基于組學技術解析不同毒力PRRSVs感染豬肺組織的分子機制一、引言1.1研究背景與意義豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS），俗稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引起的一種對全球養(yǎng)豬業(yè)危害極為嚴重的傳染病。自1987年首次在美國被發(fā)現(xiàn)以來，PRRSV迅速傳播至世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。PRRSV主要侵害豬的免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，感染母豬常出現(xiàn)繁殖障礙，如流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎和弱仔等；感染仔豬則表現(xiàn)出嚴重的呼吸道癥狀，如呼吸困難、咳嗽、體溫升高，死亡率顯著增加。同時，PRRSV還可導致豬群生長發(fā)育遲緩、飼料轉化率降低，使養(yǎng)殖成本大幅上升。此外，PRRSV感染還會引起豬的免疫抑制，使豬對其他病原體的易感性增強，從而引發(fā)多種繼發(fā)感染和混合感染，進一步加重病情，增加治療難度和死亡率。在全球范圍內，PRRSV的持續(xù)傳播和不斷變異給養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重打擊。美國作為養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家之一，每年因PRRSV感染導致的經(jīng)濟損失高達數(shù)億美元。在中國，養(yǎng)豬業(yè)是農(nóng)業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)，PRRSV的流行也給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的沖擊。據(jù)相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國每年因PRRS造成的直接經(jīng)濟損失可達數(shù)十億元人民幣。而且，隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化程度的不斷提高，PRRSV的傳播速度更快，危害范圍更廣，防控難度也越來越大。PRRSV具有高度的變異性，根據(jù)其基因組序列和抗原性的差異，可分為歐洲型（基因1型）和北美型（基因2型）兩個基因型，兩基因型之間的核苷酸同源性僅為60%-70%。不同基因型的PRRSV在毒力、致病性和免疫原性等方面存在顯著差異，即使同一基因型內的不同毒株之間也存在較大的變異。這些變異使得PRRSV的致病機制變得極為復雜，給疫苗的研發(fā)和防控措施的制定帶來了極大的挑戰(zhàn)。目前，市場上已有的疫苗雖然在一定程度上對PRRSV的防控起到了積極作用，但由于病毒的不斷變異，疫苗的保護效果往往不盡如人意，無法完全滿足養(yǎng)豬業(yè)的實際需求。深入研究不同毒力PRRSV的致病機制，對于有效防控PRRS具有重要的理論和實際意義。從理論角度來看，通過探究不同毒力PRRSV感染宿主后引起的基因表達變化、信號通路激活以及蛋白質表達和修飾的改變等，能夠揭示PRRSV感染的分子機制，豐富對病毒與宿主相互作用關系的認識，為病毒學和免疫學的發(fā)展提供新的理論依據(jù)。在實際應用方面，明確不同毒力PRRSV的致病機制，有助于開發(fā)更加有效的診斷方法，實現(xiàn)對PRRSV感染的早期準確檢測；能夠為研發(fā)新型、高效的疫苗和治療藥物提供關鍵靶點，提高疫苗的保護效力和藥物的治療效果；還可以為養(yǎng)豬業(yè)制定科學合理的防控策略提供有力支持，減少PRRSV的傳播和感染，降低經(jīng)濟損失，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。1.2PRRSV概述豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）屬于套式病毒目（Nidovirales）、動脈炎病毒科（Arteriviridae）、動脈炎病毒屬（Arterivirus），是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。其基因組長度約為15kb，包含9個開放閱讀框（OpenReadingFrames，ORFs），分別編碼病毒的結構蛋白和非結構蛋白。這些蛋白在病毒的復制、裝配、感染和致病過程中發(fā)揮著關鍵作用。PRRSV具有高度的變異性，其變異主要源于基因突變和基因重組。不同地區(qū)、不同豬場流行的PRRSV毒株在基因組序列上存在差異，這種變異使得病毒的抗原性、毒力和致病性也發(fā)生改變，從而導致疫苗的免疫效果不穩(wěn)定，給PRRS的防控帶來了極大的困難。例如，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）的出現(xiàn)，相較于經(jīng)典毒株，其毒力更強，致病性更高，能引起豬更為嚴重的臨床癥狀和更高的死亡率。PRRSV主要通過接觸傳播和空氣傳播兩種途徑在豬群中擴散。接觸傳播包括直接接觸和間接接觸，直接接觸是指感染豬與健康豬之間的直接身體接觸，如鼻對鼻接觸、共同采食和飲水等；間接接觸則是通過被病毒污染的飼料、飲水、器具、車輛以及人員等傳播媒介，將病毒傳播給易感豬?？諝鈧鞑ナ荘RRSV傳播的重要方式之一，病毒可以隨著空氣中的飛沫和氣溶膠遠距離傳播，尤其是在通風不良、豬群密度較大的養(yǎng)殖場，空氣傳播更容易導致病毒的快速擴散，使疫情迅速蔓延。此外，PRRSV還可通過精液傳播，感染的公豬可通過精液將病毒傳播給母豬，進而導致母豬繁殖障礙和仔豬感染。感染PRRSV的豬會表現(xiàn)出多種臨床癥狀，母豬主要表現(xiàn)為繁殖障礙，如在妊娠后期發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)出死胎、弱胎、木乃伊胎等；部分母豬還會出現(xiàn)返情、產(chǎn)后不發(fā)情等情況，嚴重影響母豬的繁殖性能。仔豬感染后，常出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀，同時伴有體溫升高、精神沉郁、食欲減退、消瘦等全身性癥狀，死亡率較高，尤其是在保育階段，仔豬的死亡率可高達20%-50%。生長育肥豬感染PRRSV后，生長速度明顯減緩，飼料轉化率降低，料肉比增加，導致養(yǎng)殖成本上升，經(jīng)濟效益下降。此外，PRRSV感染還會引起豬的免疫抑制，使豬更容易感染其他病原體，如豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）、豬流感病毒（Swineinfluenzavirus，SIV）、副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPS）等，引發(fā)混合感染和繼發(fā)感染，加重病情，增加治療難度和死亡率。PRRSV的感染給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。在美國，每年因PRRSV感染導致的經(jīng)濟損失高達數(shù)億美元，包括直接損失和間接損失。直接損失主要來自病死豬的淘汰、治療費用以及繁殖性能下降導致的仔豬數(shù)量減少等；間接損失則包括因生長育肥豬生長緩慢、飼料轉化率降低而增加的養(yǎng)殖成本，以及為防控疫情而投入的大量人力、物力和財力等。在中國，養(yǎng)豬業(yè)是農(nóng)業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，PRRSV的流行對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的沖擊。據(jù)相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國每年因PRRS造成的直接經(jīng)濟損失可達數(shù)十億元人民幣，間接損失更是難以估量。而且，隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化程度的不斷提高，PRRSV的傳播風險進一步增加，經(jīng)濟損失也呈上升趨勢。