基于轉(zhuǎn)錄組解析非洲菊舌狀花生長(zhǎng)中赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)一、引言1.1研究背景非洲菊（GerberajamesoniiBolus），又名扶郎花、太陽(yáng)菊，為菊科（Asteraceae）非洲菊屬（Gerbera）多年生宿根草本花卉，是世界五大切花之一，具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其花色豐富多樣，涵蓋了紅色、白色、黃色、橙色、粉紅色、紫色等多種色彩，花型獨(dú)特，有單瓣和重瓣等不同品種，常被用于制作花籃、花束、花環(huán)、瓶插花、壁花以及裝飾用花等，在園藝景觀中占據(jù)著重要地位。植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到多種內(nèi)外因素的精細(xì)調(diào)控，其中植物激素發(fā)揮著關(guān)鍵作用。赤霉素（Gibberellins，GAs）作為一類重要的植物激素，廣泛存在于高等植物、藻類、真菌及細(xì)菌中。自1926年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，赤霉素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控作用一直是植物生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。赤霉素參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過(guò)程，包括種子萌發(fā)、莖稈伸長(zhǎng)、葉片擴(kuò)展、開花誘導(dǎo)和果實(shí)發(fā)育等。在非洲菊的生長(zhǎng)過(guò)程中，赤霉素同樣起著不可或缺的作用，它能夠調(diào)控非洲菊的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，使植株更加挺拔；影響開花進(jìn)程，包括開花時(shí)間的早晚、花器官的發(fā)育等；還能在開花后對(duì)花器的進(jìn)一步生長(zhǎng)產(chǎn)生作用，如影響花瓣的伸展、花朵的大小等。然而，盡管已有一些研究關(guān)注非洲菊的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，但目前對(duì)于非洲菊赤霉素調(diào)控生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)制的了解仍十分有限。轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA及非編碼RNA等。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，可以全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，從而深入了解基因的表達(dá)情況、功能注釋以及參與的代謝通路等。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)非洲菊舌狀花進(jìn)行研究，能夠從分子層面揭示其在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)變化規(guī)律，為探究赤霉素調(diào)控非洲菊生長(zhǎng)的分子機(jī)制提供全面的數(shù)據(jù)支持。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建赤霉素調(diào)控非洲菊生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，有助于系統(tǒng)地解析赤霉素在非洲菊生長(zhǎng)過(guò)程中的調(diào)控路徑，明確各個(gè)基因之間的相互關(guān)系和作用方式。這不僅能夠豐富我們對(duì)植物激素調(diào)控花卉生長(zhǎng)發(fā)育分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也將為非洲菊的栽培和應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)意義和實(shí)踐價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)對(duì)非洲菊舌狀花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合生物信息學(xué)手段，深入探究赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的分子機(jī)制，構(gòu)建赤霉素調(diào)控非洲菊生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。具體而言，本研究擬達(dá)到以下目標(biāo)：其一，利用RNA-seq技術(shù)對(duì)非洲菊舌狀花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲取全面的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)這些數(shù)據(jù)的深入挖掘，篩選出與赤霉素調(diào)控相關(guān)的差異表達(dá)基因，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。其二，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和代謝通路分析，明確這些基因在非洲菊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能以及參與的代謝途徑，從而初步揭示赤霉素調(diào)控非洲菊生長(zhǎng)的分子機(jī)制。其三，基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)和功能分析結(jié)果，構(gòu)建赤霉素調(diào)控非洲菊生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，直觀展示各個(gè)基因之間的相互關(guān)系和作用路徑，為深入理解赤霉素的調(diào)控機(jī)制提供清晰的框架。