基于轉(zhuǎn)錄組分析的豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系關(guān)鍵因子篩選與機制研究一、引言1.1研究背景與意義豬，作為重要的家畜，不僅是人類主要的肉食品來源，在生命科學研究領(lǐng)域也具有不可或缺的地位。豬在解剖學、生理學以及基因組等方面與人類存在諸多相似之處，這使得豬成為構(gòu)建人類疾病模型、開展異種器官移植研究的理想模式生物。比如，豬的心臟結(jié)構(gòu)和大小與人類相近，在心臟疾病研究和心臟移植研究中，豬是重要的實驗動物。此外，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，培育優(yōu)良的豬品種一直是研究的重點方向。擁有優(yōu)良性狀的豬品種，如生長速度快、肉質(zhì)鮮美、抗病能力強等，對于提高養(yǎng)殖效益、保障肉類供應(yīng)的質(zhì)量和數(shù)量都具有重要意義。胚胎干細胞（EmbryonicStemCells，ESCs）是從早期胚胎內(nèi)細胞團（InnerCellMass，ICM）中分離獲得的一類細胞，其具備兩大顯著特性：一是具有自我更新能力，能夠在體外不斷增殖，維持細胞數(shù)量的穩(wěn)定；二是具有多能性，在特定條件下可分化為體內(nèi)的各種細胞類型，如神經(jīng)細胞、心肌細胞、肝細胞等。豬胚胎干細胞的成功建立，為豬的遺傳改良、基因功能研究以及人類疾病模型的構(gòu)建提供了新的技術(shù)手段。在遺傳改良方面，可以通過對豬胚胎干細胞進行基因編輯，將優(yōu)良基因?qū)爰毎校偻ㄟ^胚胎工程技術(shù)培育出具有優(yōu)良性狀的豬品種，這相較于傳統(tǒng)的育種方法，大大縮短了育種周期，提高了育種效率；在基因功能研究中，利用豬胚胎干細胞可以深入探究基因在胚胎發(fā)育、細胞分化等過程中的作用機制；在人類疾病模型構(gòu)建領(lǐng)域，豬胚胎干細胞可用于構(gòu)建各種人類疾病的模型，如心血管疾病、糖尿病等，為疾病的發(fā)病機制研究和藥物研發(fā)提供了重要的實驗材料。然而，盡管豬胚胎干細胞具有如此重要的應(yīng)用價值，但目前豬胚胎干細胞的培養(yǎng)體系仍不夠完善，存在細胞系難以穩(wěn)定維持、多能性易喪失等問題。這些問題的根源在于對豬胚胎干細胞多能性維持和分化的分子機制理解不夠深入，導致在培養(yǎng)過程中無法精準調(diào)控細胞的命運。例如，在現(xiàn)有培養(yǎng)體系下，豬胚胎干細胞在傳代過程中容易出現(xiàn)分化現(xiàn)象，使得細胞的多能性逐漸降低，難以滿足后續(xù)研究和應(yīng)用的需求。因此，深入探究豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因子，優(yōu)化培養(yǎng)條件，對于建立穩(wěn)定、高效的豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄組分析作為一種強大的研究工具，能夠全面、系統(tǒng)地揭示細胞在特定狀態(tài)下的基因表達譜。通過轉(zhuǎn)錄組分析，可以篩選出與豬胚胎干細胞多能性維持和分化密切相關(guān)的基因和信號通路。這些關(guān)鍵基因和信號通路中的因子可能就是影響豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因素。比如，通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)某些轉(zhuǎn)錄因子在維持豬胚胎干細胞多能性中發(fā)揮著核心作用，那么在培養(yǎng)體系中添加這些轉(zhuǎn)錄因子或者激活相關(guān)的信號通路，就有可能改善豬胚胎干細胞的培養(yǎng)效果，提高細胞的多能性和穩(wěn)定性。因此，轉(zhuǎn)錄組分析為篩選豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因子提供了重要的技術(shù)手段，對于推動豬胚胎干細胞的研究和應(yīng)用具有重要的意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的研究方面，自1981年小鼠胚胎干細胞成功建立以來，科研人員便致力于豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的探索。早期研究主要借鑒小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)方法，然而由于豬與小鼠在胚胎發(fā)育機制、細胞生物學特性等方面存在差異，這些方法在豬胚胎干細胞培養(yǎng)中效果不佳。近年來，國內(nèi)外研究取得了一定進展。中國農(nóng)業(yè)大學韓建永教授團隊聯(lián)合多家單位，從早期胚胎多能性發(fā)育調(diào)控分子機制入手，攻克豬早期胚胎單細胞分離技術(shù)，首次繪制了豬胚胎第0-14天（完整的附植前階段）高質(zhì)量單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，解析了豬上胚層多能性狀態(tài)（初始態(tài)、中間態(tài)和激發(fā)態(tài)）變化及調(diào)控的分子機制?；诖?，創(chuàng)制了豬原腸化前上胚層多能干細胞（pgEpiSCs）培養(yǎng)體系，成功建立15株細胞系，細胞維持上胚層多能性狀態(tài)，具有典型干細胞特征，最長傳代次數(shù)超過260代，是目前世界上已報道傳代次數(shù)最多的大動物干細胞系。此外，西湖大學裴端卿實驗室建立了一種新型的豬胚胎干細胞建系及培養(yǎng)體系4FIXY，4FIXY包含4種細胞因子ActivinA、IGF1、IL-6和sIL-6Receptorα，以及小分子化學化合物WNT信號抑制劑XAV939和IWR1、ROCK抑制劑Y-27632，由此獲得了具有良好多能性和多向分化潛能的豬胚胎干細胞。在豬上胚層轉(zhuǎn)錄組分析研究中，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的應(yīng)用使得對豬胚胎發(fā)育過程中細胞異質(zhì)性和基因表達動態(tài)變化的研究更加深入。通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，能夠在單個細胞水平上揭示豬上胚層細胞的基因表達特征，鑒定出不同發(fā)育階段的特異性標記基因和關(guān)鍵信號通路。例如，有研究利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對豬早期胚胎發(fā)育過程中的上胚層細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)了一些在胚胎發(fā)育早期起重要調(diào)控作用的基因，如OCT4、SOX2等，這些基因參與維持細胞的多能性和干性，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。盡管取得了上述進展，但當前研究仍存在一些問題和不足。在豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系方面，現(xiàn)有的培養(yǎng)體系雖然能夠維持豬胚胎干細胞的生長和多能性，但在長期傳代過程中，細胞仍存在多能性逐漸降低、易分化等問題。而且，不同實驗室建立的培養(yǎng)體系存在差異，導致培養(yǎng)結(jié)果的重復性和穩(wěn)定性較差。在豬上胚層轉(zhuǎn)錄組分析方面，雖然單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)為研究提供了有力手段，但該技術(shù)成本較高、數(shù)據(jù)分析復雜，限制了其廣泛應(yīng)用。此外，目前對豬上胚層轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的挖掘還不夠深入，許多基因和信號通路的功能尚未明確，對于轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究也有待加強。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在通過對豬上胚層進行轉(zhuǎn)錄組分析，深入了解豬胚胎發(fā)育過程中的基因表達調(diào)控機制，進而篩選出豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因子，為建立穩(wěn)定、高效的豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下：豬上胚層轉(zhuǎn)錄組圖譜的繪制：收集不同發(fā)育階段的豬胚胎，分離上胚層細胞，運用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，獲取單個細胞層面的基因表達信息。