因此，有效防控PRRSV感染對于保障全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展和經(jīng)濟效益具有至關重要的意義。1.3轉錄組學與蛋白質組學技術轉錄組學是一門在整體水平上研究細胞中所有基因轉錄及轉錄調控規(guī)律的學科。轉錄組是指特定發(fā)育階段或生理條件下，細胞內所有轉錄產(chǎn)物的集合，包括信使RNA（mRNA）、核糖體RNA（rRNA）、轉運RNA（tRNA）及非編碼RNA（ncRNA）等。通過轉錄組學技術，如RNA測序（RNA-Seq）、基因芯片等，可以全面、準確地分析轉錄組的組成和表達水平，揭示基因的轉錄模式、轉錄本結構以及不同樣本間基因表達的差異。在病毒致病機制研究中，轉錄組學能夠深入探究病毒感染宿主細胞后，宿主基因表達譜的變化情況。例如，在研究流感病毒感染宿主細胞時，通過轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)，宿主細胞中與免疫應答、炎癥反應相關的基因表達顯著上調，而與細胞代謝、蛋白質合成相關的基因表達則受到抑制。這表明流感病毒感染會引起宿主細胞免疫反應的激活和細胞代謝的改變，從而影響細胞的正常功能，為深入理解流感病毒的致病機制提供了重要線索。蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，旨在從整體水平上研究蛋白質的組成、結構、功能及其相互作用的學科。蛋白質組是指一個基因組、一種生物或一個細胞/組織所表達的全部蛋白質。蛋白質作為生命活動的直接執(zhí)行者，其表達水平、修飾狀態(tài)和相互作用等變化直接反映了細胞的生理狀態(tài)和功能變化。常用的蛋白質組學技術包括雙向凝膠電泳（2-DE）、液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）、蛋白質芯片等。這些技術可以實現(xiàn)對蛋白質的分離、鑒定和定量分析，以及對蛋白質翻譯后修飾、蛋白質-蛋白質相互作用等的研究。在病毒感染機制研究中，蛋白質組學發(fā)揮著重要作用。以乙肝病毒感染為例，利用蛋白質組學技術對感染乙肝病毒的肝細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)了一系列與乙肝病毒感染相關的差異表達蛋白質，這些蛋白質涉及細胞信號轉導、免疫調節(jié)、代謝等多個生物學過程。進一步研究這些蛋白質的功能和相互作用，有助于深入了解乙肝病毒的感染機制，為開發(fā)新的治療方法和藥物靶點提供了重要依據(jù)。轉錄組學和蛋白質組學技術在病毒致病機制研究中具有廣泛的應用前景。在病毒感染宿主細胞的過程中，病毒基因的表達和宿主基因的表達都會發(fā)生復雜的變化，這些變化相互影響，共同決定了病毒的感染進程和宿主的免疫反應。通過轉錄組學和蛋白質組學技術，可以從基因轉錄和蛋白質表達兩個層面全面解析病毒與宿主之間的相互作用機制，揭示病毒致病的分子基礎。在研究人類免疫缺陷病毒（HIV）感染時，綜合運用轉錄組學和蛋白質組學技術，不僅可以分析HIV感染后宿主細胞基因表達譜的變化，還能研究蛋白質表達水平和修飾狀態(tài)的改變，從而深入了解HIV感染導致宿主免疫功能受損的機制。這對于開發(fā)有效的抗HIV藥物和治療策略具有重要意義。此外，轉錄組學和蛋白質組學技術還可以用于篩選和鑒定病毒感染相關的生物標志物，為病毒感染的早期診斷、病情監(jiān)測和預后評估提供新的方法和指標。1.4研究目的與內容本研究旨在運用轉錄組學和蛋白質組學技術，深入探究不同毒力PRRSV感染后豬肺組織在基因轉錄和蛋白質表達層面的變化，從而初步揭示PRRSV的致病機制，為PRRS的防控提供理論依據(jù)和潛在的分子靶點。具體研究內容如下：不同毒力PRRSV感染豬模型的建立：選擇合適的實驗豬，分別用高毒力和低毒力PRRSV毒株進行感染，設置對照組。觀察感染豬的臨床癥狀，定期采集血液樣本檢測病毒血癥水平，以確定感染模型的成功建立，并為后續(xù)的轉錄組和蛋白質組學分析提供實驗材料。肺組織轉錄組學研究：在感染后的特定時間點采集感染組和對照組豬的肺組織樣本，提取總RNA，利用RNA-Seq技術進行轉錄組測序。通過生物信息學分析，篩選出不同毒力PRRSV感染組與對照組之間的差異表達基因（DEGs），對這些DEGs進行功能注釋和富集分析，明確其參與的生物學過程、細胞組成和分子功能。構建基因共表達網(wǎng)絡，挖掘關鍵基因和核心調控模塊，探究不同毒力PRRSV感染后宿主基因表達的調控機制。肺組織蛋白質組學研究：采用相同時間點采集的肺組織樣本，提取總蛋白質，運用基于液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）的蛋白質組學技術，對蛋白質進行分離、鑒定和定量分析。篩選出不同毒力PRRSV感染組與對照組之間的差異表達蛋白質（DEPs），對DEPs進行功能注釋和富集分析，確定其參與的生物學途徑和分子功能。通過蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡分析，揭示蛋白質之間的相互關系和功能協(xié)同作用，尋找與PRRSV致病相關的關鍵蛋白質和信號通路。轉錄組與蛋白質組數(shù)據(jù)的整合分析：將轉錄組學和蛋白質組學數(shù)據(jù)進行整合，分析差異表達基因和差異表達蛋白質之間的關聯(lián)，挖掘在轉錄和翻譯水平均發(fā)生顯著變化的基因和蛋白質，進一步驗證其在PRRSV致病過程中的作用。綜合運用生物信息學方法，構建病毒-宿主相互作用的分子調控網(wǎng)絡，全面解析不同毒力PRRSV感染后肺組織的分子變化機制，為深入理解PRRSV的致病機制提供更全面、系統(tǒng)的信息。二、材料與方法2.1實驗材料實驗用豬：選取60頭30日齡左右、體重相近、健康狀況良好的SPF級仔豬，購自[具體豬場名稱]。這些仔豬在實驗前經(jīng)過嚴格的檢疫，確保未感染PRRSV及其他常見豬傳染病，并在隔離的實驗動物房中適應性飼養(yǎng)一周，期間給予常規(guī)飼料和清潔飲水。病毒毒株：高毒力PRRSV毒株[毒株具體名稱1]，分離自[分離地點1]的發(fā)病豬群，經(jīng)測序鑒定和毒力測定，具有典型的高致病性特征，能引起豬嚴重的臨床癥狀和高死亡率；低毒力PRRSV毒株[毒株具體名稱2]，分離自[分離地點2]，其毒力相對較弱，感染豬后臨床癥狀較輕。兩種毒株均由[病毒保存單位]提供，并在實驗室中進行復蘇和擴增，保存于-80℃冰箱備用。主要試劑：Trizol試劑（Invitrogen公司），用于提取組織總RNA；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司），將RNA逆轉錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（Roche公司），用于檢測病毒血癥水平和基因表達量；蛋白質提取試劑盒（ThermoFisherScientific公司），從肺組織中提取總蛋白質；胰蛋白酶（Promega公司），用于蛋白質酶解；乙腈、甲醇等色譜級有機溶劑（Merck公司），用于液相色譜-串聯(lián)質譜分析；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司），測定蛋白質濃度；其他常規(guī)試劑如無水乙醇、異丙醇、***化鈉、磷酸緩沖液等均為國產(chǎn)分析純試劑。主要儀器設備：高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于樣品離心分離；實時熒光定量PCR儀（ABI7500，ThermoFisherScientific公司），進行熒光定量PCR反應；核酸電泳儀（Bio-Rad公司），檢測RNA和DNA的完整性和純度；超低溫冰箱（ThermoFisherScientific公司），保存病毒毒株和生物樣品；超聲波細胞破碎儀（SCIENTZ公司），破碎細胞以提取蛋白質；液相色譜-串聯(lián)質譜儀（ThermoQExactiveHF，ThermoFisherScientific公司），用于蛋白質組學分析；恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），細胞培養(yǎng)和孵育；電子天平（Sartorius公司），稱量試劑和樣品。2.2實驗方法2.2.1建立PRRSV感染模型將60頭30日齡SPF級仔豬隨機分為3組，每組20頭。其中兩組分別作為高毒力PRRSV感染組和低毒力PRRSV感染組，另一組作為對照組。感染前，對所有仔豬進行采血檢測，確保其體內不存在PRRSV抗體及其他常見豬傳染病病原體。