ICS65.020.20DB51.DB51/T3309—2025前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4雄株種植 5雄株管理 6雄株潰瘍病防控 7雄花脫菌處理 8生產(chǎn)檔案 附錄A（規(guī)范性）獼猴桃雄花采集狀態(tài)判別 4附錄B（資料性）花粉活力檢測(cè)方法 5附錄C（資料性）花粉帶獼猴桃潰瘍病菌（活菌）檢測(cè)方法 6附錄D（資料性）獼猴桃雄花生產(chǎn)記錄 8附錄E（資料性）獼猴桃雄花花粉活力及脫菌處理記錄 9參考文獻(xiàn) DB51/T3309—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、歸口、解釋并組織實(shí)施。本文件起草單位：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)、都江堰獼哆哆農(nóng)業(yè)科技有限公司、都江堰市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所、廣元市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、廣元市林木種苗管理站。本文件主要起草人：龔國(guó)淑、姚凱凱、馬苗苗、唐合均、周佳佳、陳華保、吳翠平、涂美艷、何成勇、王玲利、晏志強(qiáng)、康超勇、趙柳。DB51/T3309—20251獼猴桃雄花粉脫除潰瘍病菌生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了獼猴桃的雄株種植、雄株管理、雄株潰瘍病防控、雄花脫菌處理和生產(chǎn)檔案等方面的本文件適用于獼猴桃雄株種植與雄花脫菌處理。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T8321（所有部分）農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則DB51/T2096紅陽(yáng)獼猴桃生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程DB51/T3069獼猴桃主要病蟲害綠色防控技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1獼猴桃潰瘍病kiwifruitbacterialcanker由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonassyingaepv.actinidiae，簡(jiǎn)稱Psa）引起的一種具有毀滅性的細(xì)菌性病害，主要危害主干、枝蔓、葉片和花蕾，具有隱蔽性、爆發(fā)性和極強(qiáng)傳染性等特點(diǎn)。3.2獼猴桃雄花kiwifruitmaleflower雌蕊和子房退化，雄蕊發(fā)達(dá)，以產(chǎn)生和傳播花粉為主的獼猴桃雄株上的單性花。3.3脫菌處理operationofkillingPseudomonassyringaepv.actinidiae在不影響花粉活力的前提下，利用臭氧對(duì)獼猴桃雄花攜帶的潰瘍病菌進(jìn)行滅活處理的操作。4雄株種植4.1種植模式包括以生產(chǎn)獼猴桃雄花制作花粉為主的雄株單一種植，和以自然授粉為主的雄株搭配種植。4.2品種與砧木選擇4.2.1宜選擇廣適性好、花量大、出粉多、抗?jié)儾?qiáng)的美味獼猴桃或中華獼猴桃雄株品種。不同雌株品種宜搭配專用雄株。4.2.2宜選用抗逆性、嫁接親和力強(qiáng)的專用砧木。4.2.3以雄花生產(chǎn)為主要用途的雄株單一種植園，宜采用多品種搭配種植策略，錯(cuò)峰收獲雄花。2DB51/T3309—20254.3雄株單一種植4.3.1宜在海拔高度1000m及以下，年均溫13℃~20℃,無(wú)霜期大于260d，年降雨量800mm～1800mm，10℃及以上積溫4500℃~6000℃,絕對(duì)低溫在-2℃及以上，背風(fēng)向陽(yáng)的丘陵或山地選址建園。