2025年上學(xué)期高三生物基因工程操作程序試題一、選擇題（每題3分，共30分）下列關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的敘述，正確的是（）A.能識別雙鏈RNA分子的特定核苷酸序列B.切割位點(diǎn)位于識別序列的中心軸線處時(shí)產(chǎn)生黏性末端C.從原核生物中提取的限制酶可用于切割自身DNAD.同尾酶切割DNA后可產(chǎn)生相同的黏性末端答案：D解析：限制酶識別的是雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列（A錯誤）；切割位點(diǎn)在中心軸線兩側(cè)時(shí)產(chǎn)生黏性末端，在中心軸線處產(chǎn)生平末端（B錯誤）；原核生物通過甲基化修飾自身DNA序列，避免被自身限制酶切割（C錯誤）；同尾酶（如BamHⅠ和BglⅡ）可切割產(chǎn)生相同的黏性末端（D正確）?；虮磉_(dá)載體構(gòu)建過程中，需滿足的關(guān)鍵條件是（）A.目的基因插入位點(diǎn)必須位于復(fù)制原點(diǎn)下游B.載體上至少保留一個完整的標(biāo)記基因C.啟動子和終止子需來自同一物種D.必須使用兩種不同限制酶切割目的基因和載體答案：B解析：復(fù)制原點(diǎn)是DNA復(fù)制的起點(diǎn)，目的基因插入位點(diǎn)需位于啟動子和終止子之間，與復(fù)制原點(diǎn)位置無關(guān)（A錯誤）；標(biāo)記基因用于篩選重組細(xì)胞，需至少保留一個完整功能（B正確）；啟動子和終止子可來自不同物種，如使用病毒啟動子驅(qū)動目的基因在真核細(xì)胞中表達(dá)（C錯誤）；單酶切也可構(gòu)建重組載體，但雙酶切可減少自身環(huán)化（D錯誤）。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，下列敘述錯誤的是（）A.每次循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸三個階段B.引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對原則C.耐高溫DNA聚合酶需在延伸階段發(fā)揮作用D.擴(kuò)增產(chǎn)物中含有引物的反向互補(bǔ)序列答案：D解析：PCR循環(huán)包括95℃變性（DNA解鏈）、55℃復(fù)性（引物結(jié)合）、72℃延伸（子鏈合成）（A正確）；引物通過堿基互補(bǔ)配對與模板鏈結(jié)合（B正確）；耐高溫DNA聚合酶（如Taq酶）在延伸階段催化磷酸二酯鍵形成（C正確）；擴(kuò)增產(chǎn)物兩端為引物序列，而非反向互補(bǔ)序列（D錯誤）。二、非選擇題（共70分）（一）基礎(chǔ)填空（每空2分，共20分）基因工程的基本操作程序包括：目的基因的篩選與獲取、、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、。答案：基因表達(dá)載體的構(gòu)建；目的基因的檢測與鑒定農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，Ti質(zhì)粒上的__________片段可轉(zhuǎn)移并整合到植物細(xì)胞的__________上，適用于__________（填“單子葉”或“雙子葉”）植物的轉(zhuǎn)基因操作。答案：T-DNA；染色體DNA；雙子葉DNA粗提取實(shí)驗(yàn)中，向雞血細(xì)胞液中加入__________可使細(xì)胞膜破裂釋放DNA；用__________（體積分?jǐn)?shù)）的冷卻酒精可析出純凈的DNA；鑒定DNA時(shí)，在沸水浴條件下，DNA與__________試劑反應(yīng)呈藍(lán)色。答案：洗滌劑；95%；二苯胺（二）實(shí)驗(yàn)分析題（18分）某研究團(tuán)隊(duì)欲將抗蟲基因（Bt基因）導(dǎo)入棉花細(xì)胞，培育抗蟲棉。請回答下列問題：（1）從蘇云金桿菌中提取Bt基因后，需用限制酶__________（填“EcoRⅠ”或“SmaⅠ”）切割下圖中的質(zhì)粒（圖1），才能確保目的基因正確插入啟動子和終止子之間。若用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，可產(chǎn)生__________種不同長度的DNA片段。圖1質(zhì)粒圖譜（箭頭為限制酶切割位點(diǎn)）（質(zhì)粒含EcoRⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ三種酶切位點(diǎn)，標(biāo)記基因?yàn)榘逼S青霉素抗性基因）答案：EcoRⅠ；3解析：SmaⅠ切割位點(diǎn)位于氨芐青霉素抗性基因內(nèi)部，會破壞標(biāo)記基因，故選擇EcoRⅠ（切割位點(diǎn)位于啟動子和終止子之間）；EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切可將質(zhì)粒切成3個片段（啟動子-終止子區(qū)、氨芐青霉素抗性基因區(qū)、復(fù)制原點(diǎn)區(qū)）。