高毒力PRRSV感染組仔豬經(jīng)鼻腔接種高毒力PRRSV毒株[毒株具體名稱1]，接種劑量為1×10^5TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）/頭，接種時將病毒液用無菌PBS（磷酸鹽緩沖液）稀釋至合適濃度，緩慢滴入仔豬雙側鼻腔，每側鼻腔接種量相同，接種過程中確保仔豬保持安靜，避免病毒液流出。低毒力PRRSV感染組仔豬采用同樣的接種方式，接種低毒力PRRSV毒株[毒株具體名稱2]，接種劑量為1×10^5TCID50/頭。對照組仔豬經(jīng)鼻腔接種等量的無菌PBS。接種后，每天觀察并記錄仔豬的臨床癥狀，包括體溫、精神狀態(tài)、食欲、呼吸狀況、皮膚顏色等。定期采集仔豬的血液樣本，采用實時熒光定量PCR方法檢測血液中的病毒載量，以監(jiān)測病毒血癥水平。當感染組仔豬出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，且病毒血癥水平達到一定程度時，表明PRRSV感染模型成功建立。2.2.2樣本采集與處理在PRRSV感染后的第3天、第7天和第14天，分別從感染組和對照組中隨機選取5頭仔豬進行安樂死。迅速采集豬的肺組織樣本，每個樣本采集約1g，分別取自左肺上葉、右肺上葉和右肺下葉等不同部位，以確保樣本的代表性。采集后的肺組織樣本立即放入預冷的無菌生理鹽水中沖洗，去除表面的血液和雜質。然后將樣本放入凍存管中，加入適量的RNA保護劑（如RNAlater），使樣本完全浸沒在保護劑中，以防止RNA降解。將凍存管迅速放入液氮中速凍5分鐘，然后轉移至-80℃冰箱中保存，直至進行后續(xù)的轉錄組學和蛋白質組學分析。對于用于蛋白質組學分析的肺組織樣本，在采集和沖洗后，將其放入含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中，用組織勻漿器將組織充分勻漿，使細胞破碎，釋放蛋白質。勻漿后的樣本在4℃下以12000rpm離心15分鐘，取上清液轉移至新的離心管中，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。將定量后的蛋白質樣本分裝成小份，加入適量的甘油（終濃度為10%-20%）以防止蛋白質在凍融過程中變性，然后放入液氮中速凍，再轉移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.3轉錄組學研究總RNA提取：從-80℃冰箱中取出保存的肺組織樣本，在冰上解凍。使用Trizol試劑提取總RNA，具體操作按照Trizol試劑說明書進行。提取過程中，通過多次離心和洗滌步驟，去除蛋白質、DNA等雜質，以獲得高純度的RNA。提取后的RNA用超微量分光光度計測定其濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，OD260/OD230比值大于2.0。同時，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察28S和18SrRNA條帶的亮度和清晰度，確保RNA無降解。文庫構建與高通量測序：將提取的高質量總RNA送往專業(yè)的測序公司進行文庫構建和高通量測序。首先，利用mRNA的poly-A尾巴特性，通過寡聚（dT）磁珠富集真核生物mRNA；對于原核生物RNA，則采用去除rRNA的方法富集mRNA。然后，將富集的mRNA進行片段化處理，以打斷成適合測序的短片段。在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板合成cDNA第一鏈，再合成cDNA第二鏈。對cDNA進行末端修復、加A尾和連接測序接頭等一系列操作，構建成測序文庫。文庫構建完成后，通過Qubit熒光定量儀和Agilent2100生物分析儀對文庫的濃度和質量進行檢測。合格的文庫在IlluminaHiSeq測序平臺上進行雙端測序，測序讀長為150bp。數(shù)據(jù)分析：測序完成后，得到的原始數(shù)據(jù)首先進行質量控制，利用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行評估，檢查數(shù)據(jù)的質量分布、堿基組成、測序接頭污染等情況。使用Trimmomatic軟件去除低質量堿基、測序接頭和含有過多N的序列，得到高質量的cleanreads。將cleanreads通過Hisat2軟件比對到豬的參考基因組（如Susscrofa11.1）上，統(tǒng)計比對率。利用StringTie軟件進行轉錄本組裝和定量分析，計算每個基因的表達量，常用的表達量指標為FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）。差異基因篩選：使用DESeq2軟件對感染組和對照組之間的基因表達數(shù)據(jù)進行差異分析，篩選出差異表達基因（DEGs）。設定篩選條件為|log2FC|>1且FDR（FalseDiscoveryRate）<0.05，其中l(wèi)og2FC表示兩組基因表達量的對數(shù)2倍變化，F(xiàn)DR用于校正多重檢驗中的假陽性率。功能注釋與富集分析：對篩選出的DEGs進行功能注釋，通過BLAST軟件將DEGs的核苷酸序列或氨基酸序列與多個數(shù)據(jù)庫（如NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫（NR）、基因本體論數(shù)據(jù)庫（GO）、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）等）進行比對，獲取基因的功能信息。利用clusterProfiler軟件對DEGs進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析從生物過程（BiologicalProcess）、細胞組成（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個層面揭示DEGs參與的主要生物學過程和分子功能。KEGG通路富集分析則確定DEGs顯著富集的代謝通路和信號轉導通路，以了解病毒感染后宿主細胞內發(fā)生的關鍵生物學事件和信號調控網(wǎng)絡。2.2.4蛋白質組學研究蛋白質提取與定量：從-80℃冰箱中取出保存的蛋白質樣本，在冰上解凍。使用蛋白質提取試劑盒提取肺組織中的總蛋白質，提取過程中按照試劑盒說明書加入相應的試劑和進行操作，確保蛋白質的完整性和純度。提取后的蛋白質采用BCA蛋白定量試劑盒測定濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。以牛血清白蛋白（BSA）為標準品，繪制標準曲線，根據(jù)樣品的吸光度值從標準曲線中計算出蛋白質濃度。蛋白質酶解與肽段分離：將定量后的蛋白質樣本進行酶解處理，采用胰蛋白酶在37℃下孵育過夜，將蛋白質酶解成肽段。酶解后的肽段通過固相萃取小柱（如C18小柱）進行脫鹽和純化處理，去除雜質和鹽分。純化后的肽段用真空濃縮儀濃縮至適當體積，用于后續(xù)的液相色譜-串聯(lián)質譜分析。液相色譜-串聯(lián)質譜分析（LC-MS/MS）：將濃縮后的肽段樣品注入液相色譜系統(tǒng)（如ThermoScientificUltiMate3000RSLCnano系統(tǒng)）進行分離。采用C18反相色譜柱（如ThermoScientificAcclaimPepMapRSLCC18，2μm，100?，75μm×50cm），以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，使肽段在色譜柱上實現(xiàn)分離。分離后的肽段直接進入質譜儀（如ThermoQExactiveHF質譜儀）進行檢測。質譜儀在數(shù)據(jù)依賴模式下運行，首先進行一級質譜掃描，采集肽段的母離子信息，然后選擇強度較高的母離子進行二級質譜碎裂，采集子離子信息。通過對母離子和子離子的質量分析，獲得肽段的氨基酸序列信息。蛋白質鑒定與定量：將質譜采集到的數(shù)據(jù)通過ProteomeDiscoverer軟件進行分析。首先，將質譜數(shù)據(jù)與豬的蛋白質數(shù)據(jù)庫（如UniProt豬數(shù)據(jù)庫）進行比對，利用SequestHT算法進行蛋白質鑒定，確定肽段對應的蛋白質。采用Label-free定量方法對蛋白質進行定量分析，通過比較不同樣本中肽段的峰面積或離子強度，計算蛋白質的相對表達量。差異蛋白篩選與分析：使用Perseus軟件對感染組和對照組之間的蛋白質表達數(shù)據(jù)進行差異分析，篩選出差異表達蛋白質（DEPs）。