解讀2025EMQN最佳實(shí)踐指南：實(shí)體腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的分析與報(bào)道精準(zhǔn)檢測，規(guī)范診療目錄第一章第二章第三章指南背景與意義檢測前樣本要求MSI分析技術(shù)方法目錄第四章第五章第六章結(jié)果判讀與分級臨床報(bào)告規(guī)范質(zhì)量管理體系指南背景與意義1.EMQN組織與指南制定目的EMQN（歐洲分子遺傳質(zhì)控網(wǎng)絡(luò)）是國際知名的分子診斷質(zhì)量評估機(jī)構(gòu)，致力于通過標(biāo)準(zhǔn)化方案提升實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量，其指南在全球范圍內(nèi)具有高度權(quán)威性和指導(dǎo)性。權(quán)威機(jī)構(gòu)背景指南旨在解決不同實(shí)驗(yàn)室間微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測方法的差異，明確PCR、NGS等技術(shù)流程的標(biāo)準(zhǔn)化要求，確保結(jié)果可比性和臨床可靠性。統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)通過規(guī)范MSI檢測的預(yù)分析、分析和報(bào)告流程，為實(shí)體腫瘤（如結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌）的免疫治療和遺傳風(fēng)險(xiǎn)評估提供精準(zhǔn)依據(jù)。推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療01MSI-H（高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定）腫瘤對PD-1/PD-L1抑制劑響應(yīng)率高，指南強(qiáng)調(diào)其作為免疫治療療效預(yù)測的關(guān)鍵生物標(biāo)志物價(jià)值。免疫治療標(biāo)志物02MSI檢測是遺傳性林奇綜合征的重要篩查工具，可識(shí)別攜帶錯(cuò)配修復(fù)基因突變的患者及其家族成員，指導(dǎo)早期干預(yù)。林奇綜合征篩查03MSI狀態(tài)與腫瘤分期、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，例如MSI-H結(jié)直腸癌患者通常預(yù)后較好，但需結(jié)合其他分子特征綜合評估。預(yù)后評估意義04新版指南新增胃癌、卵巢癌等癌種的MSI檢測推薦，反映其跨瘤種臨床應(yīng)用價(jià)值的提升。泛癌種應(yīng)用擴(kuò)展MSI在實(shí)體腫瘤診療中的重要性報(bào)告內(nèi)容規(guī)范化要求報(bào)告必須包含檢測方法、MSI狀態(tài)分級（如MSI-H/MSI-L/MSS）、臨床意義解讀及后續(xù)治療建議模板。質(zhì)控要求升級新增實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控指標(biāo)（如樣本DNA質(zhì)量、批次間重復(fù)性）和外部質(zhì)評參與頻率的強(qiáng)制性規(guī)定。技術(shù)方法優(yōu)化明確推薦NGS為MSI檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，并詳細(xì)規(guī)定Panel設(shè)計(jì)、閾值設(shè)定及生信分析流程，以提高敏感性和特異性。2025版指南核心更新要點(diǎn)檢測前樣本要求2.適用樣本類型及采集規(guī)范樣本類型多樣性：指南明確推薦使用福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織作為首選樣本類型，因其在臨床病理實(shí)踐中廣泛可得且便于長期保存；同時(shí)指出新鮮冷凍組織可作為補(bǔ)充選擇，尤其適用于需要高純度DNA的研究場景。采集流程標(biāo)準(zhǔn)化：強(qiáng)調(diào)術(shù)中或活檢樣本需在離體后30分鐘內(nèi)完成固定，避免組織自溶；固定液應(yīng)使用10%中性緩沖福爾馬林，固定時(shí)間嚴(yán)格控制在6-72小時(shí)范圍內(nèi)，防止DNA過度降解或交聯(lián)。臨床信息完整性：要求樣本必須附帶詳細(xì)的病理診斷報(bào)告（包括腫瘤細(xì)胞含量、壞死區(qū)域比例等），并標(biāo)注患者治療史（如是否接受過放療/化療），這些因素可能直接影響MSI檢測結(jié)果的可靠性。切片制備要求推薦使用5-10μm連續(xù)切片，需經(jīng)HE染色確認(rèn)腫瘤細(xì)胞富集區(qū)域（≥20%腫瘤細(xì)胞含量），避免間質(zhì)或壞死區(qū)域干擾；每例樣本至少制備3張未染色切片用于DNA提取。