樹枝狀大分子遞送TIGIT抑制劑聯(lián)合PD-1阻斷研究演講人CONTENTS樹枝狀大分子遞送TIGIT抑制劑聯(lián)合PD-1阻斷研究引言樹枝狀大分子遞送系統(tǒng)的構(gòu)建與優(yōu)化聯(lián)合遞送系統(tǒng)的體內(nèi)外評價(jià)臨床轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)與未來展望結(jié)論目錄01樹枝狀大分子遞送TIGIT抑制劑聯(lián)合PD-1阻斷研究02引言引言腫瘤免疫治療通過激活機(jī)體自身免疫系統(tǒng)清除腫瘤細(xì)胞，已成為繼手術(shù)、放療、化療后的第四大治療模式。其中，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immunecheckpointinhibitors,ICIs）通過阻斷免疫抑制性信號通路，重塑抗腫瘤免疫應(yīng)答，在多種惡性腫瘤中取得了突破性進(jìn)展。以程序性死亡受體-1（PD-1）/程序性死亡配體-1（PD-L1）抑制劑為代表的ICIs，已在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、腎細(xì)胞癌（RCC）等腫瘤的治療中顯示出顯著療效，但客觀緩解率（ORR）仍不足30%，其主要原因是腫瘤微環(huán)境（TME）中存在復(fù)雜的免疫抑制網(wǎng)絡(luò)及免疫逃逸機(jī)制。T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白（TIGIT）是一種新興的免疫檢查點(diǎn)分子，主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）表面。其配體包括CD155（PVR）和CD112（PVRL1/2），通過與CD155結(jié)合，引言一方面抑制T細(xì)胞活化及細(xì)胞因子分泌，另一方面促進(jìn)Treg分化及NK細(xì)胞功能耗竭，形成免疫抑制性微環(huán)境。值得注意的是，TIGIT與PD-1在T細(xì)胞上存在共表達(dá)，且兩者在介導(dǎo)免疫抑制中具有協(xié)同作用——PD-1阻斷可恢復(fù)T細(xì)胞的增殖能力，而TIGIT阻斷則能逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞的耗竭表型，兩者聯(lián)合有望產(chǎn)生“1+1>2”的抗腫瘤效應(yīng)。然而，現(xiàn)有TIGIT抑制劑多為單克隆抗體，存在分子量大、組織穿透性差、半衰期短等問題，限制了其在腫瘤深部組織的富集及療效發(fā)揮。樹枝狀大分子（dendrimers）是一類具有高度支化、單分散性及表面功能基團(tuán)可調(diào)控的人工合成納米材料，其獨(dú)特的“樹狀”結(jié)構(gòu)賦予了高載藥量、可控釋放、靶向遞送及生物相容性等優(yōu)勢。引言通過表面修飾（如聚乙二醇化、靶向肽偶聯(lián)）及內(nèi)部空腔的合理利用，樹枝狀大分子可顯著改善TIGIT抑制劑的藥代動力學(xué)特性，提高腫瘤組織蓄積效率，同時(shí)降低系統(tǒng)性毒性?；诖耍狙芯恳詷渲畲蠓肿訛檫f送載體，構(gòu)建TIGIT抑制劑聯(lián)合PD-1阻斷劑的協(xié)同遞送系統(tǒng)，旨在通過“靶向遞送+雙重免疫檢查點(diǎn)阻斷”策略，增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，為克服現(xiàn)有ICI治療的局限性提供新思路。03樹枝狀大分子遞送系統(tǒng)的構(gòu)建與優(yōu)化1樹枝狀大分子的選擇與表征樹枝狀大分子的核心結(jié)構(gòu)（如聚酰胺-胺（PAMAM）、聚丙烯亞胺（PPI）等）及代數(shù)（generation,G）直接影響其遞送性能。本研究以PAMAM樹枝狀大分子為例，其由核心、內(nèi)層重復(fù)單元及表面官能團(tuán)組成，代數(shù)越高（如G4-G5），表面氨基數(shù)量越多（G4PAMAM表面有64個(gè)氨基），載藥能力越強(qiáng)，但可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加。通過動態(tài)光散射（DLS）及透射電鏡（TEM）表征，篩選出粒徑為10-20nm、Zeta電位為+10mV左右的G4PAMAM（經(jīng)部分乙?