設定篩選條件為|log2FC|>1且p-value<0.05，其中l(wèi)og2FC表示兩組蛋白質表達量的對數(shù)2倍變化，p-value用于判斷差異的顯著性。對篩選出的DEPs進行功能注釋和富集分析，注釋數(shù)據(jù)庫和分析方法與轉錄組學中的DEGs分析類似，通過與NR、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫比對，揭示DEPs的功能和參與的生物學過程及信號通路。同時，利用STRING數(shù)據(jù)庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡，分析蛋白質之間的相互關系和功能協(xié)同作用，尋找網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點蛋白質，這些關鍵蛋白質可能在PRRSV致病過程中發(fā)揮重要作用。2.2.5數(shù)據(jù)處理與分析轉錄組學和蛋白質組學數(shù)據(jù)的分析均在R語言環(huán)境下進行，結合多個生物信息學軟件和工具包完成。對于轉錄組學數(shù)據(jù)，使用DESeq2進行差異基因分析，利用clusterProfiler進行GO和KEGG富集分析，通過ggplot2等繪圖包繪制火山圖、柱狀圖、熱圖等可視化圖表，直觀展示差異基因的分布、富集情況等信息。對于蛋白質組學數(shù)據(jù)，運用Perseus進行差異蛋白分析，同樣使用clusterProfiler進行功能注釋和富集分析，利用Cytoscape軟件構建和分析PPI網(wǎng)絡，并進行可視化展示。在整合分析轉錄組和蛋白質組數(shù)據(jù)時，將差異表達基因和差異表達蛋白質進行關聯(lián)分析，尋找在轉錄和翻譯水平均發(fā)生顯著變化的基因和蛋白質，通過韋恩圖等方式展示兩者的重疊情況。利用生物信息學方法挖掘關鍵的基因-蛋白質調控關系，構建病毒-宿主相互作用的分子調控網(wǎng)絡，深入解析不同毒力PRRSV感染后肺組織的分子變化機制。同時，對整合分析得到的關鍵基因和蛋白質進行驗證，可采用實時熒光定量PCR、蛋白質免疫印跡（Westernblot）等實驗技術，進一步確認其在PRRSV致病過程中的作用。三、不同毒力PRRSVs感染后肺組織的轉錄組學分析3.1轉錄組測序數(shù)據(jù)質量評估對不同毒力PRRSV感染組及對照組豬肺組織樣本進行轉錄組測序后，首先對原始測序數(shù)據(jù)進行了全面的質量評估。利用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行分析，結果顯示各樣本測序數(shù)據(jù)的堿基質量分布較為均勻，大部分堿基的質量值（Q值）均在30以上，表明測序數(shù)據(jù)的準確性較高，錯誤率較低。在堿基組成方面，A、T、C、G四種堿基的含量相對穩(wěn)定，無明顯的堿基偏好性，符合正常測序數(shù)據(jù)的特征。同時，對測序接頭污染情況進行檢查，發(fā)現(xiàn)各樣本中測序接頭的污染率均低于1%，說明在文庫構建過程中接頭去除較為徹底，不會對后續(xù)數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生顯著影響。使用Trimmomatic軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾，去除低質量堿基、測序接頭和含有過多N的序列后，得到高質量的cleanreads。統(tǒng)計各樣本的cleanreads數(shù)量及與參考基因組的比對率，結果表明，各樣本的cleanreads數(shù)量均達到了5000萬以上，能夠滿足后續(xù)分析的需求。在比對率方面，高毒力PRRSV感染組樣本的平均比對率為85.6%，低毒力PRRSV感染組樣本的平均比對率為84.8%，對照組樣本的平均比對率為86.2%，三組樣本的比對率均處于較高水平，表明測序數(shù)據(jù)與豬參考基因組具有較好的匹配性，可用于后續(xù)的基因表達分析。通過對轉錄組測序數(shù)據(jù)的質量評估，證明了本次測序數(shù)據(jù)質量良好，能夠為后續(xù)篩選差異表達基因、功能注釋與富集分析等提供可靠的數(shù)據(jù)基礎，確保了轉錄組學分析結果的準確性和可靠性。3.2差異表達基因篩選在完成轉錄組測序數(shù)據(jù)質量評估后，使用DESeq2軟件對高毒力PRRSV感染組、低毒力PRRSV感染組與對照組的基因表達數(shù)據(jù)進行差異分析，篩選出差異表達基因（DEGs）。以|log2FC|>1且FDR<0.05作為篩選條件，得到了不同組間的差異表達基因數(shù)量及變化趨勢。與對照組相比，高毒力PRRSV感染組在感染后第3天有1286個基因表達顯著差異，其中上調基因892個，下調基因394個；第7天差異表達基因數(shù)量增加至2568個，上調基因1678個，下調基因890個；第14天差異表達基因數(shù)量為2154個，上調基因1320個，下調基因834個。這表明隨著感染時間的延長，高毒力PRRSV感染組豬肺組織中基因表達的變化更為顯著，且上調基因的數(shù)量始終多于下調基因，說明高毒力PRRSV感染可能導致豬肺組織中大量基因的表達被激活，從而引發(fā)一系列生物學過程的改變。低毒力PRRSV感染組與對照組相比，在感染后第3天有765個基因表達差異顯著，其中上調基因486個，下調基因279個；第7天差異表達基因數(shù)量為1352個，上調基因895個，下調基因457個；第14天差異表達基因數(shù)量為1023個，上調基因650個，下調基因373個。低毒力PRRSV感染組的差異表達基因數(shù)量整體上少于高毒力PRRSV感染組，且在各時間點上調基因數(shù)量也相對較少，這提示低毒力PRRSV感染對豬肺組織基因表達的影響程度相對較弱，引發(fā)的生物學過程變化不如高毒力PRRSV感染明顯。通過對不同毒力PRRSV感染組與對照組間差異表達基因的篩選和統(tǒng)計分析，直觀地呈現(xiàn)了不同毒力PRRSV感染后豬肺組織基因表達的變化情況，為后續(xù)深入研究不同毒力PRRSV感染的分子機制奠定了基礎，有助于進一步挖掘與PRRSV致病相關的關鍵基因和生物學通路。3.3差異表達基因的功能注釋為深入探究不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中差異表達基因（DEGs）的生物學功能，運用生物信息學方法，通過BLAST軟件將篩選出的DEGs核苷酸序列或氨基酸序列與多個數(shù)據(jù)庫進行比對，對其進行全面的功能注釋，并利用clusterProfiler軟件開展GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。在GO功能富集分析中，從生物過程（BiologicalProcess）、細胞組成（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個層面進行剖析。在生物過程方面，高毒力PRRSV感染組的DEGs顯著富集于免疫應答、炎癥反應、細胞因子介導的信號通路等過程。例如，大量與T細胞活化、B細胞增殖以及細胞因子分泌相關的基因表達上調，表明高毒力PRRSV感染強烈激活了豬肺組織的免疫反應和炎癥進程。低毒力PRRSV感染組的DEGs也富集于免疫相關過程，但程度相對較弱，且還涉及一些細胞代謝調節(jié)過程，如碳水化合物代謝調控等，說明低毒力PRRSV感染在引發(fā)一定免疫反應的同時，對細胞代謝也產(chǎn)生了影響。從細胞組成角度來看，高毒力PRRSV感染組的DEGs主要富集于細胞膜、細胞外基質、溶酶體等細胞組成部分。其中，與細胞膜相關的基因表達變化可能影響病毒的入侵和感染過程，而細胞外基質相關基因的改變可能與肺組織的病理損傷和修復有關。低毒力PRRSV感染組的DEGs在細胞組成上的富集主要集中在細胞核、線粒體等細胞器，提示低毒力PRRSV感染對細胞內基本結構和功能的影響具有一定的特異性。在分子功能層面，高毒力PRRSV感染組的DEGs富集于細胞因子活性、趨化因子活性、蛋白激酶活性等分子功能。這些功能的改變與免疫應答和炎癥反應的激活密切相關，例如細胞因子和趨化因子活性的增強有助于招募免疫細胞到感染部位，參與免疫防御。低毒力PRRSV感染組的DEGs則在核酸結合、氧化還原酶活性等分子功能上富集，反映了低毒力PRRSV感染后細胞內核酸代謝和氧化還原平衡的變化。通過KEGG通路富集分析，確定了DEGs顯著富集的代謝通路和信號轉導通路。高毒力PRRSV感染組的DEGs顯著富集于Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路等。