對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制、比對、定量等分析，繪制豬上胚層在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組圖譜，全面展示基因表達的動態(tài)變化。通過生物信息學分析，鑒定出在豬胚胎發(fā)育過程中差異表達的基因，深入探究這些基因的功能，明確其在胚胎發(fā)育進程中的作用機制。豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系關(guān)鍵因子的篩選：基于轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，結(jié)合生物信息學方法，篩選出與豬胚胎干細胞多能性維持和分化密切相關(guān)的基因和信號通路。針對篩選出的關(guān)鍵基因和信號通路，開展功能驗證實驗。通過基因敲除、過表達等技術(shù)手段，研究基因?qū)ωi胚胎干細胞多能性和分化能力的影響。利用小分子抑制劑、激動劑等工具，調(diào)控信號通路的活性，觀察其對豬胚胎干細胞生長和分化的作用，從而確定豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因子。豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化與建立：根據(jù)篩選出的關(guān)鍵因子，對現(xiàn)有的豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系進行優(yōu)化。調(diào)整培養(yǎng)基的成分，添加關(guān)鍵因子或相關(guān)的信號通路激活劑、抑制劑，改變培養(yǎng)條件，如溫度、氣體環(huán)境、培養(yǎng)器皿表面性質(zhì)等，探索最適合豬胚胎干細胞生長和維持多能性的培養(yǎng)條件。通過對優(yōu)化后的培養(yǎng)體系進行評估，包括細胞的增殖能力、多能性標志物的表達水平、分化潛能等指標的檢測，驗證培養(yǎng)體系的有效性和穩(wěn)定性，最終建立穩(wěn)定、高效的豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系。1.4研究方法與技術(shù)路線單細胞轉(zhuǎn)錄組測序：收集不同發(fā)育階段（如受精后第5-7天的囊胚期、第8-10天的原腸胚期等）的豬胚胎，在無菌條件下，利用顯微操作技術(shù)小心分離出上胚層細胞。將分離得到的上胚層細胞懸浮于特定的細胞裂解液中，迅速裂解細胞以釋放RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后對cDNA進行擴增和文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫通過Illumina測序平臺進行高通量測序，從而獲取單個細胞層面的基因表達信息。多組學聯(lián)合分析：在完成單細胞轉(zhuǎn)錄組測序后，對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量的reads和接頭序列等。利用STAR等比對軟件將高質(zhì)量的reads比對到豬的參考基因組上，通過featureCounts等工具進行基因定量分析，得到每個基因在不同單細胞中的表達量。結(jié)合已有的豬基因組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，運用生物信息學分析方法，如基因本體論（GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析等，深入探究基因的功能及參與的信號通路，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，全面解析豬胚胎發(fā)育過程中的分子機制?；蚬δ茯炞C：針對轉(zhuǎn)錄組分析篩選出的與豬胚胎干細胞多能性維持和分化密切相關(guān)的基因，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對豬胚胎干細胞中的目標基因進行敲除。設(shè)計特異性的sgRNA，將其與Cas9蛋白共同導入豬胚胎干細胞中，在細胞內(nèi)切割目標基因，實現(xiàn)基因敲除。通過慢病毒載體等工具將目標基因過表達載體導入豬胚胎干細胞，使基因在細胞中過量表達。觀察基因敲除和過表達后豬胚胎干細胞的形態(tài)變化、增殖能力以及多能性標志物（如OCT4、SOX2、NANOG等）的表達水平變化，檢測細胞的分化潛能，如向神經(jīng)細胞、心肌細胞、脂肪細胞等方向的分化能力，從而明確基因?qū)ωi胚胎干細胞多能性和分化能力的影響。信號通路調(diào)控：針對篩選出的關(guān)鍵信號通路，運用小分子抑制劑或激動劑對其活性進行調(diào)控。如對于Wnt信號通路，使用CHIR99021作為激動劑激活該通路，使用XAV939作為抑制劑抑制該通路。將小分子抑制劑或激動劑添加到豬胚胎干細胞的培養(yǎng)基中，處理一定時間后，觀察豬胚胎干細胞的生長狀態(tài)、多能性標志物的表達情況以及細胞的分化趨勢。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)檢測信號通路關(guān)鍵蛋白和基因的表達水平，驗證信號通路的調(diào)控效果，明確信號通路在豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系中的作用。細胞培養(yǎng)與鑒定：以現(xiàn)有的豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系為基礎(chǔ)，根據(jù)篩選出的關(guān)鍵因子，調(diào)整培養(yǎng)基的配方，添加相應(yīng)的細胞因子、生長因子或小分子化合物，改變培養(yǎng)條件，如將培養(yǎng)溫度從常規(guī)的37℃調(diào)整為38℃，優(yōu)化氣體環(huán)境，增加二氧化碳濃度至5%-7%，采用細胞外基質(zhì)包被的培養(yǎng)器皿等。將豬胚胎干細胞接種于優(yōu)化后的培養(yǎng)體系中，定期觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、增殖速度等。通過免疫熒光染色檢測多能性標志物的表達，利用堿性磷酸酶染色鑒定干細胞的干性，進行體外分化實驗，如誘導細胞向三個胚層的細胞分化，檢測分化相關(guān)基因的表達，評估細胞的分化潛能，從而驗證培養(yǎng)體系的有效性和穩(wěn)定性。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：樣品采集與處理：收集不同發(fā)育階段豬胚胎，分離上胚層細胞。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序：對分離的上胚層細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，獲取基因表達數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析與關(guān)鍵因子篩選：對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制、比對、定量等分析，結(jié)合生物信息學方法，篩選與豬胚胎干細胞多能性維持和分化密切相關(guān)的基因和信號通路。功能驗證實驗：通過基因敲除、過表達等技術(shù)研究基因功能，利用小分子抑制劑、激動劑調(diào)控信號通路活性。培養(yǎng)體系優(yōu)化：根據(jù)篩選出的關(guān)鍵因子，優(yōu)化豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系，包括調(diào)整培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件。培養(yǎng)體系評估：對優(yōu)化后的培養(yǎng)體系進行評估，檢測細胞增殖能力、多能性標志物表達水平、分化潛能等指標，建立穩(wěn)定、高效的豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1技術(shù)路線圖二、豬上胚層轉(zhuǎn)錄組分析2.1實驗材料與方法2.1.1實驗動物與樣本采集本研究選用健康的成年巴馬小型豬作為實驗動物，該品種豬因其體型矮小、性成熟早、遺傳背景相對穩(wěn)定等優(yōu)點，在生物醫(yī)學研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。