本研究具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。從理論層面來(lái)看，深入解析赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，有助于填補(bǔ)當(dāng)前對(duì)非洲菊生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制研究的空白，豐富和完善植物激素調(diào)控花卉生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制理論體系。通過(guò)研究赤霉素在非洲菊生長(zhǎng)過(guò)程中的作用機(jī)制，可以更好地理解植物激素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的精細(xì)調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究其他植物激素的作用機(jī)制提供參考和借鑒，推動(dòng)植物生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。從實(shí)踐應(yīng)用角度出發(fā)，本研究的成果將為非洲菊的栽培和應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。通過(guò)明確赤霉素調(diào)控非洲菊生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，可以為非洲菊的品種改良和栽培技術(shù)優(yōu)化提供精準(zhǔn)的分子靶點(diǎn)。在實(shí)際生產(chǎn)中，種植者可以根據(jù)研究結(jié)果，合理調(diào)控赤霉素的含量和作用時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)非洲菊生長(zhǎng)發(fā)育的精確調(diào)控，提高花卉的品質(zhì)和產(chǎn)量。例如，通過(guò)調(diào)控赤霉素信號(hào)通路，可以促進(jìn)非洲菊植株的健壯生長(zhǎng)，使花朵更加碩大、色澤更加鮮艷，提高切花的商品價(jià)值；還可以調(diào)節(jié)開花時(shí)間，滿足市場(chǎng)對(duì)不同花期非洲菊的需求，增加經(jīng)濟(jì)效益。此外，本研究成果也有助于推動(dòng)花卉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，為其他花卉的生長(zhǎng)調(diào)控研究提供有益的思路和方法，促進(jìn)整個(gè)花卉產(chǎn)業(yè)的技術(shù)升級(jí)和創(chuàng)新發(fā)展。二、非洲菊與赤霉素相關(guān)研究基礎(chǔ)2.1非洲菊概述非洲菊（GerberajamesoniiBolus），隸屬于菊科（Asteraceae）非洲菊屬（Gerbera），是一種多年生宿根草本花卉，因其獨(dú)特的魅力和廣泛的應(yīng)用，在花卉領(lǐng)域占據(jù)著重要地位。從形態(tài)特征來(lái)看，非洲菊植株高度通常在30-60厘米之間，根莖短粗，被殘存的葉柄緊緊圍裹，下方生長(zhǎng)著較為粗壯的須根，為植株提供穩(wěn)定的支撐和充足的養(yǎng)分吸收。其葉片基生，呈蓮座狀排列，葉片形狀多為長(zhǎng)橢圓形至長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)度大約在10-14厘米，寬度在5-6厘米左右。葉片頂端短尖或略鈍，基部逐漸變窄，邊緣呈現(xiàn)不規(guī)則的羽狀淺裂或深裂，這種獨(dú)特的葉片形態(tài)不僅增加了葉片的表面積，有利于光合作用的進(jìn)行，還為植株增添了一份自然的美感。葉片上面光滑無(wú)毛，下面則被有短柔毛，隨著葉片的老化，柔毛會(huì)逐漸脫落。葉片的中脈在兩面均明顯凸起，下面尤為粗壯，側(cè)脈大約有5-7對(duì)，它們離緣彎拱連接，形成了清晰的網(wǎng)脈，為葉片的物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞提供了通道。非洲菊的花葶單生，或有時(shí)數(shù)個(gè)叢生，高度在25-60厘米之間，花葶上無(wú)苞葉，但被有柔毛，且頂部的柔毛最為稠密。頭狀花序單生于花葶之頂，當(dāng)花期舌瓣展開時(shí)，花朵直徑可達(dá)6-10厘米，碩大而艷麗?？偘淑娦?，大約與兩性花等長(zhǎng)，直徑可達(dá)2厘米?？偘譃?層，外層為線形或鉆形，頂端尖銳，長(zhǎng)8-10毫米，寬約1-1.5毫米，背面被有柔毛；內(nèi)層為長(zhǎng)圓狀披針形，頂端尾尖，長(zhǎng)10-14毫米，寬約2毫米，邊緣呈干膜質(zhì)，背脊上被有疏柔毛。花托扁平且裸露，呈蜂窩狀，直徑在6-8毫米。非洲菊的花朵色彩豐富多樣，涵蓋了紅色、白色、黃色、橙色、粉紅色、紫色等多種顏色，花瓣形態(tài)也各不相同，有單瓣和重瓣等類型，每一種都散發(fā)著獨(dú)特的魅力。非洲菊具有極高的觀賞價(jià)值，其花朵碩大，花形優(yōu)美，色彩鮮艷奪目，無(wú)論是單獨(dú)觀賞還是與其他花卉搭配，都能營(yíng)造出獨(dú)特的視覺效果。在園林景觀中，非洲菊常被用于花壇、花境的布置，與其他花卉相互映襯，形成五彩斑斕的花卉景觀，為園林增添生機(jī)與活力。在室內(nèi)裝飾方面，非洲菊也是備受青睞的花卉之一。其切花可用于制作精美的花籃、花束、花環(huán)等，擺放在客廳、臥室、書房等場(chǎng)所，能為室內(nèi)環(huán)境增添溫馨、浪漫的氛圍；也可作為瓶插花，放置在餐桌、茶幾等位置，成為室內(nèi)的點(diǎn)睛之筆，為人們帶來(lái)美的享受。此外，非洲菊還可作為壁花進(jìn)行裝飾，將其懸掛在墻壁上，能為單調(diào)的墻面增添藝術(shù)氣息，打造出獨(dú)特的室內(nèi)裝飾風(fēng)格。