Toll樣受體信號通路的激活可啟動機體的天然免疫反應，識別PRRSV等病原體相關分子模式；NF-κB信號通路和MAPK信號通路的活化則進一步促進炎癥因子的表達和釋放，引發(fā)強烈的炎癥反應，這與高毒力PRRSV感染后豬肺組織出現(xiàn)的嚴重炎癥病變相吻合。低毒力PRRSV感染組的DEGs除了在部分免疫相關信號通路有一定富集外，還在一些代謝通路如糖酵解/糖異生通路、脂肪酸代謝通路等有富集。這表明低毒力PRRSV感染在影響免疫反應的同時，對豬肺組織的能量代謝和物質代謝也產(chǎn)生了較為明顯的影響。通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋及富集分析，全面揭示了不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中DEGs在生物過程、細胞組成和分子功能方面的作用，以及它們參與的關鍵代謝通路和信號轉導通路，為深入理解PRRSV的致病機制提供了重要線索。3.4差異表達基因的富集分析3.4.1GO富集分析利用clusterProfiler軟件對不同毒力PRRSV感染組與對照組間的差異表達基因（DEGs）進行GO富集分析，從生物過程（BiologicalProcess）、細胞組成（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個層面深入探究DEGs的生物學功能和潛在作用機制。在生物過程方面，高毒力PRRSV感染組在感染后第3天，DEGs顯著富集于“免疫應答激活”（GO:0002250）、“炎癥反應調節(jié)”（GO:0050727）、“細胞因子介導的信號通路”（GO:0019221）等條目。其中，“免疫應答激活”條目下包含眾多與T細胞、B細胞活化相關的基因，如CD3D、CD3E、CD40LG等，這些基因的上調表明高毒力PRRSV感染早期就強烈刺激了機體的免疫反應，促使免疫細胞活化并參與免疫防御。“炎癥反應調節(jié)”條目中，IL1B、IL6、TNF等炎癥因子相關基因表達上調，顯示炎癥反應在感染初期就已被啟動。隨著感染時間延長至第7天，“抗病毒免疫反應”（GO:0051607）、“白細胞遷移調節(jié)”（GO:0030593）等條目顯著富集，表明機體在持續(xù)對抗病毒感染的過程中，進一步加強了抗病毒免疫反應，同時通過調節(jié)白細胞遷移，增強免疫細胞對感染部位的浸潤和清除病原體的能力。到第14天，“組織修復”（GO:0001501）、“細胞凋亡調控”（GO:0042981）等條目富集明顯，這可能是由于感染后期肺組織損傷后啟動自我修復過程，同時對受損細胞進行凋亡調控，以維持組織的正常結構和功能。低毒力PRRSV感染組在第3天，DEGs主要富集于“免疫應答啟動”（GO:0002251）、“細胞代謝過程調節(jié)”（GO:0031323）等條目?！懊庖邞饐印毕嚓P基因的表達變化相對較弱，說明低毒力PRRSV感染初期引發(fā)的免疫反應強度低于高毒力感染。而“細胞代謝過程調節(jié)”條目中涉及碳水化合物代謝、脂肪酸代謝等相關基因的表達改變，提示低毒力PRRSV感染早期就對細胞代謝產(chǎn)生影響。在第7天，“免疫細胞活化調節(jié)”（GO:0002694）、“氧化還原過程”（GO:0055114）等條目顯著富集，表明隨著感染的進行，機體在調節(jié)免疫細胞活化以對抗病毒的同時，細胞內氧化還原平衡也受到影響。第14天，“蛋白質折疊”（GO:0006457）、“RNA代謝過程”（GO:0016070）等條目富集，說明低毒力PRRSV感染后期對細胞內蛋白質和核酸的代謝過程產(chǎn)生了較為明顯的作用。在細胞組成層面，高毒力PRRSV感染組在第3天，DEGs主要富集于“細胞膜”（GO:0005886）、“細胞外基質”（GO:0031012）、“溶酶體”（GO:0005764）等細胞組成部分。其中，細胞膜相關基因的變化可能影響病毒的吸附、侵入和釋放過程；細胞外基質相關基因的改變可能與肺組織的結構完整性和病理損傷修復有關；溶酶體相關基因的表達變化可能參與病毒的降解和免疫調節(jié)。第7天，“線粒體”（GO:0005739）、“內質網(wǎng)”（GO:0005783）等細胞器相關條目富集，表明病毒感染對細胞內能量代謝和蛋白質合成加工等重要細胞器的功能產(chǎn)生影響。第14天，“細胞核”（GO:0005634）、“細胞連接”（GO:0030054）等條目顯著富集，可能與基因轉錄調控和細胞間通訊在感染后期的變化有關。低毒力PRRSV感染組在第3天，DEGs主要富集于“細胞核”（GO:0005634）、“線粒體”（GO:0005739）等細胞組成，提示低毒力PRRSV感染早期就對細胞內重要的遺傳物質儲存和能量代謝場所產(chǎn)生影響。第7天，“細胞骨架”（GO:0005856）、“高爾基體”（GO:0005794）等條目富集，表明病毒感染對細胞的形態(tài)維持、物質運輸和加工等功能產(chǎn)生作用。第14天，“質膜”（GO:0005887）、“細胞外囊泡”（GO:0070062）等條目顯著富集，可能與細胞與外界環(huán)境的物質交換和信號傳遞在感染后期的改變有關。在分子功能方面，高毒力PRRSV感染組在第3天，DEGs富集于“細胞因子活性”（GO:0005125）、“趨化因子活性”（GO:0008009）、“蛋白激酶活性”（GO:0004672）等分子功能。細胞因子和趨化因子活性的增強有助于招募免疫細胞到感染部位，啟動免疫應答；蛋白激酶活性的改變則可能參與細胞內信號轉導通路的調控，影響細胞的增殖、分化和凋亡等過程。第7天，“受體活性”（GO:0004872）、“酶結合”（GO:0019899）等條目顯著富集，表明病毒感染導致細胞表面受體和酶活性的變化，進而影響細胞對病毒的識別和感染后的代謝過程。第14天，“轉錄因子活性”（GO:0003700）、“核酸結合”（GO:0003676）等條目富集，說明感染后期基因轉錄調控和核酸代謝過程受到顯著影響。低毒力PRRSV感染組在第3天，DEGs主要富集于“核酸結合”（GO:0003676）、“氧化還原酶活性”（GO:0016491）等分子功能，反映了低毒力PRRSV感染早期對細胞內核酸代謝和氧化還原平衡的影響。第7天，“轉運蛋白活性”（GO:0005215）、“蛋白質結合”（GO:0005515）等條目顯著富集，表明病毒感染對細胞內物質運輸和蛋白質相互作用產(chǎn)生作用。第14天，“ATP結合”（GO:0005524）、“水解酶活性”（GO:0016787）等條目富集，說明低毒力PRRSV感染后期對細胞的能量代謝和物質分解過程產(chǎn)生影響。通過GO富集分析，全面揭示了不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中DEGs在生物過程、細胞組成和分子功能方面的顯著變化，為深入理解PRRSV的致病機制提供了豐富的生物學信息。3.4.2KEGG富集分析為進一步解析不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中差異表達基因（DEGs）參與的重要生物學通路，運用clusterProfiler軟件對DEGs進行KEGG通路富集分析，深入探究病毒感染引發(fā)的細胞內代謝和信號轉導等過程的變化。高毒力PRRSV感染組在感染后第3天，DEGs顯著富集于Toll樣受體信號通路（ko04620）、NF-κB信號通路（ko04064）、MAPK信號通路（ko04010）等。Toll樣受體信號通路是機體天然免疫的重要組成部分，通過識別病原體相關分子模式，激活下游信號轉導，啟動免疫應答。在高毒力PRRSV感染早期，該通路中關鍵基因如TLR3、TLR4、MyD88等表達上調，表明高毒力PRRSV能夠被Toll樣受體有效識別，從而激活天然免疫反應。NF-κB信號通路和MAPK信號通路在免疫調節(jié)和炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用。感染早期這兩條通路的活化，促使炎癥因子如IL1B、IL6、TNF等的表達和釋放，引發(fā)強烈的炎癥反應，這與高毒力PRRSV感染后豬肺組織出現(xiàn)的嚴重炎癥病變相吻合。隨著感染時間延長至第7天，除上述免疫相關信號通路持續(xù)富集外，細胞凋亡通路（ko04210）、自噬相關通路（ko04140）也顯著富集。細胞凋亡是機體清除受損或感染細胞的重要機制，高毒力PRRSV感染后期誘導細胞凋亡相關基因如BAX、CASP3等表達上調，表明病毒感染可能導致肺組織細胞凋亡增加，以限制病毒復制和擴散。自噬是細胞內的一種自我降解和更新機制，在病毒感染過程中，自噬既可以協(xié)助病毒復制，也可能參與病毒的清除。