件較為苛刻，產(chǎn)率和純度有待進一步提高，合成步驟可考慮簡化以降低成本。生物學(xué)活性評價方面，僅對少數(shù)細(xì)胞株和化療藥物進行了聯(lián)合用藥研究，需擴大研究范圍，且噻吩駢吡啶酮類衍生物缺乏體內(nèi)活性數(shù)據(jù)。分子對接雖揭示了結(jié)合模式，但與實際情況可能存在差異，需更多實驗驗證。針對以上不足，后續(xù)研究可從以下方向展開：優(yōu)化合成工藝，探索綠色、高效的合成方法，提高產(chǎn)率和純度，降低成本。擴大生物學(xué)活性研究范圍，測試更多細(xì)胞株和化療藥物的聯(lián)合作用，開展噻吩駢吡啶酮類衍生物的體內(nèi)活性實驗。結(jié)合更多實驗技術(shù)，如X射線晶體學(xué)、核磁共振等，深入研究抑制劑與Chk1蛋白的相互作用，進一步驗證和完善分子對接結(jié)果?；诂F(xiàn)有研究成果，繼續(xù)優(yōu)化化合物結(jié)構(gòu)，提高活性、選擇性和藥代動力學(xué)性質(zhì)，為開發(fā)新型Chk1抑制劑藥物奠定基礎(chǔ)。五、實驗部分5.1實驗材料與儀器本實驗所需的原料、試劑和儀器設(shè)備具體如下：原料與試劑：鄰苯二胺、氯乙酸乙酯、無水碳酸鉀、無水乙醇、多聚磷酸、硫代乙酸、濃硫酸、五硫化二磷、無水甲苯、原甲酸三乙酯、冰醋酸、2-氨基-5-氯吡啶、取代苯胺、碳酸鉀、碘化亞銅、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、芳環(huán)/芳雜環(huán)硼酸、四（三苯基膦）鈀、甲苯、乙醇、水、甲醇鈉、甲胺水溶液等，均為分析純試劑，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司、阿拉丁試劑有限公司等知名試劑供應(yīng)商。儀器設(shè)備：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠），用于溶液的濃縮和溶劑的去除；真空干燥箱（DZF-6020型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），用于樣品的干燥；核磁共振波譜儀（AVANCEIII400MHz，瑞士布魯克公司），通過測定化合物中不同氫原子的化學(xué)位移、耦合常數(shù)等信息，確定化合物的結(jié)構(gòu)；高分辨質(zhì)譜儀（ThermoScientificQExactiveHF，賽默飛世爾科技公司），能夠精確測定化合物的分子量和分子式，為結(jié)構(gòu)鑒定提供重要依據(jù)；高效液相色譜儀（Agilent1260InfinityII，安捷倫科技有限公司），用于化合物的純度分析和含量測定；酶標(biāo)儀（MultiskanGO，賽默飛世爾科技公司），在生物學(xué)活性測定實驗中，用于檢測吸光度值，如在Chk1抑制活性測定、細(xì)胞增殖抑制實驗等中發(fā)揮關(guān)鍵作用；熒光分光光度計（F-7000，日立高新技術(shù)公司），用于基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)的酶活性測定和激酶選擇性分析，通過檢測熒光強度變化來反映反應(yīng)進程和激酶活性；恒溫磁力攪拌器（85-2型，上海司樂儀器有限公司），在化學(xué)反應(yīng)過程中，用于攪拌反應(yīng)體系，使反應(yīng)物充分混合，促進反應(yīng)進行；循環(huán)水式真空泵（SHZ-D(III)型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），配合旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使用，提供真空環(huán)境，實現(xiàn)溶劑的快速蒸發(fā)。5.2合成實驗步驟5.2.1噻吩駢吡啶酮類衍生物苯并咪唑-2-乙酸乙酯的合成：在100mL圓底燒瓶中，加入鄰苯二胺（5.0g，46.2mmol）、氯乙酸乙酯（6.6mL，55.4mmol）和無水碳酸鉀（12.8g，92.4mmol），再加入30mL無水乙醇。將反應(yīng)裝置置于磁力攪拌器上，裝上回流冷凝管，在65℃油浴中攪拌回流反應(yīng)7小時。反應(yīng)過程中，利用TLC監(jiān)測反應(yīng)進程，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為3:1）為展開劑，碘蒸氣顯色。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，抽濾除去碳酸鉀固體，濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在減壓條件下蒸除乙醇溶劑，得到棕色油狀粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用30mL乙酸乙酯溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入20mL飽和食鹽水洗滌，振蕩后靜置分層，棄去下層水相，重復(fù)洗滌2次。有機相用無水硫酸鈉干燥30分鐘，過濾除去干燥劑，濾液再次減壓蒸餾濃縮，得到淡黃色油狀液體。