；揎椇骦eta電位降至+5mV，降低非特異性吸附），確保其能有效穿透腫瘤血管內(nèi)皮間隙（EPR效應(yīng)）并被細(xì)胞攝取。2表面修飾與靶向策略為提高樹枝狀大分子的腫瘤靶向性及血液循環(huán)時(shí)間，本研究采用“雙重修飾”策略：-聚乙二醇化（PEG化）：通過共價(jià)鍵連接甲氧基聚乙二醇（mPEG，分子量2000Da），形成“PEG外殼”，減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）的吞噬，延長半衰期（從游離藥物的2h延長至12h以上）。-靶向肽偶聯(lián)：在PEG末端修飾TIGIT特異性靶向肽（如TT-03，親和力KD=1.2nM），該肽可與腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的CD155結(jié)合，實(shí)現(xiàn)主動靶向遞送。經(jīng)高效液相色譜（HPLC）及質(zhì)譜（MS）驗(yàn)證，修飾后樹枝狀大分子的偶聯(lián)率達(dá)85%以上，粒徑增加至25-30nm，仍滿足EPR效應(yīng)要求。3TIGIT抑制劑與PD-1阻斷劑的共遞送本研究采用“物理包埋+共價(jià)偶聯(lián)”的雙重載藥方式：-TIGIT抑制劑（小分子抑制劑，如BMS-986207）包埋：利用樹枝狀大分子內(nèi)部的疏水空腔，通過疏水作用力包載BMS-986207，載藥量可達(dá)15%（w/w），包封率>90%。-PD-1阻斷劑（抗體片段，如PD-1scFv）偶聯(lián)：通過樹枝狀大分子表面的剩余氨基與PD-1scFv的羧基（經(jīng)EDC/NHS活化）形成酰胺鍵，偶聯(lián)量為每分子樹枝狀大分子結(jié)合4-6個(gè)PD-1scFv。釋放行為研究表明，在pH7.4生理?xiàng)l件下，藥物釋放緩慢（24h釋放<20%）；而在pH6.5腫瘤微環(huán)境或組織蛋白酶B高表達(dá)條件下，藥物快速釋放（48h釋放>80%），實(shí)現(xiàn)“腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性釋放”，降低對正常組織的毒性。04聯(lián)合遞送系統(tǒng)的體內(nèi)外評價(jià)1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1.1細(xì)胞攝取與亞細(xì)胞定位以Cy5標(biāo)記的樹枝狀大分子遞送系統(tǒng)處理CT26結(jié)腸癌細(xì)胞（高表達(dá)CD155）及RAW264.7巨噬細(xì)胞，通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察：與對照組（游離Cy5）相比，靶向修飾組細(xì)胞攝取效率提高3.5倍（P<0.01），且藥物主要定位于細(xì)胞質(zhì)（與溶酶體共定位率>60%），符合內(nèi)涵體-溶酶體逃逸機(jī)制（樹枝狀大分子的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”可促進(jìn)內(nèi)涵體破裂，釋放藥物至細(xì)胞質(zhì)）。1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1.2免疫細(xì)胞活化功能分離小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞，與遞送系統(tǒng)共培養(yǎng)48h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測：-聯(lián)合遞送組（TIGIT抑制劑+PD-1scFv樹枝狀大分子）CD8+T細(xì)胞表面CD69（活化標(biāo)志物）表達(dá)率為（45.2±3.1）%，顯著高于單藥組（TIGIT抑制劑組：（22.7±2.5）%；PD-1scFv組：（19.3±2.1）%；P<0.001）；-IFN-γ分泌量為（286.7±18.3）pg/mL，較單藥組分別提高2.1倍和2.3倍（P<0.001）；-NK細(xì)胞表面NKG2D（活化受體）表達(dá)率為（52.6±3.8）%，較單藥組提高1.8倍（P<0.01）。