DNA提取方法優(yōu)先選擇經(jīng)CE-IVD認(rèn)證的試劑盒，要求提取的DNA總量≥50ng（濃度≥5ng/μL），A260/A280比值在1.7-2.0之間；對于FFPE樣本需額外評估DNA片段化程度（DV200≥30%）。防污染措施實(shí)驗(yàn)全程需在PCR潔凈環(huán)境下操作，不同病例樣本間更換刀片并清潔工作臺(tái)面，每批次提取設(shè)置陰性對照以監(jiān)測交叉污染。組織處理與DNA提取標(biāo)準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞含量評估要求病理醫(yī)師通過顯微鏡評估腫瘤細(xì)胞占比，建議采用數(shù)字化圖像分析系統(tǒng)輔助定量，確保目標(biāo)區(qū)域腫瘤細(xì)胞密度符合檢測閾值（通?！?0%）。對于低腫瘤含量樣本（10%-20%），需通過顯微切割或流式分選等技術(shù)富集腫瘤細(xì)胞，或在報(bào)告中明確說明可能存在的假陰性風(fēng)險(xiǎn)。樣本質(zhì)控關(guān)鍵參數(shù)DNA質(zhì)量驗(yàn)證采用熒光定量法（如Qubit）精確測定DNA濃度，避免紫外分光光度法對降解DNA的估值偏差；通過電泳或微流控芯片（如Bioanalyzer）檢測DNA片段分布，F(xiàn)FPE樣本DV200≥30%為合格標(biāo)準(zhǔn)。對高度降解樣本（DV200<30%）需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，必要時(shí)采用全基因組擴(kuò)增技術(shù)補(bǔ)救，但需在報(bào)告中注明可能影響檢測靈敏度。樣本質(zhì)控關(guān)鍵參數(shù)樣本標(biāo)識(shí)與追溯實(shí)施雙重標(biāo)識(shí)系統(tǒng)（如病例編號+樣本條碼），確保從接收、處理到檢測全流程可追溯；電子化記錄樣本存儲(chǔ)位置及檢測人員操作日志，符合GLP/GCP規(guī)范要求。建立樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)（如標(biāo)簽?zāi)：⒐潭ú划?dāng)、核酸嚴(yán)重降解），對不合格樣本需記錄原因并通知臨床重新采集。樣本質(zhì)控關(guān)鍵參數(shù)MSI分析技術(shù)方法3.高靈敏度與特異性：采用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增5個(gè)以上微衛(wèi)星位點(diǎn)（如NR-21、BAT-25等），通過毛細(xì)管電泳分離片段，可檢測單堿基差異，靈敏度達(dá)95%以上，特異性超過98%，是Lynch綜合征篩查的首選方法。標(biāo)準(zhǔn)化Panel推薦：建議使用NCI推薦的BethesdaPanel（BAT-25/BAT-26/NR-21/NR-24/MONO-27）或PromegaMSIAnalysisSystem，確保不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果可比性。雙樣本對照要求：必須同步檢測腫瘤組織與匹配正常組織（血液或癌旁組織），排除種系多態(tài)性干擾，判讀標(biāo)準(zhǔn)為≥2個(gè)位點(diǎn)不穩(wěn)定即為MSI-H（高度不穩(wěn)定）。自動(dòng)化分析優(yōu)勢：配合GeneMapper等軟件實(shí)現(xiàn)峰值面積定量，可客觀計(jì)算等位基因偏移比例，降低人工判讀主觀誤差。PCR+毛細(xì)管電泳金標(biāo)準(zhǔn)濕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)新建立NGS方案需通過≥50例已知MSI狀態(tài)樣本驗(yàn)證，要求與PCR-CE法一致性≥90%，覆蓋深度需達(dá)到500×以上以確保低頻變異檢出。生物信息學(xué)優(yōu)化必須包含微衛(wèi)星區(qū)域特異性比對算法（如MSIsensor、MANTIS），并設(shè)置閾值（通常為≥10%位點(diǎn)不穩(wěn)定判定MSI-H），需定期更新數(shù)據(jù)庫排除偽陽性。多基因Panel兼容性推薦整合MSI檢測與腫瘤突變負(fù)荷（TMB）分析，如OncoKDM、MSK-IMPACT等Panel需包含≥20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)以提高泛癌種適用性。質(zhì)控體系建立要求設(shè)置陽性/陰性對照，監(jiān)控測序均一性（覆蓋CV<15%），并定期參與EMQN室間質(zhì)評。01020304NGS檢測方案驗(yàn)證要求MMR蛋白檢測原理通過IHC檢測MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達(dá)缺失，與MSI結(jié)果一致性約85%-90%，但需注意PMS2次級失活導(dǎo)致的假陽性。雙抗體組合策略推薦同時(shí)檢測MLH1/PMS2和MSH2/MSH6，若MLH1缺失需追加BRAFV600E突變或MLH1甲基化分析排除散發(fā)病例。