土層深厚、透氣良好，土壤pH值5.0～6.5，地下水位在1.0m以下，土壤種類以輕壤土、中壤土、砂壤土為宜。4.3.2風(fēng)害較嚴(yán)重區(qū)域，主迎風(fēng)面宜配置防風(fēng)林或防風(fēng)墻。4.3.3新建園栽植株距宜為1.5m～3.0m，行距宜為3.0m～3.5m。4.3.4藤蔓棚架宜選用T型架或水平棚架。4.4雄株搭配種植4.4.1雌株間搭配雄株自然授粉生產(chǎn)園，雌雄比例以5:1～8:1為宜，雄株均勻分布于雌株間。4.4.2架型以雙層架為宜，主架與輔助棚架高差1m左右。5雄株管理5.1整形修剪5.1.1根據(jù)立地條件和栽植株行距選擇合理樹形，包括單主干單主蔓十側(cè)蔓、單主干雙主蔓二十側(cè)蔓或單主干無(wú)主蔓多側(cè)蔓等。5.1.2采花后及時(shí)重剪，以回縮為主；冬季輕剪，以短截為主。修剪過(guò)程中每剪一株樹應(yīng)用75%酒精對(duì)修剪工具、剪鋸口進(jìn)行消毒，修剪傷口宜涂抹保護(hù)劑、愈合劑。5.2肥水管理5.2.1幼樹期肥水管理遵循勤施薄施原則。進(jìn)入大量產(chǎn)花年份后，每年采花后至7月初宜以高氮型復(fù)合肥為主，7月中旬至9月下旬宜以均衡型復(fù)合肥為主，10月施基肥一次，以腐熟有機(jī)肥為主。施肥方法、用量根據(jù)樹齡、樹勢(shì)和產(chǎn)花量按照DB51/T2096的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。5.2.2高溫干旱應(yīng)及時(shí)灌溉，積水嚴(yán)重應(yīng)及時(shí)排澇。5.3病蟲害防控冬季休眠期至萌芽前，結(jié)合修剪和清園，全園噴施1次3°Bé~5°Bé石硫合劑。獼猴桃潰瘍病防控按6.1、6.2執(zhí)行，其他病蟲害防控按照DB51/T3069的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。6雄株潰瘍病防控6.1藥劑選擇獼猴桃潰瘍病宜選用中生菌素、春雷霉素、春雷·王銅、噻菌銅、噻霉酮等進(jìn)行防治。農(nóng)藥使用應(yīng)符合GB/T8321的規(guī)定。6.2施藥時(shí)間與方法6.2.1絨球期均勻噴施主干及側(cè)枝，以枝干表面均勻形成一層水膜為宜。6.2.2現(xiàn)蕾期至采花前，全園噴施藥劑1次～2次，間隔時(shí)間宜為7d～10d，重點(diǎn)噴施雄花蕾及花梗，以雄花蕾表面均勻形成一層水膜為宜。6.2.3全園雄花采摘完成，重剪后，全園施藥1次。DB51/T3309—202536.2.4落葉前，全園施藥1次～2次，間隔時(shí)間宜為7d～10d。7雄花脫菌處理7.1雄花采集期7.1.1宜在獼猴桃雄花處于鈴鐺狀且萼片完全開裂，花瓣處于含苞待放且尚未見花藥時(shí)的大蕾期采集，所采集的雄花狀態(tài)應(yīng)符合附錄A中圖A.1的規(guī)定。7.1.2雄花宜在晴天采摘，自采摘離樹到加工場(chǎng)所應(yīng)保持新鮮狀態(tài)。7.2脫菌處理7.2.1采用鼓風(fēng)干燥或自然陰干雄花，充分除去表面水分，以手感無(wú)水漬為宜。7.2.2將表面干燥的雄花裝入帶有臭氧發(fā)生器的密閉容器內(nèi)，花量以達(dá)容器1/3為宜。7.2.3在臭氧濃度為600mg/m3～630mg/m3下密閉處理10min～15min，處理過(guò)程中應(yīng)連續(xù)緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)容器；經(jīng)處理后的雄花立即轉(zhuǎn)入花粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)。7.3脫菌處理效果檢測(cè)7.3.1花粉活力檢測(cè)見附錄B。7.3.2花粉帶獼猴桃潰瘍病菌活菌檢測(cè)見附錄C。8生產(chǎn)檔案8.1雄花生產(chǎn)記錄雄花生產(chǎn)應(yīng)包括肥水管理、修剪管理、獼猴桃潰瘍病防治、采花管理等，見附錄D。8.2脫菌處理記錄脫菌處理記錄應(yīng)包括雄花產(chǎn)地來(lái)源、品種名稱、采集日期、臭氧濃度、處理時(shí)間、花粉活力等信息，見附錄E。