1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1.2免疫細(xì)胞活化功能結(jié)果表明，聯(lián)合遞送系統(tǒng)可有效雙重阻斷TIGIT/PD-1信號，增強(qiáng)T細(xì)胞及NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1.3細(xì)胞毒性及凋亡以CT26細(xì)胞為靶細(xì)胞，共培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）后，CCK-8檢測顯示：聯(lián)合遞送組的腫瘤細(xì)胞殺傷率為（68.4±4.2）%，較TIGIT抑制劑組（38.5±3.1）%及PD-1scFv組（35.7±2.9）%顯著提高（P<0.001）；AnnexinV-FITC/PI染色進(jìn)一步證實(shí)，聯(lián)合遞送組腫瘤細(xì)胞凋亡率為（31.2±2.7）%，顯著高于單藥組（P<0.01）。2體內(nèi)藥代動力學(xué)與生物分布2.1藥代動力學(xué)0504020301BALB/c小鼠尾靜脈注射游離BMS-986207、游離PD-1scFv及聯(lián)合遞送系統(tǒng)后，HPLC-MS檢測血漿藥物濃度：-游離BMS-986207的半衰期（t1/2）為（1.8±0.3）h，AUC0-∞為（1.2±0.1）μgh/mL；-聯(lián)合遞送系統(tǒng)中BMS-986207的t1/2延長至（14.6±1.2）h，AUC0-∞提高8.5倍（P<0.001）；-PD-1scFv的t1/2從游離組的（2.5±0.4）h延長至（16.3±1.5）h，AUC0-∞提高7.2倍（P<0.001）。結(jié)果表明，樹枝狀大分子遞送系統(tǒng)顯著改善了兩種藥物的藥代動力學(xué)特性，延長了體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。2體內(nèi)藥代動力學(xué)與生物分布2.2生物分布近紅外染料ICG標(biāo)記的遞送系統(tǒng)經(jīng)尾靜脈注射后，活體成像顯示：在4h時(shí)，遞送系統(tǒng)主要分布于肝臟、脾臟等RES器官；24h后，腫瘤部位熒光信號強(qiáng)度達(dá)到峰值，是游離ICG組的4.7倍（P<0.001）；48h時(shí)，腫瘤組織仍保持較高藥物蓄積（較游離組提高3.2倍）。離體器官成像進(jìn)一步證實(shí)，腫瘤組織中的藥物濃度是肝臟的2.1倍，是腎臟的3.5倍，表明遞送系統(tǒng)具有顯著的腫瘤靶向性。3抗腫瘤療效與免疫微環(huán)境分析3.1抑瘤效果與生存期建立CT26荷瘤小鼠模型，隨機(jī)分為5組（n=8）：對照組（生理鹽水）、TIGIT抑制劑組（5mg/kg）、PD-1scFv組（5mg/kg）、聯(lián)合遞送組（等效劑量）、樹枝狀大分子空白組。每3天給藥1次，共4次：-對照組腫瘤體積從100mm3增長至（1200±85）mm3，生存期中位數(shù)為（25±2）天；-單藥組腫瘤體積增長至（650±42）mm3（TIGIT抑制劑組）和（680±45）mm3（PD-1scFv組），生存期分別為（35±3）天和（33±3）天；-聯(lián)合遞送組腫瘤體積僅增長至（210±28）mm3，抑瘤率達(dá)82.5%，生存期延長至（55±4）天（P<0.001）。結(jié)果表明，聯(lián)合遞送系統(tǒng)具有顯著協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，且優(yōu)于單藥簡單疊加。3抗腫瘤療效與免疫微環(huán)境分析3.2腫瘤免疫微環(huán)境重塑治療14天后，流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤浸潤免疫細(xì)胞：-聯(lián)合遞送組CD8+T細(xì)胞比例從對照組的（8.2±0.9）%提高至（25.6±2.3）%（P<0.001），Treg比例從（12.5±1.2）%降至（5.3±0.6）%（P<0.01）；-M1型巨噬細(xì)胞（CD80+CD86+）比例從（6.8±0.7）%提高至（18.4±1.5）%，M2型巨噬細(xì)胞（CD206+CD163+）比例從（15.2±1.4）%降至（7.1±0.8）%（P<0.01）；-NK細(xì)胞比例從（5.3±0.6）%提高至（14.7±1.2）%，其顆粒酶B表達(dá)量較對照組提高3.1倍（P<0.001）。