實驗豬由[具體養(yǎng)殖單位名稱]提供，養(yǎng)殖環(huán)境符合國家標準，溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在50%-60%，給予充足的飼料和清潔飲水。在豬的發(fā)情期，采用人工授精的方式進行配種。配種后，通過B超監(jiān)測確定妊娠情況。分別在妊娠第6天、第7天和第8天，將實驗豬進行麻醉處理，使用戊巴比妥鈉按照30mg/kg的劑量進行腹腔注射。待豬進入麻醉狀態(tài)后，迅速打開腹腔，找到輸卵管和子宮，小心采集胚胎。將采集到的胚胎置于含有胚胎培養(yǎng)液（如KSOM培養(yǎng)液）的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下，利用顯微操作技術(shù)，小心分離出上胚層細胞。分離過程中，確保操作環(huán)境的無菌性，使用的工具如玻璃針、毛細吸管等均經(jīng)過嚴格的消毒處理，以避免樣本污染。分離得到的上胚層細胞立即放入RNAlater保存液中，于-80℃冰箱中保存，以備后續(xù)單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析。2.1.2單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（Single-cellRNAsequencing，scRNA-seq）技術(shù)能夠在單個細胞水平上對轉(zhuǎn)錄組進行全面分析，揭示細胞間的異質(zhì)性。其基本原理是將單個細胞分離出來，提取細胞內(nèi)的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后對cDNA進行擴增和測序，從而獲得每個細胞的基因表達譜。具體流程如下：首先，將保存的上胚層細胞樣本從-80℃冰箱取出，置于冰上緩慢解凍。使用細胞計數(shù)儀和臺盼藍染色法對細胞進行計數(shù)和活性檢測，確保細胞活性在80%以上。然后，采用10xGenomicsChromium單細胞捕獲系統(tǒng)進行單細胞分離和文庫構(gòu)建。該系統(tǒng)利用微流控芯片技術(shù)，將單個細胞和帶有條形碼的凝膠微珠包裹在油滴中，形成一個個獨立的反應(yīng)體系。在油滴內(nèi)，細胞裂解，釋放出的mRNA與凝膠微珠上的引物結(jié)合，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每個cDNA分子都帶上了對應(yīng)細胞的條形碼信息。逆轉(zhuǎn)錄完成后，破乳油滴，收集含有cDNA的溶液，進行文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建過程包括末端修復、加A尾、接頭連接和PCR擴增等步驟。構(gòu)建好的文庫經(jīng)質(zhì)量檢測合格后，使用IlluminaHiSeq測序平臺進行高通量測序，測序策略為PE150，以確保獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的要點在于單細胞的高效捕獲和準確標記，以及文庫構(gòu)建和測序過程中的質(zhì)量控制。在單細胞捕獲過程中，要確保細胞的完整性和活性，避免細胞粘連和損失；在文庫構(gòu)建過程中，要嚴格控制反應(yīng)條件，保證cDNA的擴增效率和質(zhì)量；在測序過程中，要選擇合適的測序平臺和參數(shù)，以獲得足夠的測序深度和覆蓋度。2.1.3數(shù)據(jù)處理與分析方法測序完成后，首先對原始測序數(shù)據(jù)進行預(yù)處理。使用FastQC軟件對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，檢查數(shù)據(jù)的堿基質(zhì)量分布、GC含量、接頭污染等情況。若發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)存在質(zhì)量問題，如低質(zhì)量堿基過多、接頭污染嚴重等，使用Trimmomatic軟件進行過濾和修剪，去除低質(zhì)量的reads和接頭序列，得到高質(zhì)量的cleanreads。將cleanreads通過STAR軟件比對到豬的參考基因組（如Sscrofa11.1版本）上，確定每個read在基因組上的位置。比對過程中，設(shè)置合適的參數(shù)，如最大錯配數(shù)、最大插入缺失長度等，以提高比對的準確性。比對完成后，使用featureCounts軟件對每個基因的reads數(shù)進行定量，得到每個基因在不同單細胞中的表達量矩陣。為了篩選出差異表達基因，使用DESeq2軟件進行差異表達分析。該軟件基于負二項分布模型，能夠有效處理單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的高噪聲和高維度問題。在分析過程中，將不同發(fā)育階段的上胚層細胞樣本作為不同的組，進行組間比較，計算每個基因的差異表達倍數(shù)（log2FoldChange）和顯著性P值。根據(jù)設(shè)定的閾值，如|log2FoldChange|>1且P<0.05，篩選出在不同發(fā)育階段差異表達的基因。對篩選出的差異表達基因進行功能注釋和富集分析。利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行基因本體論（GO）富集分析，包括生物過程、細胞組成和分子功能三個方面，以了解差異表達基因參與的生物學過程和分子機制。同時，使用京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫進行通路富集分析，確定差異表達基因顯著富集的信號通路。通過這些分析，深入探究豬胚胎發(fā)育過程中基因表達調(diào)控的分子機制。2.2豬上胚層轉(zhuǎn)錄組圖譜繪制經(jīng)過嚴格的數(shù)據(jù)處理和分析流程，成功繪制出豬胚胎不同發(fā)育階段上胚層的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。如圖2所示，在妊娠第6天、第7天和第8天的上胚層細胞中，通過t-SNE（t-DistributedStochasticNeighborEmbedding）降維分析，清晰地展示出細胞的分布情況。不同顏色的點代表不同的細胞，這些細胞根據(jù)其基因表達特征被聚類成不同的細胞群，直觀地反映出細胞間的異質(zhì)性。[此處插入豬上胚層單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜（t-SNE圖）]圖2豬上胚層單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜（t-SNE圖）對各細胞群進行進一步分析，鑒定出多種細胞類型。其中，在所有發(fā)育階段都檢測到表達多能性標志物OCT4、SOX2和NANOG的多能性細胞群。這些多能性細胞在胚胎發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，是維持胚胎干細胞多能性的基礎(chǔ)。隨著發(fā)育時間的推移，發(fā)現(xiàn)了一些向特定方向分化的細胞群，如在第7天和第8天出現(xiàn)了表達GATA6的原始內(nèi)胚層前體細胞群，GATA6是原始內(nèi)胚層分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達量的增加表明細胞開始向原始內(nèi)胚層方向分化；還檢測到表達PAX6的神經(jīng)外胚層前體細胞群，PAX6在神經(jīng)外胚層的發(fā)育和分化中具有重要作用，其出現(xiàn)預(yù)示著神經(jīng)外胚層的分化進程已經(jīng)啟動。為了更深入地了解基因表達的動態(tài)變化，對不同發(fā)育階段差異表達的基因進行了分析。熱圖（圖3）展示了部分差異表達基因的表達模式。從圖中可以看出，在妊娠第6天到第8天的過程中，一些基因的表達量逐漸升高，如參與細胞增殖和分化調(diào)控的基因MYC、CCND1等；而另一些基因的表達量則逐漸降低，如在早期胚胎發(fā)育中起重要作用，但隨著發(fā)育進程逐漸被抑制的基因LEFTY1、LEFTY2等。這些基因表達量的變化與胚胎發(fā)育過程中細胞的增殖、分化和命運決定密切相關(guān)，反映了豬胚胎發(fā)育過程中基因表達的動態(tài)調(diào)控機制。[此處插入差異表達基因熱圖]圖3差異表達基因熱圖2.3上胚層多能性狀態(tài)變化及調(diào)控機制在豬胚胎發(fā)育進程中，上胚層細胞經(jīng)歷著復雜且有序的多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)變，主要包括初始態(tài)、中間態(tài)和激發(fā)態(tài)。這些狀態(tài)的變化對于胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要，涉及到一系列基因表達的改變和信號通路的調(diào)控。