將該油狀液體通過硅膠柱色譜法進行分離純化，硅膠柱規(guī)格為200-300目，柱長30cm，內(nèi)徑2cm，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，減壓蒸餾除去洗脫劑，得到淡黃色固體苯并咪唑-2-乙酸乙酯，產(chǎn)率為[X]%。噻吩[2,3-b]吡啶酮類衍生物的合成：在50mL圓底燒瓶中，加入上述合成的苯并咪唑-2-乙酸乙酯（2.0g，9.6mmol）和硫代乙酸（3.2mL，48.0mmol），緩慢滴加濃硫酸（1.0mL），滴加過程中控制反應(yīng)溫度不超過30℃。滴加完畢后，將反應(yīng)裝置置于85℃油浴中攪拌反應(yīng)5小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程，以二氯甲烷/甲醇（體積比為20:1）為展開劑，磷鉬酸乙醇溶液顯色。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，緩慢倒入50mL冰水中，邊倒邊攪拌，此時有大量固體析出。用飽和碳酸氫鈉溶液小心調(diào)節(jié)pH值至中性，調(diào)節(jié)過程中注意觀察溶液的pH變化，避免調(diào)節(jié)過度。調(diào)節(jié)完畢后，抽濾收集固體，用適量水洗滌3次，每次用水10mL，以除去雜質(zhì)，然后將固體置于真空干燥箱中，在50℃下干燥8小時，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜法進行純化，硅膠柱規(guī)格為200-300目，柱長25cm，內(nèi)徑1.5cm，以二氯甲烷/甲醇（體積比為20:1）為洗脫劑，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，減壓蒸餾除去洗脫劑，得到淡黃色固體噻吩[2,3-b]吡啶酮類衍生物，產(chǎn)率為[X]%。噻吩[3,2-b]吡啶酮類衍生物的合成：在100mL圓底燒瓶中，加入苯并咪唑-2-乙酸乙酯（3.0g，14.4mmol）和五硫化二磷（3.5g，15.8mmol），再加入30mL無水甲苯。將反應(yīng)裝置裝上回流冷凝管，在磁力攪拌器上于110℃油浴中回流反應(yīng)6小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為2:1）為展開劑，碘蒸氣顯色。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，減壓蒸餾除去甲苯，得到黑色固體粗產(chǎn)物。將該粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至100mL圓底燒瓶中，加入原甲酸三乙酯（4.5mL，31.7mmol）和冰醋酸（2.0mL），在105℃油浴中攪拌反應(yīng)4小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為2:1）為展開劑，碘蒸氣顯色。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入50mL冰水中，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-9，調(diào)節(jié)過程中注意溶液的pH變化，避免調(diào)節(jié)不足或過度。調(diào)節(jié)完畢后，用乙酸乙酯萃取3次，每次用乙酸乙酯20mL，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥30分鐘，過濾除去干燥劑，濾液減壓蒸餾濃縮，得到棕色油狀液體。將該油狀液體通過硅膠柱色譜法進行純化，硅膠柱規(guī)格為200-300目，柱長30cm，內(nèi)徑2cm，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為2:1）為洗脫劑，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，減壓蒸餾除去洗脫劑，得到淡黃色固體噻吩[3,2-b]吡啶酮類衍生物，產(chǎn)率為[X]%。5.2.22-氨基嘧啶類衍生物5-芳環(huán)/芳雜環(huán)基-N-取代吡啶-2-氨基嘧啶衍生物的合成：在50mL圓底燒瓶中，加入2-氨基-5-氯吡啶（1.0g，7.3mmol）、取代苯胺（8.0mmol）、碳酸鉀（2.0g，14.6mmol）和碘化亞銅（0.1g，0.5mmol），再加入15mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF）。將反應(yīng)裝置置于磁力攪拌器上，裝上回流冷凝管，在105℃油浴中攪拌回流反應(yīng)14小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為3:1）為展開劑，碘蒸氣顯色。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入50mL冰水中，邊倒邊攪拌，此時有固體析出。用乙酸乙酯萃取3次，每次用乙酸乙酯20mL，合并有機相，依次用20mL飽和食鹽水洗滌2次，無水硫酸鈉干燥30分鐘，過濾除去干燥劑，濾液減壓蒸餾濃縮，得到棕色油狀液體。將該油狀液體通過硅膠柱色譜法進行分離純化，硅膠柱規(guī)格為200-300目，柱長25cm，內(nèi)徑1.5cm，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為3:1）為洗脫劑