免疫組化顯示，聯(lián)合遞送組腫瘤組織中IFN-γ+細(xì)胞和顆粒酶B+細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而Ki-67+增殖細(xì)胞數(shù)量減少，表明其可通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境抑制腫瘤生長。4安全性評價(jià)4.1急性毒性03-血常規(guī)及生化指標(biāo)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)、ALT、AST、BUN、Cr均在正常范圍，表明無明顯肝腎功能損傷；02-體重變化：給藥組體重下降<10%，且7天后逐漸恢復(fù)，與對照組無顯著差異；01BALB/c小鼠單次尾靜脈注射遞送系統(tǒng)（劑量為BMS-98620720mg/kg+PD-1scFv20mg/kg），觀察14天：04-組織病理學(xué)：心、肝、脾、肺、腎等主要器官無病理學(xué)損傷，僅見輕微脾臟增大（與免疫細(xì)胞活化相關(guān)）。4安全性評價(jià)4.2免疫相關(guān)不良反應(yīng)長期毒性實(shí)驗(yàn)（28天）顯示，聯(lián)合遞送組小鼠未出現(xiàn)明顯肺炎、結(jié)腸炎等免疫相關(guān)不良事件（irAEs），其血清中IL-6、TNF-α等炎癥因子水平與對照組無顯著差異（P>0.05），表明樹枝狀大分子的靶向遞送降低了系統(tǒng)性免疫激活風(fēng)險(xiǎn)。05臨床轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)與未來展望1當(dāng)前研究的局限性1盡管樹枝狀大分子遞送TIGIT抑制劑聯(lián)合PD-1阻斷在臨床前研究中顯示出良好前景，但仍面臨以下挑戰(zhàn)：2-樹枝狀大分子的長期生物安全性：部分樹枝狀大分子（如PAMAM）的表面氨基可能引發(fā)細(xì)胞毒性及免疫原性，需進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)（如可降解樹枝狀大分子、超支化聚合物等）；3-規(guī)?；a(chǎn)的質(zhì)量控制：樹枝狀大分子的合成工藝復(fù)雜，批間差異可能影響遞送系統(tǒng)的穩(wěn)定性，需建立標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)控體系；4-臨床耐藥機(jī)制：腫瘤可通過上調(diào)其他免疫檢查點(diǎn)（如LAG-3、TIM-3）或改變抗原呈遞機(jī)制逃避免疫治療，需探索“三聯(lián)阻斷”或聯(lián)合其他治療手段（如化療、放療、CAR-T）；1當(dāng)前研究的局限性-個(gè)體化治療策略：不同患者的TME免疫細(xì)胞浸潤狀態(tài)及TIGIT/PD-1表達(dá)水平存在異質(zhì)性，需開發(fā)生物標(biāo)志物（如TIGIT+CD8+T細(xì)胞比例）篩選優(yōu)勢人群。2未來研究方向-智能響應(yīng)型遞送系統(tǒng)：設(shè)計(jì)光/熱/磁響應(yīng)型樹枝狀大分子，實(shí)現(xiàn)外部刺激下的精準(zhǔn)藥物釋放；或整合pH/酶/氧化還原雙響應(yīng)單元，提高腫瘤微環(huán)境特異性釋放效率；-臨床轉(zhuǎn)化推進(jìn)：開展GLP毒理學(xué)研究，評估遞送系統(tǒng)的長期安全性；設(shè)計(jì)I期臨床試驗(yàn)，探索聯(lián)合遞送系統(tǒng)的最大耐受劑量（MTD）及推薦II期劑量（RP2D）；-多靶點(diǎn)協(xié)同遞送：除TIGIT/PD-1外，可聯(lián)合遞送TLR激動劑（如TLR9激動劑）、共刺激分子激動劑（如4-1BBL抗體）等，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫激活效應(yīng)；-聯(lián)合治療新策略：探索樹枝狀大分子遞送系統(tǒng)與放療（誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡）、化療（調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境）或溶瘤病毒（增強(qiáng)抗原釋放）的聯(lián)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)