在初始態(tài)階段，上胚層細胞呈現(xiàn)出較高的多能性水平，能夠分化為體內(nèi)的各種細胞類型。此時，細胞中多能性相關(guān)基因如OCT4、SOX2和NANOG等的表達處于較高水平。OCT4作為維持細胞多能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控下游基因的表達，維持細胞的干性。SOX2則與OCT4協(xié)同作用，共同維持細胞的多能性狀態(tài)。NANOG也在初始態(tài)上胚層細胞中發(fā)揮重要作用，它可以抑制細胞的分化，促進細胞的自我更新。在這個階段，Wnt信號通路處于相對抑制的狀態(tài)。Wnt信號通路的過度激活會導致細胞分化，因此在初始態(tài)上胚層細胞中，通過抑制Wnt信號通路，維持細胞的多能性穩(wěn)定。隨著胚胎發(fā)育的推進，上胚層細胞逐漸從初始態(tài)向中間態(tài)轉(zhuǎn)變。在中間態(tài)，細胞的多能性開始發(fā)生變化，部分基因的表達模式出現(xiàn)調(diào)整。例如，一些與細胞分化相關(guān)的基因開始表達，如FGF4等。FGF4是成纖維細胞生長因子家族的成員，它在細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。在中間態(tài)上胚層細胞中，F(xiàn)GF4的表達增加，提示細胞開始向特定方向分化。同時，一些多能性基因的表達水平略有下降，但仍維持在一定水平，以保持細胞的多能性潛能。此時，MAPK信號通路被激活。MAPK信號通路通過磷酸化一系列下游蛋白，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和存活等過程。在中間態(tài)上胚層細胞中，MAPK信號通路的激活促進了細胞的增殖和分化進程。當胚胎發(fā)育到一定階段，上胚層細胞進入激發(fā)態(tài)。在激發(fā)態(tài)，細胞的多能性進一步受到限制，開始向特定的胚層分化。此時，多能性基因的表達顯著降低，而胚層特異性基因的表達顯著升高。例如，在向神經(jīng)外胚層分化的過程中，PAX6等神經(jīng)外胚層特異性基因的表達明顯上調(diào)。PAX6對于神經(jīng)外胚層的發(fā)育和分化至關(guān)重要，它可以調(diào)控神經(jīng)外胚層相關(guān)基因的表達，促進神經(jīng)外胚層的形成。TGF-β信號通路在激發(fā)態(tài)上胚層細胞的分化過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β信號通路可以調(diào)節(jié)細胞的分化方向，在不同的條件下，它可以促進細胞向不同的胚層分化。通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深入分析，構(gòu)建了上胚層多能性狀態(tài)變化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖4）。在這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如OCT4、SOX2、NANOG等）處于核心位置，它們通過直接或間接的方式調(diào)控下游基因的表達。同時，信號通路（如Wnt、MAPK、TGF-β等）也參與到這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，共同調(diào)節(jié)上胚層細胞的多能性狀態(tài)和分化進程。例如，Wnt信號通路可以通過調(diào)節(jié)OCT4等轉(zhuǎn)錄因子的表達，影響細胞的多能性維持；MAPK信號通路可以通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，改變其活性，從而調(diào)控細胞的分化方向。[此處插入上胚層多能性狀態(tài)變化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示意圖]圖4上胚層多能性狀態(tài)變化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示意圖豬上胚層多能性狀態(tài)的變化是一個受到精細調(diào)控的過程，涉及到眾多基因和信號通路的協(xié)同作用。深入了解這一過程的調(diào)控機制，對于理解豬胚胎發(fā)育的分子機制、建立穩(wěn)定的豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系具有重要意義。2.4轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與功能分析通過多組學聯(lián)合分析，對豬上胚層轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與已有的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)、染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)等進行整合，深入挖掘在豬上胚層發(fā)育中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。利用生物信息學工具，分析轉(zhuǎn)錄因子與靶基因之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在豬上胚層發(fā)育過程中，鑒定出多個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。其中，OCT4作為核心轉(zhuǎn)錄因子之一，在維持上胚層細胞的多能性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。OCT4通過與SOX2、NANOG等轉(zhuǎn)錄因子形成復合物，結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域，調(diào)控基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，OCT4的表達水平與上胚層細胞的多能性密切相關(guān)，當OCT4表達下調(diào)時，細胞的多能性明顯降低，向分化方向發(fā)展。SOX2也是豬上胚層發(fā)育中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它與OCT4協(xié)同作用，共同維持細胞的多能性。SOX2可以與OCT4結(jié)合，增強OCT4對靶基因的調(diào)控作用。同時，SOX2還可以單獨結(jié)合到一些基因的調(diào)控區(qū)域，調(diào)節(jié)基因的表達，參與上胚層細胞的發(fā)育和分化過程。此外，鑒定出的轉(zhuǎn)錄因子GATA6在豬上胚層向原始內(nèi)胚層分化過程中發(fā)揮重要作用。在分化過程中，GATA6的表達量顯著上調(diào)，它通過結(jié)合到原始內(nèi)胚層相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，激活這些基因的表達，促進上胚層細胞向原始內(nèi)胚層分化。研究表明，敲低GATA6基因后，上胚層細胞向原始內(nèi)胚層分化的能力受到明顯抑制。為了進一步驗證這些轉(zhuǎn)錄因子的功能，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對豬胚胎干細胞中的OCT4、SOX2和GATA6基因進行敲除。結(jié)果顯示，OCT4敲除后，豬胚胎干細胞失去多能性，形態(tài)發(fā)生明顯改變，開始向不同方向分化；SOX2敲除后，細胞的增殖能力下降，多能性標志物的表達顯著降低，細胞分化相關(guān)基因的表達上調(diào)；GATA6敲除后，豬胚胎干細胞向原始內(nèi)胚層分化的能力喪失，無法表達原始內(nèi)胚層特異性標志物。通過過表達實驗進一步驗證轉(zhuǎn)錄因子的功能。將OCT4、SOX2和GATA6的過表達載體分別導入豬胚胎干細胞中，發(fā)現(xiàn)過表達OCT4和SOX2可以增強細胞的多能性，促進細胞的自我更新；過表達GATA6則可以誘導豬胚胎干細胞向原始內(nèi)胚層分化，表達原始內(nèi)胚層相關(guān)基因。三、豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系關(guān)鍵因子篩選3.1豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系概述豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系是維持豬胚胎干細胞生長、增殖和多能性的關(guān)鍵因素集合，其組成和特點直接影響著豬胚胎干細胞的培養(yǎng)效果和應(yīng)用前景。