第49講基因工程的基本工具和基本操作程序生物技術(shù)與工程20222026高三一輪復(fù)習(xí)生物教研組胡士勇2026.10.25新人教版選擇性必修三第3章基因工程【模塊網(wǎng)絡(luò)圖】【目標(biāo)展示】1.闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。3.DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)。4.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定。1.(教材選必3P71正文)切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列。()2.(教材選必3P72“旁欄思考”)DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事。()3.(教材選必3P77“相關(guān)信息”)用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列。()4.(教材選必3P80正文)基因表達(dá)載體中含有起始密碼子和終止子()5.(教材選必3P93正文)對(duì)蛋白質(zhì)的改造是通過直接改造相應(yīng)的mRNA來實(shí)現(xiàn)的。()××√√×【師生互動(dòng)】1．(教材選必3P71“旁欄思考”)你能根據(jù)所掌握的知識(shí)，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是_________________________________________________。提示：當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全20222．(教材選擇性必修3P74“拓展應(yīng)用1”)限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子的原因可能是_____________________________________________________________。提示：含有某種限制酶的細(xì)胞的DNA分子或者不具備這種限制酶的識(shí)別序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開3．(教材選擇性必修3P77“相關(guān)信息”)PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋，其原因是________________________________________。提示：真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活20224．(教材選擇性必修3P102“相關(guān)信息”)在轉(zhuǎn)基因研究工作中，我國科學(xué)家將來自玉米的α-淀粉酶基因與目的基因一起轉(zhuǎn)入植物中，可防止轉(zhuǎn)基因花粉的傳播的原因是_________________________________________________________。提示：由于α-淀粉酶基因可以阻斷淀粉儲(chǔ)藏使花粉失去活性，因而可以防止轉(zhuǎn)基因花粉的傳播考點(diǎn)二基因工程[要點(diǎn)整合]1．三種操作工具的歸納(1)限制酶2022(2)兩類DNA連接酶的比較常用類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體特點(diǎn)只縫合黏性末端縫合黏性末端和平末端2022(3)載體的歸納20222．利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因關(guān)于引物的2點(diǎn)提醒：①引物是一小段單鏈的DNA或RNA，作為新子鏈合成的起點(diǎn)，一定要結(jié)合在DNA鏈的3′端；②只有通過引物，DNA才可以開始進(jìn)行復(fù)制。20223．基因表達(dá)載體的構(gòu)建(1)圖解組成及作用2022(2)圖解限制酶的選擇原則①不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。②保留標(biāo)記基因原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。③確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。2022(3)篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞2022①原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。②被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌。③篩選方法：將細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。4．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法類型方法說明特點(diǎn)植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞→將目的基因整合到植物細(xì)胞的染色體DNA上→目的基因表達(dá)經(jīng)濟(jì)、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物。2022類型方法說明特點(diǎn)植物細(xì)胞花粉管通道法用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊簡便、經(jīng)濟(jì)，我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有新性狀的動(dòng)物將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最為有效的方法2022微生物細(xì)胞Ca2＋處理法Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入簡便、經(jīng)濟(jì)、有效5.目的基因的檢測與鑒定2022[特別提醒](1)DNA連接酶無識(shí)別的特異性，對(duì)于相同或互補(bǔ)的黏性末端以及平末端都能連接。(2)細(xì)胞膜上的載體與基因工程中的載體化學(xué)本質(zhì)不同：細(xì)胞膜上的載體化學(xué)成分是蛋白質(zhì)；基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌體、動(dòng)植物病毒等。(3)PCR中的復(fù)性不一定均為引物與DNA模板結(jié)合。復(fù)性時(shí)，引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在DNA解開的兩條鏈的結(jié)合。(4)PCR反應(yīng)的結(jié)果不都是所需的DNA片段。因?yàn)榈谝淮窝h(huán)得到的DNA片段只有一種引物，比所需的DNA片段要長，從第三次循環(huán)才出現(xiàn)所需的DNA片段，這樣的片段存在兩種引物。2022限制酶和DNA連接酶PCR目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法PCR技術(shù)、抗原—抗體雜交2022【體系整合】2022【高質(zhì)訓(xùn)練】1.（2023山東卷）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。(1)與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是

。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有

（答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可）。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物

。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的

（填“a鏈”或“b鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。(3)重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了

，條帶2所檢出的蛋白

（填“是”或“不是”）由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。

2022（1）①RNA聚合酶

②限制酶切位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等

（2）①F2和R1或F1與R2②a（3）①J-V5融合蛋白②不是（2021?山東卷）25.人類γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信