8.3檔案保存上述材料應(yīng)歸檔并妥善保存2年以上。各環(huán)節(jié)應(yīng)及時(shí)做好登記和相應(yīng)負(fù)責(zé)人簽字。DB51/T3309—20254（規(guī)范性）獼猴桃雄花采集狀態(tài)判別用于臭氧脫菌處理的獼猴桃雄花應(yīng)符合圖A.1的規(guī)定。半開放（見圖A.2）和全開放（見圖A.3）獼猴桃雄花均不符合規(guī)定。圖A.1含苞待放鈴鐺狀的獼猴桃雄花圖A.2半開放的獼猴桃雄花圖A.3全開放的獼猴桃雄花DB51/T3309—20255（資料性）花粉活力檢測(cè)方法B.1儀器、試劑與耗材儀器：顯微鏡、0.001g電子天秤、電磁爐、生化培養(yǎng)箱；試劑：蔗糖、硼酸、瓊脂；耗材：燒杯、量筒、吸管、玻棒、載玻片、培養(yǎng)皿、離心管。B.2檢測(cè)樣品抽取B.2.1抽樣數(shù)量花粉瓶10瓶（件）以下，逐瓶抽??；10瓶至100瓶，隨機(jī)選10瓶抽?。?00瓶以上，按照該批花粉總瓶數(shù)的平方根數(shù)抽取，見公式（B.1）。式中：N——每批花粉總瓶（件）數(shù)。n——應(yīng)抽取瓶（件）數(shù)（取整數(shù)，小數(shù)部分向上約）。B.2.2抽樣方法將花粉瓶充分振蕩，混勻容器內(nèi)的花粉，用無(wú)菌藥匙從瓶中取2g花粉放入無(wú)菌離心管內(nèi)，即為1份待檢測(cè)花粉。取每瓶（件）花粉時(shí)應(yīng)更換藥匙。B.3培養(yǎng)基制備將蔗糖100g、硼酸0.15g、瓊脂10g和蒸餾水1000mL倒入燒杯中，放在電磁爐上加熱并不斷攪拌，直至完全溶解。用吸管或玻棒吸取4～5滴融化的培養(yǎng)基，滴在平放的載玻片中央，使其自然擴(kuò)散成均勻薄層，靜置冷卻凝固后備用。B.4花粉接種與培養(yǎng)用無(wú)菌牙簽輕輕蘸取每份待檢測(cè)花粉，均勻撒布于載玻片培養(yǎng)基表面，然后將接種好的載玻片置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。將接種好的培養(yǎng)皿放入25℃生化培養(yǎng)箱，暗培養(yǎng)4h后觀察。B.5花粉活力測(cè)定與統(tǒng)計(jì)取出載玻片，于10×10倍顯微鏡下觀察。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取5個(gè)花粉分布均勻，且布滿畫面的視野拍照并計(jì)數(shù)。以花粉芽管長(zhǎng)度≥花粉粒直徑視為萌發(fā)?；ǚ刍盍σ悦劝l(fā)率表示，見公式（B.2）。B.2）B.6結(jié)果判定樣品其他質(zhì)量指標(biāo)均符合要求的前提下，且萌發(fā)率≥60%，判該批次花粉為合格品；否則判為不合格。DB51/T3309—20256（資料性）花粉帶獼猴桃潰瘍病菌（活菌）檢測(cè)方法C.1儀器、試劑與耗材儀器：高壓滅菌鍋、電子天秤、超凈工作臺(tái)、PCR儀、離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、電泳槽、移液器、電磁爐、生化培養(yǎng)箱等；試劑：胰化蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂、瓊脂糖、TAE電解液、PCR試劑、核酸染料等；耗材：燒杯、三角瓶、量筒、玻棒、培養(yǎng)皿、離心管、PCR管、吸頭等。C.2檢測(cè)樣品抽取檢測(cè)樣品抽取同附錄B中B.2。C.3LB培養(yǎng)基制備按酵母提取物5g、胰化蛋白胨10g、氯化鈉10g、瓊脂粉12g，蒸餾水1000mL配比配制，用NaOH調(diào)pH至7.0，121℃、20min高壓滅菌。C.4樣品前處理C.4.1樣品懸液制備在超凈工作臺(tái)內(nèi)，稱取待檢測(cè)雄花粉1g，加入裝有9mL無(wú)菌雙蒸水的離心管中（內(nèi)有適量玻璃珠）。旋緊管蓋，立即置于振蕩器上充分震蕩2min，使花粉完全分散于水中，制成1:10（w/v）的樣品懸液。