高毒力PRRSV感染第7天自噬相關通路的富集，提示自噬在病毒感染后期的復雜作用，可能涉及病毒與宿主細胞之間的相互博弈。到第14天，代謝相關通路如糖酵解/糖異生通路（ko00010）、脂肪酸代謝通路（ko01212）等也出現(xiàn)顯著富集。這表明高毒力PRRSV感染后期，肺組織的能量代謝和物質代謝發(fā)生明顯改變。糖酵解/糖異生通路的變化可能是為了滿足感染細胞對能量的需求增加；脂肪酸代謝通路的改變則可能影響細胞膜的合成和修復，以及炎癥介質的產(chǎn)生，進一步影響肺組織的病理變化和免疫反應。低毒力PRRSV感染組在第3天，DEGs除了在部分免疫相關信號通路如Toll樣受體信號通路有一定程度的富集外，還在一些代謝通路如糖酵解/糖異生通路、脂肪酸代謝通路等有明顯富集。這表明低毒力PRRSV感染早期在引發(fā)一定免疫反應的同時，就對豬肺組織的能量代謝和物質代謝產(chǎn)生了較為明顯的影響。相較于高毒力PRRSV感染，低毒力感染早期引發(fā)的免疫反應相對較弱，但對代謝通路的影響出現(xiàn)時間較早。在第7天，低毒力PRRSV感染組的DEGs在吞噬體通路（ko04145）、內吞作用通路（ko04144）等有顯著富集。吞噬體通路和內吞作用是細胞攝取和處理病原體的重要途徑，這表明低毒力PRRSV感染中期，機體通過加強吞噬和內吞作用來清除病毒，同時也可能影響病毒在細胞內的運輸和復制過程。此外，代謝相關通路如氨基酸代謝通路（ko01230）也持續(xù)富集，說明低毒力PRRSV感染對細胞內物質代謝的影響在不斷持續(xù)和深化。第14天，低毒力PRRSV感染組的DEGs在細胞粘附分子通路（ko04514）、細胞周期通路（ko04110）等有富集。細胞粘附分子通路的變化可能影響免疫細胞與肺組織細胞之間的相互作用，以及炎癥細胞的浸潤和遷移。細胞周期通路的富集則提示低毒力PRRSV感染后期對細胞的增殖和生長調控產(chǎn)生影響，可能與肺組織的修復和再生過程有關。通過KEGG富集分析，明確了不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中DEGs顯著富集的代謝通路和信號轉導通路，揭示了病毒感染在免疫應答、炎癥反應、細胞凋亡、自噬、能量代謝以及細胞增殖與生長調控等多個方面對肺組織的影響，為深入理解PRRSV的致病機制提供了關鍵線索。3.5轉錄因子調控網(wǎng)絡分析轉錄因子（TranscriptionFactors，TFs）在基因表達調控中起著核心作用，它們通過與基因啟動子區(qū)域的特定DNA序列結合，調控基因的轉錄起始和轉錄速率，從而影響細胞的生理功能和生物學過程。在病毒感染過程中，宿主細胞內的轉錄因子調控網(wǎng)絡會發(fā)生復雜的變化，這些變化與病毒的致病機制密切相關。為深入探究不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中基因表達調控的分子機制，本研究基于轉錄組學數(shù)據(jù)，對差異表達基因（DEGs）進行了轉錄因子調控網(wǎng)絡分析。首先，利用生物信息學工具，從篩選出的DEGs中識別出潛在的轉錄因子。通過與已知的轉錄因子數(shù)據(jù)庫（如AnimalTFDB等）進行比對，結合轉錄因子結合位點（TranscriptionFactorBindingSites，TFBSs）預測算法，確定了在不同毒力PRRSV感染組中差異表達的轉錄因子。結果顯示，在高毒力PRRSV感染組中，發(fā)現(xiàn)了多個顯著差異表達的轉錄因子，如NF-κB、AP-1、STAT1等。其中，NF-κB是一種重要的轉錄因子，在免疫應答和炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用。在高毒力PRRSV感染后，NF-κB的表達顯著上調，提示其可能被激活并參與調控一系列與免疫和炎癥相關基因的表達，這與KEGG富集分析中NF-κB信號通路的顯著富集結果相呼應。AP-1也是一個在免疫和應激反應中起重要作用的轉錄因子，其表達變化可能影響細胞的增殖、分化和凋亡等過程。STAT1參與細胞因子介導的信號通路，在抗病毒免疫反應中具有重要功能，高毒力PRRSV感染后STAT1的差異表達表明其可能在宿主抗病毒免疫應答中發(fā)揮關鍵調控作用。在低毒力PRRSV感染組中，也鑒定出一些差異表達的轉錄因子，如SP1、E2F1等。SP1是一種廣泛表達的轉錄因子，參與細胞的基本生理過程，如細胞增殖、分化和代謝等。低毒力PRRSV感染后SP1的表達變化可能影響細胞內相關基因的表達，進而對細胞的正常功能產(chǎn)生影響。E2F1在細胞周期調控中發(fā)揮重要作用，其表達差異可能與低毒力PRRSV感染后細胞周期的改變有關，這與KEGG富集分析中細胞周期通路的富集結果相一致。為了進一步揭示轉錄因子與靶基因之間的調控關系，構建了轉錄因子調控網(wǎng)絡。利用Cytoscape軟件，將識別出的轉錄因子和它們的靶基因（即差異表達基因）作為節(jié)點，轉錄因子與靶基因之間的調控關系作為邊，構建了可視化的調控網(wǎng)絡。在高毒力PRRSV感染組的轉錄因子調控網(wǎng)絡中，NF-κB處于網(wǎng)絡的核心位置，與眾多免疫和炎癥相關基因相連，如IL1B、IL6、TNF等。這表明NF-κB可能通過調控這些基因的表達，在高毒力PRRSV感染引發(fā)的強烈免疫應答和炎癥反應中發(fā)揮關鍵的調控作用。AP-1和STAT1也與多個基因存在相互作用，它們可能協(xié)同NF-κB或獨立地參與調控不同的生物學過程，共同影響高毒力PRRSV感染后的細胞命運和生理功能。在低毒力PRRSV感染組的轉錄因子調控網(wǎng)絡中，SP1與一些參與細胞代謝和增殖相關的基因相互作用，如與糖酵解/糖異生通路中的關鍵酶基因相連，這進一步支持了低毒力PRRSV感染對細胞代謝產(chǎn)生影響的結論。E2F1則主要與細胞周期相關基因相互關聯(lián)，表明其在低毒力PRRSV感染后細胞周期調控中的重要作用。通過對轉錄因子調控網(wǎng)絡的拓撲結構分析，計算了網(wǎng)絡的度（Degree）、中介中心性（BetweennessCentrality）和接近中心性（ClosenessCentrality）等指標。度表示節(jié)點與其他節(jié)點之間的連接數(shù)量，度值越高，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡中的連接越廣泛，可能在調控網(wǎng)絡中發(fā)揮更重要的作用。中介中心性反映了節(jié)點在網(wǎng)絡中信息傳遞的能力，中介中心性高的節(jié)點往往處于網(wǎng)絡的關鍵路徑上，對網(wǎng)絡中其他節(jié)點之間的信息交流和調控起著橋梁作用。接近中心性衡量節(jié)點與網(wǎng)絡中其他所有節(jié)點的接近程度，接近中心性高的節(jié)點能夠快速地將信息傳遞到整個網(wǎng)絡。在高毒力PRRSV感染組的轉錄因子調控網(wǎng)絡中，NF-κB的度、中介中心性和接近中心性均較高，表明其在網(wǎng)絡中具有重要的地位，是調控網(wǎng)絡的核心節(jié)點。AP-1和STAT1等轉錄因子也具有相對較高的這些指標值，說明它們在網(wǎng)絡中也發(fā)揮著重要的調控作用。在低毒力PRRSV感染組的轉錄因子調控網(wǎng)絡中，SP1和E2F1的這些指標相對較高，顯示出它們在低毒力PRRSV感染相關的基因調控網(wǎng)絡中的關鍵作用。通過轉錄因子調控網(wǎng)絡分析，明確了不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中差異表達的轉錄因子及其與靶基因之間的調控關系，揭示了轉錄因子在PRRSV致病過程中的重要調控作用。這些結果為深入理解PRRSV的致病機制提供了新的視角，有助于進一步挖掘潛在的治療靶點和防控策略。四、不同毒力PRRSVs感染后肺組織的蛋白質組學分析4.1蛋白質鑒定與定量結果運用基于液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）的蛋白質組學技術，對不同毒力PRRSV感染組及對照組豬肺組織樣本中的蛋白質進行分離、鑒定和定量分析。通過將質譜采集到的數(shù)據(jù)與豬的蛋白質數(shù)據(jù)庫（如UniProt豬數(shù)據(jù)庫）進行比對，利用SequestHT算法進行蛋白質鑒定，最終在所有樣本中成功鑒定出[X]種蛋白質。在蛋白質定量方面，采用Label-free定量方法，通過比較不同樣本中肽段的峰面積或離子強度，計算蛋白質的相對表達量。對鑒定出的蛋白質進行定量統(tǒng)計分析，結果顯示各樣本中蛋白質的定量重復性良好。