判讀標(biāo)準(zhǔn)化要求采用維也納評分系統(tǒng)（0=完全缺失，1=異質(zhì)性表達(dá)，2=正常），僅核染色有意義，需由兩名病理醫(yī)師獨(dú)立復(fù)核。特殊樣本處理針對活檢小標(biāo)本需優(yōu)化抗原修復(fù)條件（如pH9.0EDTA緩沖液），壞死組織超過50%時(shí)應(yīng)重新取樣。免疫組化替代性評估結(jié)果判讀與分級4.微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）：指檢測的微衛(wèi)星位點(diǎn)中未發(fā)現(xiàn)明顯的不穩(wěn)定性，表明DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)功能正常，通常與較低的免疫治療反應(yīng)率相關(guān)。微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（MSI-L）：指在檢測的微衛(wèi)星位點(diǎn)中，僅有少數(shù)（通常小于30%）表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，提示可能存在部分DNA錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷，但臨床意義尚不明確。微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-H）：指在檢測的微衛(wèi)星位點(diǎn)中，超過30%-40%的位點(diǎn)表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，表明DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)功能顯著缺陷，與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的高反應(yīng)率和Lynch綜合征密切相關(guān)。分級依據(jù)：MSI狀態(tài)的分級通常基于國際共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)，如NCIPanel（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250）或PromegaPanel（BAT25、BAT26、NR21、NR24、MONO27），并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室自建驗(yàn)證數(shù)據(jù)。MSI狀態(tài)分級標(biāo)準(zhǔn)（MSS/MSI-L/MSI-H）位點(diǎn)不穩(wěn)定性閾值設(shè)定位點(diǎn)不穩(wěn)定性閾值通常通過比較腫瘤組織與正常組織的PCR擴(kuò)增片段大小差異來設(shè)定，差異超過預(yù)設(shè)閾值（如2-3個(gè)堿基對）即判定為不穩(wěn)定。閾值定義閾值設(shè)定需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證數(shù)據(jù)，并根據(jù)不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的自然變異頻率進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整，以提高檢測的敏感性和特異性。動(dòng)態(tài)調(diào)整閾值設(shè)定后需通過臨床樣本驗(yàn)證，確保其能夠準(zhǔn)確區(qū)分MSS、MSI-L和MSI-H狀態(tài)，并與免疫組化（IHC）或二代測序（NGS）結(jié)果一致。臨床驗(yàn)證復(fù)核檢測對于結(jié)果不明確或矛盾的樣本，建議重復(fù)檢測，包括重新提取DNA、重復(fù)PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳分析，以排除技術(shù)誤差。多平臺(tái)驗(yàn)證疑難樣本可結(jié)合免疫組化（IHC）檢測MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）表達(dá)，或采用二代測序（NGS）進(jìn)行驗(yàn)證，以提高結(jié)果的可信度。專家會(huì)診對于經(jīng)過復(fù)核和多平臺(tái)驗(yàn)證仍無法明確的結(jié)果，建議提交多學(xué)科團(tuán)隊(duì)（MDT）或參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行專家會(huì)診，綜合臨床病史和其他分子檢測結(jié)果進(jìn)行判讀。報(bào)告?zhèn)渥⒃谧罱K報(bào)告中需詳細(xì)記錄疑難結(jié)果的處理流程和結(jié)論，并注明可能的局限性，為臨床醫(yī)生提供全面的決策依據(jù)。