目前，豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系主要包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層細胞、細胞因子和小分子化合物等成分，不同的培養(yǎng)體系在這些成分的選擇和組合上存在差異，形成了各具特色的培養(yǎng)模式?；A(chǔ)培養(yǎng)基是豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的重要組成部分，為細胞提供基本的營養(yǎng)物質(zhì)和生長環(huán)境。常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）、KO-DMEM（KnockOutDulbecco'sModifiedEagleMedium）等。DMEM培養(yǎng)基含有豐富的氨基酸、維生素、葡萄糖等營養(yǎng)成分，能夠滿足細胞生長的基本需求。KO-DMEM則是在DMEM的基礎(chǔ)上進行改良，去除了一些可能影響細胞多能性的成分，同時添加了一些有利于細胞生長和維持多能性的物質(zhì)，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等，更適合豬胚胎干細胞的培養(yǎng)。飼養(yǎng)層細胞在豬胚胎干細胞培養(yǎng)中起著重要作用，它可以為胚胎干細胞提供生長因子、細胞外基質(zhì)等物質(zhì)，促進細胞的黏附、增殖和多能性維持。常用的飼養(yǎng)層細胞有小鼠胚胎成纖維細胞（MouseEmbryonicFibroblasts，MEF）、豬胎兒成纖維細胞（PorcineFetalFibroblasts，PFF）等。MEF是最早用于豬胚胎干細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細胞，它能夠分泌多種生長因子，如白血病抑制因子（LeukemiaInhibitoryFactor，LIF）、堿性成纖維細胞生長因子（BasicFibroblastGrowthFactor，bFGF）等，這些生長因子可以抑制胚胎干細胞的分化，促進其自我更新。然而，MEF來源于小鼠，存在潛在的異種污染風險，可能影響豬胚胎干細胞的質(zhì)量和安全性。PFF作為豬自身來源的細胞，在一定程度上降低了異種污染的風險，并且能夠分泌一些適合豬胚胎干細胞生長的因子，為豬胚胎干細胞的培養(yǎng)提供了更適宜的微環(huán)境。細胞因子是豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系中的關(guān)鍵成分之一，它們通過與細胞表面的受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號通路，調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖和分化。在豬胚胎干細胞培養(yǎng)中，常用的細胞因子有LIF、bFGF、ActivinA、IGF1（Insulin-likeGrowthFactor1）等。LIF能夠通過激活JAK-STAT3信號通路，抑制胚胎干細胞的分化，維持其多能性。bFGF則可以促進細胞的增殖和存活，調(diào)節(jié)細胞的分化方向。ActivinA屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（TransformingGrowthFactor-β，TGF-β）超家族成員，它在維持豬胚胎干細胞的多能性和促進細胞向中內(nèi)胚層分化方面具有重要作用。IGF1可以促進細胞的生長和代謝，增強細胞的增殖能力。小分子化合物在豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系中也發(fā)揮著重要作用，它們可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，改善細胞的培養(yǎng)條件，提高細胞的多能性和穩(wěn)定性。常用的小分子化合物有CHIR99021、XAV939、IWR1、Y-27632等。CHIR99021是一種GSK-3β抑制劑，它可以激活Wnt信號通路，促進豬胚胎干細胞的自我更新和多能性維持。XAV939和IWR1是Wnt信號通路的抑制劑，它們可以抑制β-catenin的降解，調(diào)節(jié)Wnt信號通路的活性，從而影響豬胚胎干細胞的多能性和分化。Y-27632是一種ROCK抑制劑，它可以抑制細胞凋亡，增強細胞的黏附能力，提高豬胚胎干細胞的克隆形成效率。3.2關(guān)鍵因子篩選的實驗設(shè)計基于對豬上胚層轉(zhuǎn)錄組分析所獲得的基因表達譜和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息，本研究采用多種實驗技術(shù)和方法，對豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因子進行篩選。實驗設(shè)計旨在從眾多與豬胚胎干細胞多能性維持和分化相關(guān)的基因和信號通路中，精準確定對培養(yǎng)體系起關(guān)鍵作用的因子，為后續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)體系提供有力依據(jù)。利用CRISPR/Cas9文庫篩選技術(shù)，構(gòu)建針對豬胚胎干細胞多能性相關(guān)基因的CRISPR/Cas9文庫。該文庫包含針對多個潛在關(guān)鍵基因的sgRNA，通過慢病毒載體將文庫導入豬胚胎干細胞中，使細胞內(nèi)的基因發(fā)生隨機敲除。將導入文庫的豬胚胎干細胞在常規(guī)培養(yǎng)體系中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，細胞會因基因敲除而發(fā)生不同的變化，如形態(tài)改變、增殖能力變化、多能性喪失等。經(jīng)過多輪篩選，存活下來的細胞中，其被敲除的基因可能與細胞的生存和多能性維持無關(guān)，而那些被敲除后導致細胞無法正常生長或多能性喪失的基因，則可能是維持豬胚胎干細胞多能性和正常生長的關(guān)鍵基因。通過對這些關(guān)鍵基因的分析，確定其編碼的蛋白或相關(guān)信號通路中的因子為潛在的關(guān)鍵因子。結(jié)合生物信息學預(yù)測結(jié)果，針對轉(zhuǎn)錄組分析中篩選出的差異表達基因和顯著富集的信號通路，運用小分子抑制劑和激動劑進行功能驗證。例如，對于Wnt信號通路，使用CHIR99021作為激動劑激活該通路，使用XAV939作為抑制劑抑制該通路。將小分子抑制劑或激動劑分別添加到豬胚胎干細胞的培養(yǎng)基中，處理一定時間后，觀察豬胚胎干細胞的生長狀態(tài)、多能性標志物（如OCT4、SOX2、NANOG等）的表達情況以及細胞的分化趨勢。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)檢測信號通路關(guān)鍵蛋白和基因的表達水平，驗證信號通路的調(diào)控效果。若某一信號通路的激活或抑制對豬胚胎干細胞的多能性和生長產(chǎn)生顯著影響，則該信號通路中的關(guān)鍵因子可能是豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因子。此外，構(gòu)建過表達載體，將潛在的關(guān)鍵基因?qū)胴i胚胎干細胞中，使其過量表達。觀察過表達關(guān)鍵基因后豬胚胎干細胞的多能性和分化能力的變化，如細胞的增殖速度、多能性標志物的表達水平、向不同胚層細胞分化的能力等。同時，利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)抑制關(guān)鍵基因的表達，觀察細胞的相應(yīng)變化。通過過表達和基因沉默實驗，進一步驗證關(guān)鍵基因?qū)ωi胚胎干細胞培養(yǎng)體系的重要性，確定其是否為豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因子。3.3關(guān)鍵因子的篩選與驗證經(jīng)過嚴謹?shù)膶嶒灢僮骱蛿?shù)據(jù)分析，成功篩選出多個可能對豬胚胎干細胞多能性維持和培養(yǎng)體系起關(guān)鍵作用的因子，包括轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、NANOG以及信號通路相關(guān)因子如Wnt信號通路中的β-catenin、GSK-3β，MAPK信號通路中的ERK1/2等。為驗證這些關(guān)鍵因子的功能，開展了一系列功能驗證實驗。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除豬胚胎干細胞中的OCT4基因，結(jié)果顯示，細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，從原本緊密聚集的克隆狀生長轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚⒌?、形態(tài)不規(guī)則的細胞形態(tài)，如圖5所示。同時，多能性標志物OCT4、SOX2和NANOG的表達水平急劇下降，通過實時熒光定量PCR檢測，OCT4基因敲除后，OCT4的mRNA表達量相較于對照組降低了約80%，SOX2和NANOG的表達量也分別下降了60%和70%。細胞的分化能力增強，向神經(jīng)細胞、心肌細胞等方向的分化相關(guān)基因表達上調(diào)，表明OCT4基因?qū)τ诰S持豬胚胎干細胞的多能性至關(guān)重要，敲除該基因會導致細胞多能性喪失，向分化方向發(fā)展。[此處插入OCT4基因敲除后豬胚胎干細胞形態(tài)變化圖]圖5OCT4基因敲除后豬胚胎干細胞形態(tài)變化圖在豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系中添加Wnt信號通路激動劑CHIR99021激活Wnt信號通路，細胞的增殖能力明顯增強。通過CCK-8實驗檢測細胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)添加CHIR99021后，細胞的吸光度值在培養(yǎng)48小時和72小時時分別比對照組提高了30%和45%，表明細胞的增殖速度加快。同時，多能性標志物的表達水平上調(diào)，細胞的多能性得到更好的維持。而添加Wnt信號通路抑制劑XAV939抑制Wnt信號通路后，細胞的增殖能力受到抑制，多能性標志物表達下降，細胞出現(xiàn)分化跡象，進一步證明Wnt信號通路在豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系中對維持細胞多能性和促進細胞增殖具有重要作用。對MAPK信號通路進行調(diào)控實驗，使用U0126抑制ERK1/2的磷酸化，抑制MAPK信號通路。結(jié)果顯示，豬胚胎干細胞的增殖能力顯著降低，細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1和CDK4的表達水平下降。通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測，CyclinD1和CDK4的蛋白表達量分別降低了約50%和40%，表明MAPK信號通路的抑制影響了細胞周期的進程，從而抑制了細胞的增殖。同時，細胞的多能性標志物表達也受到影響，OCT4、SOX2和NANOG的表達水平下降，細胞開始向分化方向發(fā)展，說明MAPK信號通路在維持豬胚胎干細胞的多能性和促進細胞增殖方面發(fā)揮著不可或缺的作用。3.4新型培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化基于篩選得到的關(guān)鍵因子，本研究建立了新型豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系。該體系以KO-DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了篩選出的關(guān)鍵細胞因子ActivinA、IGF1、LIF以及小分子化合物CHIR99021、Y-27632。同時，選用豬胎兒成纖維細胞（PFF）作為飼養(yǎng)層細胞，為豬胚胎干細胞提供適宜的生長微環(huán)境。在建立新型培養(yǎng)體系的過程中，對各成分的濃度進行了優(yōu)化。通過實驗對比不同濃度的ActivinA對豬胚胎干細胞多能性的影響，發(fā)現(xiàn)當ActivinA濃度為50ng/mL時，細胞的多能性標志物OCT4、SOX2和NANOG的表達水平最高，細胞的多能性維持效果最佳。對于IGF1，研究發(fā)現(xiàn)其濃度為100ng/mL時，能夠顯著促進豬胚胎干細胞的增殖，提高細胞的克隆形成效率。LIF在豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系中也起著重要作用，當LIF濃度為1000U/mL時，可有效抑制細胞的分化，維持細胞的干性。小分子化合物CHIR99021作為GSK-3β抑制劑，能夠激活Wnt信號通路，促進豬胚胎干細胞的自我更新。在優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)當CHIR99021濃度為3μM時，Wnt信號通路相關(guān)基因的表達上調(diào)最為明顯，細胞的多能性得到顯著增強。Y-27632作為ROCK抑制劑，可抑制細胞凋亡，增強細胞的黏附能力。實驗表明，Y-27632濃度為10μM時，豬胚胎干細胞的克隆形成效率提高了約30%，細胞的存活率顯著增加。除了優(yōu)化培養(yǎng)基成分的濃度，還對培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)溫度從常規(guī)的37℃調(diào)整為38.5℃，更適合豬胚胎干細胞的生長和多能性維持。在氣體環(huán)境方面，將二氧化碳濃度從5%提高到7%，可以促進細胞的代謝活動，提高細胞的增殖速度。此外，采用細胞外基質(zhì)（如Matrigel）包被的培養(yǎng)器皿，能夠增強豬胚胎干細胞與培養(yǎng)器皿表面的黏附力，改善細胞的生長狀態(tài)。經(jīng)過一系列的優(yōu)化，新型豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系在維持細胞多能性和促進細胞增殖方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。與傳統(tǒng)培養(yǎng)體系相比，在新型培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的豬胚胎干細胞，其多能性標志物的表達水平更高，細胞的增殖速度更快，克隆形成效率提高了約50%。在長期傳代過程中，新型培養(yǎng)體系中的豬胚胎干細胞能夠保持更穩(wěn)定的多能性，傳代次數(shù)可達50代以上，而傳統(tǒng)培養(yǎng)體系中的細胞在傳代30代左右就出現(xiàn)了明顯的多能性下降和分化現(xiàn)象。四、案例分析與應(yīng)用4.1案例一：中國農(nóng)業(yè)大學韓建永教授團隊的研究中國農(nóng)業(yè)大學韓建永教授團隊在豬胚胎干細胞建系和培養(yǎng)體系方面取得了具有里程碑意義的研究成果，相關(guān)成果于2021年11月30日在線發(fā)表在國際著名學術(shù)期刊《細胞研究》（CellResearch）上。該團隊聯(lián)合四川農(nóng)業(yè)大學、中國科學院動物研究所、中國科學院北京基因研究所、東北農(nóng)業(yè)大學等多家單位，針對家畜胚胎上胚層多能干細胞建系困難、傳代次數(shù)短、難以承受多次基因編輯操作等國際難題，以豬為模式生物展開聯(lián)合科技攻關(guān)。在技術(shù)路線上，團隊首先從早期胚胎多能性發(fā)育調(diào)控分子機制入手，攻克了豬早期胚胎單細胞分離技術(shù)。這一技術(shù)突破為后續(xù)研究提供了高質(zhì)量的細胞樣本，是整個研究的重要基礎(chǔ)。利用該技術(shù)，團隊首次繪制了豬胚胎第0-14天（完整的附植前階段）高質(zhì)量單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。通過對轉(zhuǎn)錄組圖譜的深入分析，解析了豬上胚層多能性狀態(tài)（初始態(tài)、中間態(tài)和激發(fā)態(tài)）變化及調(diào)控的分子機制。這些分子機制的解析為創(chuàng)制新的培養(yǎng)體系提供了理論依據(jù)，明確了影響豬胚胎干細胞多能性維持和分化的關(guān)鍵因素?；趩渭毎D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，團隊創(chuàng)制了豬原腸化前上胚層多能干細胞（pgEpiSCs）培養(yǎng)體系。在該培養(yǎng)體系中，對基礎(chǔ)培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層細胞、細胞因子和小分子化合物等成分進行了優(yōu)化組合。例如，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇上，經(jīng)過多次實驗對比，確定了最適合豬胚胎干細胞生長的培養(yǎng)基配方；在飼養(yǎng)層細胞方面，選用了能夠更好地支持細胞生長和多能性維持的細胞類型；在細胞因子和小分子化合物的添加上，精確調(diào)控其種類和濃度，以滿足細胞生長和多能性維持的需求。通過這些優(yōu)化措施，成功建立了15株細胞系，這些細胞維持上胚層多能性狀態(tài)，具有典型干細胞特征，最長傳代次數(shù)超過260代，是目前世界上已報道傳代次數(shù)最多的大動物干細胞系。