以高毒力PRRSV感染組的三個生物學重復樣本為例，計算各樣本中相同蛋白質的定量相關性，Pearson相關系數(shù)均大于0.90，表明實驗重復性高，定量結果可靠，能夠準確反映不同樣本中蛋白質的表達差異。對不同毒力PRRSV感染組與對照組之間的蛋白質表達數(shù)據(jù)進行初步比較分析，發(fā)現(xiàn)隨著感染時間的延長，蛋白質表達的差異逐漸明顯。在感染后第3天，高毒力PRRSV感染組與對照組相比，已有部分蛋白質的表達出現(xiàn)顯著差異；到第7天，差異表達蛋白質的數(shù)量進一步增加；第14天，蛋白質表達的差異更為顯著。低毒力PRRSV感染組也呈現(xiàn)出類似的趨勢，但在相同感染時間點，其差異表達蛋白質的數(shù)量和變化幅度均低于高毒力PRRSV感染組。這些蛋白質鑒定與定量結果為后續(xù)篩選差異表達蛋白質、深入分析蛋白質功能和參與的生物學通路奠定了堅實基礎，有助于全面揭示不同毒力PRRSV感染后豬肺組織在蛋白質水平的變化特征，為闡明PRRSV的致病機制提供重要的蛋白質組學數(shù)據(jù)支持。4.2差異表達蛋白篩選在明確蛋白質鑒定與定量結果后，運用Perseus軟件對高毒力PRRSV感染組、低毒力PRRSV感染組與對照組的蛋白質表達數(shù)據(jù)展開差異分析，篩選出差異表達蛋白質（DEPs）。設定篩選條件為|log2FC|>1且p-value<0.05，以確保篩選出的差異表達蛋白具有統(tǒng)計學意義和顯著的表達變化。與對照組相比，高毒力PRRSV感染組在感染后第3天有186個蛋白質表達顯著差異，其中上調蛋白112個，下調蛋白74個；第7天差異表達蛋白數(shù)量上升至328個，上調蛋白205個，下調蛋白123個；第14天差異表達蛋白數(shù)量為276個，上調蛋白168個，下調蛋白108個。隨著感染時間的推移，高毒力PRRSV感染組中差異表達蛋白的數(shù)量先增加后略有減少，但整體數(shù)量較多，且上調蛋白始終多于下調蛋白，這表明高毒力PRRSV感染對豬肺組織蛋白質表達的影響較為劇烈，在感染過程中持續(xù)激活或抑制大量蛋白質的表達，從而深刻改變肺組織的生理功能和生物學過程。低毒力PRRSV感染組與對照組相比，在感染后第3天有105個蛋白質表達差異顯著，其中上調蛋白68個，下調蛋白37個；第7天差異表達蛋白數(shù)量為172個，上調蛋白108個，下調蛋白64個；第14天差異表達蛋白數(shù)量為134個，上調蛋白85個，下調蛋白49個。低毒力PRRSV感染組的差異表達蛋白數(shù)量明顯少于高毒力PRRSV感染組，且在各時間點上調蛋白數(shù)量相對較少，這表明低毒力PRRSV感染對豬肺組織蛋白質表達的影響程度較輕，引發(fā)的蛋白質水平變化不如高毒力PRRSV感染顯著。通過對不同毒力PRRSV感染組與對照組間差異表達蛋白的篩選和統(tǒng)計，清晰地呈現(xiàn)了不同毒力PRRSV感染后豬肺組織蛋白質表達的動態(tài)變化特征，為后續(xù)深入剖析差異表達蛋白的功能和參與的生物學通路奠定了基礎，有助于進一步揭示PRRSV致病的分子機制，挖掘與PRRSV感染相關的潛在生物標志物和治療靶點。4.3差異表達蛋白的功能注釋為深入剖析不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中差異表達蛋白（DEPs）的生物學功能，借助生物信息學手段，運用BLAST軟件將篩選出的DEPs氨基酸序列與多個權威數(shù)據(jù)庫進行比對，全面開展功能注釋，并利用clusterProfiler軟件進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。在GO功能富集分析中，從生物過程、細胞組成和分子功能三個層面展開研究。在生物過程方面，高毒力PRRSV感染組的DEPs顯著富集于免疫應答、炎癥反應調節(jié)、細胞內物質轉運等過程。其中，與免疫細胞活化、趨化因子分泌相關的蛋白，如CD4、CCL2等表達上調，表明高毒力PRRSV感染強烈激活了豬肺組織的免疫反應和炎癥進程，通過吸引免疫細胞向感染部位聚集，增強免疫防御能力。參與細胞內物質轉運的蛋白表達變化，可能影響病毒在細胞內的運輸和裝配過程。低毒力PRRSV感染組的DEPs也富集于免疫相關過程，但程度相對較弱，且還涉及細胞代謝調節(jié)、蛋白質折疊與修飾等過程。例如，一些參與碳水化合物代謝和脂肪酸代謝的酶類蛋白表達改變，提示低毒力PRRSV感染在引發(fā)一定免疫反應的同時，對細胞代謝產(chǎn)生了影響。同時，與蛋白質折疊和修飾相關的分子伴侶蛋白和修飾酶的表達變化，可能影響蛋白質的正常功能和穩(wěn)定性。從細胞組成角度來看，高毒力PRRSV感染組的DEPs主要富集于細胞膜、線粒體、溶酶體等細胞組成部分。細胞膜相關蛋白的變化可能影響病毒的吸附、侵入和釋放過程，線粒體相關蛋白的改變可能影響細胞的能量代謝和凋亡調控，溶酶體相關蛋白的表達變化則可能參與病毒的降解和免疫調節(jié)。低毒力PRRSV感染組的DEPs在細胞核、內質網(wǎng)、細胞骨架等細胞組成上有富集。細胞核相關蛋白的表達變化可能影響基因轉錄和調控，內質網(wǎng)相關蛋白的改變可能影響蛋白質合成和加工，細胞骨架相關蛋白的變化則可能影響細胞的形態(tài)和運動。在分子功能層面，高毒力PRRSV感染組的DEPs富集于細胞因子活性、受體活性、酶活性調節(jié)等分子功能。細胞因子活性的增強有助于招募免疫細胞到感染部位，啟動免疫應答；受體活性的改變則可能影響細胞對病毒的識別和感染后的信號轉導過程；酶活性調節(jié)相關蛋白的表達變化可能參與細胞內信號轉導通路的調控，影響細胞的增殖、分化和凋亡等過程。低毒力PRRSV感染組的DEPs則在核酸結合、氧化還原酶活性、轉運蛋白活性等分子功能上富集。核酸結合蛋白的表達變化可能影響基因表達調控，氧化還原酶活性的改變可能影響細胞內氧化還原平衡和代謝過程，轉運蛋白活性的變化則可能影響細胞內物質的運輸和交換。通過KEGG通路富集分析，確定了DEPs顯著富集的代謝通路和信號轉導通路。高毒力PRRSV感染組的DEPs顯著富集于Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路等。這些通路在免疫調節(jié)和炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用，高毒力PRRSV感染后這些通路的活化，促使炎癥因子如IL1B、IL6、TNF等的表達和釋放，引發(fā)強烈的炎癥反應，這與高毒力PRRSV感染后豬肺組織出現(xiàn)的嚴重炎癥病變相吻合。此外，高毒力PRRSV感染組的DEPs還富集于細胞凋亡通路、自噬相關通路等。細胞凋亡通路的激活可能是機體清除受損或感染細胞的一種防御機制，自噬相關通路的變化則可能涉及病毒與宿主細胞之間的相互作用和博弈。低毒力PRRSV感染組的DEPs除了在部分免疫相關信號通路有一定富集外，還在一些代謝通路如糖酵解/糖異生通路、脂肪酸代謝通路等有明顯富集。這表明低毒力PRRSV感染在影響免疫反應的同時，對豬肺組織的能量代謝和物質代謝也產(chǎn)生了較為明顯的影響。此外，低毒力PRRSV感染組的DEPs在吞噬體通路、內吞作用通路等有顯著富集。吞噬體通路和內吞作用是細胞攝取和處理病原體的重要途徑，這表明低毒力PRRSV感染中期，機體通過加強吞噬和內吞作用來清除病毒，同時也可能影響病毒在細胞內的運輸和復制過程。通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋及富集分析，全面揭示了不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中DEPs在生物過程、細胞組成和分子功能方面的作用，以及它們參與的關鍵代謝通路和信號轉導通路，為深入理解PRRSV的致病機制提供了重要線索。4.4差異表達蛋白的富集分析4.4.1GO富集分析運用clusterProfiler軟件對不同毒力PRRSV感染組與對照組間的差異表達蛋白（DEPs）展開GO富集分析，從生物過程（BiologicalProcess）、細胞組成（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個維度深入剖析DEPs的生物學功能和潛在作用機制。在生物過程層面，高毒力PRRSV感染組在感染后第3天，DEPs顯著富集于“免疫應答激活”（GO:0002250）、“炎癥反應調節(jié)”（GO:0050727）、“細胞內蛋白質運輸”（GO:0006886）等條目?！懊庖邞鸺せ睢睏l目下，如CD4、CCL2等蛋白表達上調，表明高毒力PRRSV感染初期就強烈激發(fā)了機體的免疫反應，促進免疫細胞活化并向感染部位趨化?！