疑難結(jié)果處理流程臨床報(bào)告規(guī)范5.報(bào)告需明確標(biāo)注患者姓名、性別、年齡、唯一標(biāo)識(shí)符（如病歷號）及樣本采集日期，確保數(shù)據(jù)可追溯性，同時(shí)符合GDPR等隱私保護(hù)法規(guī)要求。詳細(xì)說明采用的MSI檢測技術(shù)（如PCR毛細(xì)管電泳、NGSpanel）、具體微衛(wèi)星位點(diǎn)組合（如NR-27/BAT-25/BAT-26等）及分析軟件版本，需注明是否符合EMQN驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。明確區(qū)分MSI狀態(tài)（MSI-H、MSI-L、MSS），定義判定閾值（如≥2/5位點(diǎn)不穩(wěn)定為MSI-H），并附實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證數(shù)據(jù)以支持分類的科學(xué)性?；颊呋拘畔z測方法與平臺(tái)結(jié)果分類與閾值必報(bào)要素與標(biāo)準(zhǔn)化模板Lynch綜合征關(guān)聯(lián)提示若檢測到MSI-H，需在報(bào)告中強(qiáng)調(diào)與Lynch綜合征（遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌）的潛在關(guān)聯(lián)，建議進(jìn)行MMR基因（MLH1/MSH2/MSH6/PMS2）胚系突變檢測。檢測局限性說明需注明MSI檢測無法區(qū)分散發(fā)性（如MLH1啟動(dòng)子甲基化）與遺傳性MMR缺陷，需結(jié)合免疫組化（IHC）或甲基化分析進(jìn)一步鑒別。倫理與心理支持建議報(bào)告包含遺傳咨詢資源鏈接或聯(lián)系方式，并提供心理支持指引，幫助患者理解結(jié)果對家庭成員的潛在影響。家族風(fēng)險(xiǎn)評估明確告知患者M(jìn)SI-H結(jié)果可能提示家族性癌癥風(fēng)險(xiǎn)，需記錄三代家族史（尤其是結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等），并推薦一級親屬進(jìn)行遺傳咨詢。遺傳咨詢關(guān)聯(lián)性說明免疫治療響應(yīng)預(yù)測明確標(biāo)注MSI-H狀態(tài)與PD-1/PD-L1抑制劑（如帕博利珠單抗）療效的正相關(guān)性，引用KEYNOTE-164/158等臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持推薦等級（如NCCN指南Ⅰ類證據(jù)）?；煼桨刚{(diào)整建議針對MSI-H患者，提示5-FU類化療藥物可能療效有限，需結(jié)合TNM分期討論奧沙利鉑或伊立替康為基礎(chǔ)的替代方案。臨床試驗(yàn)推薦列出適合MSI-H患者的在研靶向治療或聯(lián)合免疫治療臨床試驗(yàn)（如NCT編號），并標(biāo)注可通過ClinicalT獲取詳細(xì)信息。治療決策支持信息質(zhì)量管理體系6.要點(diǎn)三樣本前處理標(biāo)準(zhǔn)化需嚴(yán)格規(guī)范樣本采集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件，確保DNA完整性（如FFPE樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融），并記錄樣本質(zhì)量評估指標(biāo)（如DV200值）。要點(diǎn)一要點(diǎn)二檢測體系驗(yàn)證要求對MSI檢測panel的靈敏度（至少5%突變等位基因頻率）、特異性（與金標(biāo)準(zhǔn)比對一致性≥95%）及可重復(fù)性（批內(nèi)/間CV＜10%）進(jìn)行完整驗(yàn)證。數(shù)據(jù)分析質(zhì)控必須設(shè)置內(nèi)參位點(diǎn)（如NR-21、BAT-25等）的峰型閾值，明確判讀標(biāo)準(zhǔn)（如≥40%位點(diǎn)不穩(wěn)定判定為MSI-H），并建立人工復(fù)核機(jī)制。要點(diǎn)三室內(nèi)質(zhì)控關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室需至少參加2次國際權(quán)威機(jī)構(gòu)（如EMQN、CAP）組織的MSI室間質(zhì)評，且連續(xù)3年成績合格率需≥90%。年度參與頻次質(zhì)評樣本應(yīng)包含F(xiàn)FPE組織、液體活檢等不同基質(zhì)，且MSI-H/MSI-L/MSS三種狀態(tài)比例符合臨床實(shí)際分布。樣本類型覆蓋要求完整提交原始數(shù)據(jù)（如電泳圖譜/NGSreads）、分析參數(shù)及臨床解讀建議，禁止僅報(bào)告最終分類結(jié)果。結(jié)果上報(bào)規(guī)范對不符合結(jié)果需執(zhí)行根本原因分析（RCA），形成糾正預(yù)防措施報(bào)告，并在30個(gè)工作日