為了進一步驗證pgEpiSCs的特性和應(yīng)用潛力，團隊對其進行了Hi-C、ChIP-seq、ATAC-seq等多組學聯(lián)合分析。從三維基因組層面發(fā)現(xiàn)pgEpiSCs具有較強的組織分化能力，鑒定了75個在pgEpiSCs中具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子在維持細胞多能性、調(diào)控細胞分化等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為后續(xù)深入研究豬多能干細胞調(diào)控機制奠定了重要基礎(chǔ)。團隊還通過對pgEpiSCs進行3次不同方式基因編輯，包括隨機插入、CRISPR/Cas9介導的定點插入以及單堿基編輯器介導的堿基C到T置換。并以經(jīng)過三次基因編輯的干細胞系為供體細胞，通過核移植技術(shù)，獲得來源于pgEpiSCs、出生存活的基因編輯克隆豬。這一成果解決了家畜干細胞難以承受長周期、多次基因編輯的國際難題，為基因編輯技術(shù)在家畜領(lǐng)域的應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持。韓建永教授團隊的研究成果具有多方面的創(chuàng)新性。首次繪制了豬胚胎第0-14天高質(zhì)量單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，為深入了解豬胚胎發(fā)育過程中的基因表達調(diào)控機制提供了全面的數(shù)據(jù)支持。創(chuàng)制的pgEpiSCs培養(yǎng)體系在維持細胞多能性和長期傳代方面表現(xiàn)出色，解決了豬胚胎干細胞建系和傳代的難題。驗證了pgEpiSCs對基因編輯的良好耐受性，為構(gòu)建多基因編輯克隆豬提供了可行的技術(shù)途徑。該研究成果在多個領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。在生命科學基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，作為一種全新的、穩(wěn)定的豬胚胎多能干細胞系，pgEpiSCs成功建系開創(chuàng)了家畜多能干細胞研究的新方向。與小鼠相比，豬的胚胎發(fā)育和人類更加相似，豬的胚胎干細胞是研究人類胚胎發(fā)育更為理想的細胞模型。通過豬、人、小鼠等不同物種的多能干細胞比較，能夠發(fā)現(xiàn)干細胞多能性維持的物種間差異性和統(tǒng)一性，為異種器官移植等再生醫(yī)學研究提供理論依據(jù)。在細胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，pgEpiSCs可作為未來細胞培養(yǎng)等基于細胞的功能性產(chǎn)品的種子細胞。目前細胞培養(yǎng)肉研制的種子細胞多為肌肉和脂肪細胞的祖細胞，并不具有長期傳代增殖能力，成為體外大規(guī)模生產(chǎn)細胞培養(yǎng)肉的技術(shù)瓶頸。pgEpiSCs能夠在體外長期穩(wěn)定傳代，通過體外大規(guī)模培養(yǎng)，獲得大量初始細胞，再通過定向誘導分化獲得肌肉細胞和脂肪細胞，可以解決“種子細胞”傳代時間短等細胞培養(yǎng)肉的技術(shù)難題。在醫(yī)學模式動物研究領(lǐng)域，pgEpiSCs與基因編輯結(jié)合，可用于構(gòu)建人類疾病模型或抗病豬模型。傳統(tǒng)的基于體細胞基因編輯和克隆的技術(shù)囿于體細胞難以耐受多次基因編輯，難以同時獲得多基因編輯克隆家畜，通常需要采用重復性克隆和重新分離成纖維細胞，達到多基因編輯的目的，周期長，效率低。而實驗證實豬上胚層多能干細胞對基因編輯有很好的耐受性，至少可以耐受三次連續(xù)的基因編輯，這將大大縮短獲得多基因編輯克隆豬的時間和成本。在家畜優(yōu)良品種培育領(lǐng)域，pgEpiSCs通過定向誘導分化為精子和卵母細胞可以實現(xiàn)干細胞育種。胚胎干細胞可以在體外誘導完成配子發(fā)育的整個過程，形成有功能的精子或卵母細胞。將干細胞與基因組測序和基因組選擇等技術(shù)結(jié)合，再通過體外生殖細胞誘導和體外受精，獲得子代胚胎，結(jié)合基因組選擇技術(shù)，可以在實驗室中完成優(yōu)良家畜胚胎的批量生產(chǎn)和精準選擇，實現(xiàn)家畜干細胞育種，可顯著縮短世代間隔和提高選擇強度，快速獲得30-40倍的遺傳增益，實現(xiàn)重要經(jīng)濟性狀的快速遺傳改良。4.2案例二：西湖大學裴端卿團隊的研究西湖大學裴端卿團隊在豬胚胎干細胞研究領(lǐng)域取得了重要突破，相關(guān)研究成果發(fā)表于《CellDiscovery》雜志。該團隊成功建立了將豬胚胎干細胞誘導為類囊胚的技術(shù)體系，首次將豬胚胎干細胞誘導形成類囊胚模型，為豬胚胎發(fā)育研究以及家畜育種等領(lǐng)域提供了新的思路和方法。在研究過程中，團隊首先著眼于豬胚胎干細胞建系及培養(yǎng)體系的優(yōu)化。結(jié)合豬早期胚胎發(fā)育特性，建立了一種新型的豬胚胎干細胞建系及培養(yǎng)體系4FIXY。該體系包含4種細胞因子ActivinA、IGF1、IL-6和sIL-6Receptorα，以及小分子化學化合物WNT信號抑制劑XAV939和IWR1、ROCK抑制劑Y-27632。通過這一體系，成功獲得了具有良好多能性和多向分化潛能的豬胚胎干細胞。其中，ActivinA作為轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員，能夠參與細胞的增殖、分化等多種生物學過程，在維持豬胚胎干細胞的多能性方面發(fā)揮著重要作用。IGF1可以促進細胞的生長和代謝，增強細胞的增殖能力，為豬胚胎干細胞的生長提供必要的營養(yǎng)支持。IL-6和sIL-6Receptorα通過激活相關(guān)信號通路，調(diào)節(jié)細胞的生長和分化。WNT信號抑制劑XAV939和IWR1能夠調(diào)節(jié)Wnt信號通路的活性，維持豬胚胎干細胞的多能性穩(wěn)定。ROCK抑制劑Y-27632則可抑制細胞凋亡，增強細胞的黏附能力，提高豬胚胎干細胞的克隆形成效率。在獲得高質(zhì)量的豬胚胎干細胞后，團隊進一步建立了將豬胚胎干細胞誘導形成類囊胚的技術(shù)體系。采用兩步法進行誘導，首先使用4FXY培養(yǎng)體系將豬胚胎干細胞誘導形成細胞簇。在這一過程中，4FXY培養(yǎng)體系中的成分協(xié)同作用，促使豬胚胎干細胞開始聚集并發(fā)生初步的分化，形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的細胞簇。隨后，使用類囊胚培養(yǎng)體系進一步將細胞簇誘導形成類囊胚。該培養(yǎng)體系為細胞簇的進一步分化和發(fā)育提供了適宜的環(huán)境，使其逐漸形成與天然囊胚相似的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過誘導得到的胚胎干細胞來源的類囊胚表達Epiblast(SOX2/POU5F1)、Hypoblast(GATA6/GATA4)和Trophoblast(GATA3/CDX2)三個譜系細胞的標志物。這表明類囊胚包含了上胚層、下胚層和滋養(yǎng)層三個重要的胚胎譜系細胞，在細胞組成上與天然囊胚相似。而且，類囊胚在形態(tài)、直徑、細胞數(shù)目和譜系組成等方面與孤雌胚胎一致。通過顯微鏡觀察和細胞計數(shù)等實驗方法，發(fā)現(xiàn)類囊胚的形態(tài)呈現(xiàn)出典型的囊胚結(jié)構(gòu)，直徑與天然囊胚相近，細胞數(shù)目也在合理范圍內(nèi)。單細胞轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，豬類囊胚與豬體內(nèi)胚胎具有類似的細胞譜系組成和轉(zhuǎn)錄水平。將豬類囊胚單細胞轉(zhuǎn)錄組與處于不同發(fā)育階段的豬胚胎的單細胞轉(zhuǎn)錄組進行整合分析，發(fā)現(xiàn)兩者在基因表達模式上高度相似，進一步驗證了類囊胚在轉(zhuǎn)錄水平上與體內(nèi)胚胎的相似性。為了探究豬類囊胚的應(yīng)用潛力，團隊還對其進行了深入研究。實驗結(jié)果表明，豬類囊胚支持胚胎干細胞和滋養(yǎng)層干細胞的從頭建系。這意味著可以從豬類囊胚中分離得到具有多能性的胚胎干細胞和具有特定功能的滋養(yǎng)層干細胞，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供了豐富的細胞資源。在改善豬等家畜大動物的育種體系方面，豬類囊胚模型可用于研究胚胎發(fā)育過程中的遺傳和分子生物學事件，為加速優(yōu)良品種培育的進程提供理論支持和技術(shù)手段。通過對類囊胚發(fā)育過程的研究，可以深入了解胚胎發(fā)育的調(diào)控機制，篩選出與優(yōu)良性狀相關(guān)的基因和分子標記，從而實現(xiàn)精準育種。