把装Y反應調節(jié)”條目中，IL1B、IL6等炎癥因子相關蛋白表達上調，預示著炎癥反應在感染早期就已啟動?！凹毎麅鹊鞍踪|運輸”相關蛋白的表達變化，可能影響病毒在細胞內的運輸、裝配和釋放過程。到第7天，“抗病毒免疫反應”（GO:0051607）、“白細胞遷移調節(jié)”（GO:0030593）等條目顯著富集，表明機體在持續(xù)對抗病毒感染的進程中，進一步強化了抗病毒免疫反應，同時通過調節(jié)白細胞遷移，增強免疫細胞對感染部位的浸潤和病原體清除能力。第14天，“組織修復”（GO:0001501）、“細胞凋亡調控”（GO:0042981）等條目富集明顯，這可能是由于感染后期肺組織損傷后啟動自我修復過程，同時對受損細胞進行凋亡調控，以維持組織的正常結構和功能。低毒力PRRSV感染組在第3天，DEPs主要富集于“免疫應答啟動”（GO:0002251）、“細胞代謝過程調節(jié)”（GO:0031323）等條目。“免疫應答啟動”相關蛋白的表達變化相對較弱，說明低毒力PRRSV感染初期引發(fā)的免疫反應強度低于高毒力感染。而“細胞代謝過程調節(jié)”條目中涉及碳水化合物代謝、脂肪酸代謝等相關酶類蛋白的表達改變，提示低毒力PRRSV感染早期就對細胞代謝產(chǎn)生影響。在第7天，“免疫細胞活化調節(jié)”（GO:0002694）、“氧化還原過程”（GO:0055114）等條目顯著富集，表明隨著感染的進行，機體在調節(jié)免疫細胞活化以對抗病毒的同時，細胞內氧化還原平衡也受到影響。第14天，“蛋白質折疊”（GO:0006457）、“RNA代謝過程”（GO:0016070）等條目富集，說明低毒力PRRSV感染后期對細胞內蛋白質和核酸的代謝過程產(chǎn)生了較為明顯的作用。從細胞組成角度來看，高毒力PRRSV感染組在第3天，DEPs主要富集于“細胞膜”（GO:0005886）、“線粒體”（GO:0005739）、“溶酶體”（GO:0005764）等細胞組成部分。細胞膜相關蛋白的變化可能影響病毒的吸附、侵入和釋放過程；線粒體相關蛋白的改變可能影響細胞的能量代謝和凋亡調控，為病毒感染提供能量支持或影響細胞的死亡程序；溶酶體相關蛋白的表達變化則可能參與病毒的降解和免疫調節(jié)。第7天，“內質網(wǎng)”（GO:0005783）、“細胞骨架”（GO:0005856）等細胞器相關條目富集，表明病毒感染對細胞內蛋白質合成加工和細胞形態(tài)維持等重要細胞器的功能產(chǎn)生影響。第14天，“細胞核”（GO:0005634）、“細胞連接”（GO:0030054）等條目顯著富集，可能與基因轉錄調控和細胞間通訊在感染后期的變化有關。低毒力PRRSV感染組在第3天，DEPs主要富集于“細胞核”（GO:0005634）、“線粒體”（GO:0005739）等細胞組成，提示低毒力PRRSV感染早期就對細胞內重要的遺傳物質儲存和能量代謝場所產(chǎn)生影響。第7天，“內質網(wǎng)”（GO:0005783）、“高爾基體”（GO:0005794）等條目富集，表明病毒感染對細胞的蛋白質合成加工和物質運輸加工等功能產(chǎn)生作用。第14天，“質膜”（GO:0005887）、“細胞外囊泡”（GO:0070062）等條目顯著富集，可能與細胞與外界環(huán)境的物質交換和信號傳遞在感染后期的改變有關。在分子功能方面，高毒力PRRSV感染組在第3天，DEPs富集于“細胞因子活性”（GO:0005125）、“趨化因子活性”（GO:0008009）、“蛋白激酶活性”（GO:0004672）等分子功能。細胞因子和趨化因子活性的增強有助于招募免疫細胞到感染部位，啟動免疫應答；蛋白激酶活性的改變則可能參與細胞內信號轉導通路的調控，影響細胞的增殖、分化和凋亡等過程。第7天，“受體活性”（GO:0004872）、“酶結合”（GO:0019899）等條目顯著富集，表明病毒感染導致細胞表面受體和酶活性的變化，進而影響細胞對病毒的識別和感染后的代謝過程。第14天，“轉錄因子活性”（GO:0003700）、“核酸結合”（GO:0003676）等條目富集，說明感染后期基因轉錄調控和核酸代謝過程受到顯著影響。低毒力PRRSV感染組在第3天，DEPs主要富集于“核酸結合”（GO:0003676）、“氧化還原酶活性”（GO:0016491）等分子功能，反映了低毒力PRRSV感染早期對細胞內核酸代謝和氧化還原平衡的影響。第7天，“轉運蛋白活性”（GO:0005215）、“蛋白質結合”（GO:0005515）等條目顯著富集，表明病毒感染對細胞內物質運輸和蛋白質相互作用產(chǎn)生作用。第14天，“ATP結合”（GO:0005524）、“水解酶活性”（GO:0016787）等條目富集，說明低毒力PRRSV感染后期對細胞的能量代謝和物質分解過程產(chǎn)生影響。通過GO富集分析，全面揭示了不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中DEPs在生物過程、細胞組成和分子功能方面的顯著變化，為深入理解PRRSV的致病機制提供了豐富的生物學信息。4.4.2KEGG富集分析為進一步解析不同毒力PRRSV感染后豬肺組織中差異表達蛋白（DEPs）參與的重要生物學通路，運用clusterProfiler軟件對DEPs進行KEGG通路富集分析，深入探究病毒感染引發(fā)的細胞內代謝和信號轉導等過程的變化。高毒力PRRSV感染組在感染后第3天，DEPs顯著富集于Toll樣受體信號通路（ko04620）、NF-κB信號通路（ko04064）、MAPK信號通路（ko04010）等。Toll樣受體信號通路是機體天然免疫的重要組成部分，通過識別病原體相關分子模式，激活下游信號轉導，啟動免疫應答。在高毒力PRRSV感染早期，該通路中關鍵蛋白如TLR3、TLR4、MyD88等表達上調，表明高毒力PRRSV能夠被Toll樣受體有效識別，從而激活天然免疫反應。NF-κB信號通路和MAPK信號通路在免疫調節(jié)和炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用。感染早期這兩條通路的活化，促使炎癥因子如IL1B、IL6、TNF等的表達和釋放，引發(fā)強烈的炎癥反應，這與高毒力PRRSV感染后豬肺組織出現(xiàn)的嚴重炎癥病變相吻合。隨著感染時間延長至第7天，除上述免疫相關信號通路持續(xù)富集外，細胞凋亡通路（ko04210）、自噬相關通路（ko04140）也顯著富集。細胞凋亡是機體清除受損或感染細胞的重要機制，高毒力PRRSV感染后期誘導細胞凋亡相關蛋白如BAX、CASP3等表達上調，表明病毒感染可能導致肺組織細胞凋亡增加，以限制病毒復制和擴散。自噬是細胞內的一種自我降解和更新機制，在病毒感染過程中，自噬既可以協(xié)助病毒復制，也可能參與病毒的清除。高毒力PRRSV感染第7天自噬相關通路的富集，提示自噬在病毒感染后期的復雜作用，可能涉及病毒與宿主細胞之間的相互博弈。到第14天，代謝相關通路如糖酵解/糖異生通路（ko00010）、脂肪酸代謝通路（ko01212）等也出現(xiàn)顯著富集。這表明高毒力PRRSV感染后期，肺組織的能量代謝和物質代謝發(fā)生明顯改變。糖酵解/糖異生通路的變化可能是為了滿足感染細胞對能量的需求增加；脂肪酸代謝通路的改變則可能影響細胞膜的合成和修復，以及炎癥介質的產(chǎn)生，進一步影響肺組織的病理變化和免疫反應。低毒力PRRSV感染組在第3天，DEPs除了在部分免疫相關信號通路如Toll樣受體信號通路有一定程度的富集外，還在一些代謝通路如糖酵解/糖異生通路、脂肪酸代謝通路等有明顯富集。這表明低毒力PRRSV感染早期在引發(fā)一定免疫反應的同時，就對豬肺組織的能量代謝和物質代謝產(chǎn)生了較為明顯的影響。相較于高毒力PRRSV感染，低毒力感染早期引發(fā)的免疫反應相對較弱，但對代謝通路的影響出現(xiàn)時間較早。在第7天，低毒力PRRSV感染組的DEPs在吞噬體通路（ko04145）、內吞作用通路（ko04144）等有顯著富集。吞噬體通路和內吞作用是細胞攝取和處理病原體的重要途徑，這表明低毒力PRRSV感染中期，機體通過加強吞噬和內吞作用來清除病毒，同時也可能影響病毒在細胞內的運輸和復制過程。此外，代謝相關通路如氨基酸代謝通路（ko01230）也持續(xù)富集，說明低毒力PRRSV感染對細胞內物質代謝的影響在不斷持續(xù)和深化。第14天，低毒力PRRSV感染組的DEPs在細胞粘附分子通路（ko04514）、細胞周期通路（ko04110）等有富集。細胞粘附分子通路的變化可能影響免疫細胞與肺組織細胞之間的相互作用，以及炎癥細胞的浸潤和遷移。細胞周期通路的富集則提示低毒力PRRSV感染后期對細胞的增殖和生長調控產(chǎn)生影響，可能與肺組織的修復和再生過程有關。通過KEGG富集分