（2）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入棉花愈傷組織細(xì)胞后，需在培養(yǎng)基中添加__________進(jìn)行篩選。若要檢測Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，可采用__________技術(shù)。答案：氨芐青霉素；分子雜交（或RT-PCR）（三）綜合應(yīng)用題（32分）某科研小組利用基因工程技術(shù)培育高產(chǎn)賴氨酸玉米，流程如下圖所示。請分析回答：圖2高產(chǎn)賴氨酸玉米培育流程（①獲取目的基因；②構(gòu)建重組載體；③農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；④篩選與鑒定）（1）步驟①中，從賴氨酸合成酶基因家族中篩選目的基因時(shí)，需考慮該基因的__________（至少答兩點(diǎn)）。（6分）答案：編碼區(qū)完整性、啟動子活性、與玉米密碼子偏好性匹配度解析：目的基因需具備完整編碼區(qū)以保證蛋白質(zhì)正確合成；啟動子需能被玉米細(xì)胞的RNA聚合酶識別；密碼子偏好性影響翻譯效率，需選擇與玉米基因組匹配度高的基因。（2）步驟②中，用HindⅢ和PstⅠ雙酶切目的基因和Ti質(zhì)粒，其主要目的是__________。若重組質(zhì)粒中目的基因反向插入，會導(dǎo)致賴氨酸合成酶__________。（6分）答案：防止目的基因和載體自身環(huán)化；無法正確表達(dá)（或翻譯出無活性肽鏈）解析：雙酶切產(chǎn)生不同黏性末端，可避免目的基因與載體的自身環(huán)化和反向連接；反向插入會導(dǎo)致目的基因轉(zhuǎn)錄方向與啟動子驅(qū)動方向相反，無法正常翻譯。（3）步驟④中，對轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行分子水平檢測的具體方法有哪些？并預(yù)期檢測結(jié)果。（10分）答案：DNA水平：PCR擴(kuò)增目的基因，若出現(xiàn)預(yù)期大小條帶，則證明目的基因已整合；RNA水平：RT-PCR檢測賴氨酸合成酶基因的mRNA，若擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，則證明基因已轉(zhuǎn)錄；蛋白質(zhì)水平：抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則證明目的基因已表達(dá)。（4）若轉(zhuǎn)基因玉米的賴氨酸含量僅提高15%，可能的原因有哪些？（6分）答案：目的基因表達(dá)效率低（如啟動子活性弱）；賴氨酸降解途徑相關(guān)基因被激活；受體細(xì)胞中缺乏賴氨酸合成所需的前體物質(zhì)。三、選做題（共10分，任選一題作答）[實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)]某同學(xué)欲從土壤農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒DNA，請補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)步驟：①向農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中加入__________，離心收集菌體；②加入裂解液（含SDS和NaOH）處理，目的是__________；③加入__________溶液中和，使質(zhì)粒DNA復(fù)性；④用__________（試劑）沉淀DNA，離心后獲得質(zhì)粒。答案：①無菌水；②破壞細(xì)胞膜并使DNA變性；③醋酸鉀；④冷卻的95%酒精[拓展分析]簡述CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)與傳統(tǒng)基因工程在操作原理上的本質(zhì)區(qū)別。答案：傳統(tǒng)基因工程通過限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶實(shí)現(xiàn)基因的“添加”或“替換”，而CRISPR-Cas9技術(shù)通過sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白定點(diǎn)切割靶基因，利用細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制（如非同源末端連接或同源重組）實(shí)