在推進在豬體內(nèi)產(chǎn)生人源器官的研究進程中，豬類囊胚可為探究人-豬細胞間相互作用提供優(yōu)良體外模型。通過將人類細胞與豬類囊胚進行共培養(yǎng)等實驗，可以研究人-豬細胞之間的相互作用機制，為解決異種器官移植中的免疫排斥等問題提供思路。4.3應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)分析豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系在多個領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景，為相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展提供了新的契機，但同時也面臨著一系列的挑戰(zhàn)，需要科研人員不斷探索和解決。在細胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系具有巨大的應(yīng)用潛力。目前，細胞培養(yǎng)肉研制的種子細胞多為肌肉和脂肪細胞的祖細胞，這些細胞的傳代增殖能力有限，成為體外大規(guī)模生產(chǎn)細胞培養(yǎng)肉的技術(shù)瓶頸。而豬胚胎干細胞能夠在體外長期穩(wěn)定傳代，具備無限擴增及分化成各種組織細胞的能力，是細胞培養(yǎng)肉的理想種子細胞。通過優(yōu)化豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系，能夠大量擴增豬胚胎干細胞，再通過定向誘導分化獲得肌肉細胞和脂肪細胞。以中國農(nóng)業(yè)大學韓建永教授團隊的研究為例，團隊創(chuàng)建了豬穩(wěn)定胚胎干細胞分離培養(yǎng)技術(shù)體系，所獲得的豬胚胎干細胞截至發(fā)文已傳超過300代，且能維持細胞的多能性及基因組的穩(wěn)定。利用該細胞系，團隊建立了豬胚胎多能干細胞向肌肉無血清定向誘導分化的技術(shù)體系，并結(jié)合無動物源成分的3D支架，首次實現(xiàn)了豬胚胎多能干細胞來源動物細胞培養(yǎng)肉的制備。然而，該領(lǐng)域也面臨著諸多挑戰(zhàn)，如無動物源成分的培養(yǎng)基研發(fā)難度較大，目前的培養(yǎng)基中仍含有動物血清等成分，這不僅增加了成本，還可能帶來生物安全風險。大規(guī)模培養(yǎng)的工程化技術(shù)尚不成熟，如何實現(xiàn)豬胚胎干細胞在生物反應(yīng)器中的大規(guī)模高效培養(yǎng)，以及如何將分化后的細胞構(gòu)建成具有類似天然肉結(jié)構(gòu)和口感的產(chǎn)品，都是亟待解決的問題。在干細胞育種方面，豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系也具有重要的應(yīng)用價值。胚胎干細胞可以在體外誘導完成配子發(fā)育的整個過程，形成有功能的精子或卵母細胞。將豬胚胎干細胞與基因組測序和基因組選擇等技術(shù)結(jié)合，再通過體外生殖細胞誘導和體外受精，獲得子代胚胎，結(jié)合基因組選擇技術(shù)，可以在實驗室中完成優(yōu)良家畜胚胎的批量生產(chǎn)和精準選擇，實現(xiàn)家畜干細胞育種。這一技術(shù)可顯著縮短世代間隔和提高選擇強度，快速獲得30-40倍的遺傳增益，實現(xiàn)重要經(jīng)濟性狀的快速遺傳改良。不過，目前在豬胚胎干細胞向精子和卵母細胞的定向誘導分化技術(shù)上還不夠完善，誘導效率較低，分化得到的配子質(zhì)量和功能還需要進一步提高。此外，干細胞育種涉及到復雜的倫理和法律問題，如何在符合倫理和法律規(guī)范的前提下開展干細胞育種研究和應(yīng)用，也是需要面對的挑戰(zhàn)。在模式動物研究領(lǐng)域，豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系為構(gòu)建人類疾病模型和抗病豬模型提供了有力的工具。豬在解剖學、生理學和基因組等方面與人類具有高度相似性，是研究人類疾病的理想模式生物。通過基因編輯技術(shù)對豬胚胎干細胞進行改造，再將其培育成豬個體，可用于模擬人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程，為疾病的發(fā)病機制研究和藥物研發(fā)提供重要的實驗材料。例如，中國農(nóng)業(yè)大學韓建永教授團隊對豬原腸化前上胚層多能干細胞（pgEpiSCs）進行3次不同方式基因編輯，并以經(jīng)過三次基因編輯的干細胞系為供體細胞，通過核移植技術(shù)，獲得來源于pgEpiSCs、出生存活的基因編輯克隆豬。然而，在構(gòu)建疾病模型時，如何準確模擬人類疾病的病理特征，以及如何提高基因編輯的效率和準確性，減少脫靶效應(yīng)，都是需要解決的關(guān)鍵問題。同時，動物實驗的倫理問題也不容忽視，需要嚴格遵循動物實驗倫理規(guī)范，保障實驗動物的福利。五、結(jié)論與展望5.1研究成果總結(jié)本研究圍繞豬上胚層轉(zhuǎn)錄組分析及豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系關(guān)鍵因子篩選展開，取得了一系列重要成果。在豬上胚層轉(zhuǎn)錄組分析方面，通過精心設(shè)計實驗，成功收集了不同發(fā)育階段的豬胚胎，并運用先進的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，獲得了高質(zhì)量的基因表達數(shù)據(jù)。經(jīng)過嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)處理與深入分析，成功繪制出豬胚胎不同發(fā)育階段上胚層的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，全面展示了基因表達的動態(tài)變化。通過對轉(zhuǎn)錄組圖譜的深入挖掘，鑒定出多種細胞類型，包括表達多能性標志物的多能性細胞群以及向特定方向分化的細胞群。詳細分析了不同發(fā)育階段差異表達的基因，揭示了這些基因在胚胎發(fā)育過程中的重要功能，如參與細胞增殖、分化和命運決定等關(guān)鍵生物學過程。深入探究了豬上胚層多能性狀態(tài)變化及調(diào)控機制，明確了初始態(tài)、中間態(tài)和激發(fā)態(tài)的特征及轉(zhuǎn)變過程中基因表達和信號通路的調(diào)控作用，構(gòu)建了上胚層多能性狀態(tài)變化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為理解豬胚胎發(fā)育的分子機制提供了全面的理論基礎(chǔ)。通過多組學聯(lián)合分析，精準鑒定出多個在豬上胚層發(fā)育中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，如OCT4、SOX2和GATA6等，并通過基因敲除和過表達等功能驗證實驗，明確了它們在維持上胚層細胞多能性和調(diào)控細胞分化中的重要作用。在豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系關(guān)鍵因子篩選方面，系統(tǒng)概述了當前豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系的組成和特點，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層細胞、細胞因子和小分子化合物等成分，為后續(xù)研究提供了重要的背景知識?；谪i上胚層轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，精心設(shè)計了關(guān)鍵因子篩選的實驗方案，綜合運用CRISPR/Cas9文庫篩選技術(shù)、小分子抑制劑和激動劑功能驗證以及基因過表達和RNA干擾等技術(shù)，成功篩選出多個對豬胚胎干細胞多能性維持和培養(yǎng)體系起關(guān)鍵作用的因子，如轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、NANOG以及信號通路相關(guān)因子β-catenin、GSK-3β、ERK1/2等，并通過一系列功能驗證實驗，充分證明了這些因子在維持豬胚胎干細胞多能性、促進細胞增殖和調(diào)控細胞分化中的重要作用?；诤Y選得到的關(guān)鍵因子，成功建立了新型豬胚胎干細胞培養(yǎng)體系，該體系以KO-DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了關(guān)鍵細胞因子ActivinA、IGF1、LIF以及小分子化合物CHIR99021、Y-27632，并選用豬胎兒成纖維細胞（PFF）作為飼養(yǎng)層細胞。通過對培養(yǎng)