C.4.2樣品稀釋無(wú)菌環(huán)境下吸取樣品懸液1mL，加入9mL無(wú)菌雙蒸水中，充分混勻，按10倍梯度連續(xù)稀釋，制備10?1、10?2、10?3......（必要時(shí)繼續(xù)稀釋）系列樣品稀釋液。C.5平板培養(yǎng)與觀察C.5.1LB平板涂布根據(jù)花粉帶菌量，選擇合適的濃度梯度，在無(wú)菌條件下吸取0.1mL不同梯度的樣品稀釋液，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基表面，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。待平板上的樣品液完全吸收后，25℃倒置培養(yǎng)48h。C.5.2Psa菌落的觀察待LB平板上細(xì)菌菌落的大小和特征穩(wěn)定后，與Psa的菌落形態(tài)特征進(jìn)行比較，并統(tǒng)計(jì)不同梯度下的疑似菌落數(shù)。Psa典型菌落呈圓形、乳白色、表面光滑、邊緣整齊（見圖C.1）。DB51/T3309—20257圖C.1Psa在LB固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)（正面）C.6PCR檢測(cè)以每個(gè)平板疑似Psa的菌落數(shù)≤30個(gè)的全選，30個(gè)～250個(gè)則隨機(jī)挑取30個(gè)的原則，對(duì)疑似菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)所用引物對(duì)、反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如下：Psa特異性引物對(duì)：F1/R2（正向引物：5'-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3'、反向引物：5'-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為280bp）；用無(wú)菌ddH2O將合成的引物干粉稀釋成10μmoL/L儲(chǔ)存液。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×TaqMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，加ddH2O補(bǔ)足到25μL，用無(wú)菌牙簽挑取待檢單菌落少許作為模板，混勻瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。PCR產(chǎn)物檢測(cè)：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳（120V，30min電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并成像，比對(duì)是否有目標(biāo)條帶。用已知的Psa標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照；無(wú)菌ddH2O作為空白對(duì)照。C.7結(jié)果判定與陽(yáng)性對(duì)照比對(duì)，若待檢花粉在280bp處無(wú)目標(biāo)條帶，則判定該樣品不攜帶活Psa，否則判定為攜帶活Psa。DB51/T3309—20258（資料性）獼猴桃雄花生產(chǎn)記錄獼猴桃雄花生產(chǎn)記錄見表D.1。表D.1獼猴桃雄花生產(chǎn)記錄表DB51/T3309—20259（資料性）獼猴桃雄花花粉活力及脫菌處理記錄獼猴桃雄花花粉活力及脫菌處理記錄見表E.1。表E.1獼猴桃雄花花粉活力及脫菌處理記錄表DB51/T3309—2025參考文獻(xiàn)[1]KoukounarasA.Advancedgreenhousehorticulture:newtechnologiesandcultivationpractices[J].Horticulturae,2021,7(1):1.[2]龔國(guó)淑,李慶,張敏,等.獼猴桃