除了觀賞價(jià)值外，非洲菊在花卉產(chǎn)業(yè)中也具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。它是世界五大切花之一，市場(chǎng)需求廣泛，不僅在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)深受消費(fèi)者喜愛，在國(guó)際市場(chǎng)上也具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。非洲菊的種植和銷售為許多地區(qū)帶來(lái)了可觀的經(jīng)濟(jì)效益，帶動(dòng)了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，如花卉種植、花卉運(yùn)輸、花卉銷售等，為當(dāng)?shù)貏?chuàng)造了大量的就業(yè)機(jī)會(huì)，促進(jìn)了經(jīng)濟(jì)的繁榮。在種植方面，非洲菊的栽培技術(shù)不斷發(fā)展和完善，種植規(guī)模也在逐漸擴(kuò)大。許多花卉種植基地專門從事非洲菊的種植，通過(guò)科學(xué)的種植管理和先進(jìn)的栽培技術(shù)，提高了非洲菊的產(chǎn)量和品質(zhì)，滿足了市場(chǎng)對(duì)高品質(zhì)非洲菊的需求。在銷售環(huán)節(jié)，非洲菊通過(guò)各種渠道進(jìn)入市場(chǎng)，包括花卉批發(fā)市場(chǎng)、花店、電商平臺(tái)等，方便了消費(fèi)者的購(gòu)買，進(jìn)一步推動(dòng)了非洲菊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。2.2赤霉素對(duì)植物生長(zhǎng)的調(diào)控作用赤霉素作為一類重要的植物激素，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對(duì)植物的種子萌發(fā)、莖伸長(zhǎng)、開花等生理過(guò)程有著顯著的調(diào)控作用，其作用機(jī)制復(fù)雜且多樣。在種子萌發(fā)階段，赤霉素起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。許多植物種子在休眠狀態(tài)下難以萌發(fā)，而赤霉素能夠打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)。其作用機(jī)制主要是通過(guò)誘導(dǎo)種子糊粉層中α-淀粉酶的合成，催化種子內(nèi)貯藏物質(zhì)的降解，為胚的生長(zhǎng)發(fā)育提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。以大麥種子為例，當(dāng)種子處于休眠狀態(tài)時(shí)，糊粉層中α-淀粉酶的含量較低，淀粉等貯藏物質(zhì)難以分解，胚得不到足夠的養(yǎng)分，從而無(wú)法正常萌發(fā)。而在赤霉素的作用下，糊粉層細(xì)胞被激活，大量合成α-淀粉酶，這些淀粉酶將淀粉水解為可溶性糖，如麥芽糖等，為胚的生長(zhǎng)提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)，從而促進(jìn)種子萌發(fā)。此外，對(duì)于一些需光和需低溫才能萌發(fā)的種子，赤霉素可代替光照和低溫打破休眠，促進(jìn)萌發(fā)，這一特性使得植物在不同的環(huán)境條件下都能有機(jī)會(huì)啟動(dòng)萌發(fā)過(guò)程，提高了植物的生存和繁衍能力。在植物的莖伸長(zhǎng)過(guò)程中，赤霉素最顯著的生理效應(yīng)就是促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，從而使植株的高度增加。赤霉素主要作用于已有的節(jié)間伸長(zhǎng)，而不是促進(jìn)節(jié)數(shù)的增加。它能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)，其作用機(jī)制與細(xì)胞壁的可塑性增加有關(guān)。研究表明，赤霉素可以通過(guò)提高細(xì)胞壁的延展性，使細(xì)胞壁能夠承受更大的膨壓，從而促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)。具體來(lái)說(shuō)，赤霉素可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁相關(guān)酶的活性，如擴(kuò)張蛋白、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶/水解酶等，來(lái)改變細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞壁的可塑性。在葉莖類作物如芹菜、萵苣、韭菜、牧草、茶、苧麻的生產(chǎn)上，常常使用赤霉素促進(jìn)生長(zhǎng)。用赤霉素處理這些作物，能顯著促進(jìn)植株莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，尤其是對(duì)矮生突變品種的效果特別明顯，使植株更加健壯，提高了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。但赤霉素對(duì)離體莖切段的伸長(zhǎng)沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，這表明赤霉素促進(jìn)莖伸長(zhǎng)可能需要完整植株的某些其他因素的協(xié)同作用。赤霉素在植物開花過(guò)程中也扮演著重要角色，其對(duì)開花的調(diào)控作用因植物種類和開花條件而異。對(duì)于二年生植物，需要一定日數(shù)的低溫處理（即春化）才能開花，否則表現(xiàn)出蓮座狀生長(zhǎng)而不能抽薹開花。若對(duì)這些未經(jīng)春化的植物施用赤霉素，則不經(jīng)低溫過(guò)程也能誘導(dǎo)開花，且效果很明顯。例如，天仙子是一種二年生植物，正常情況下需要經(jīng)過(guò)低溫春化才能開花。但當(dāng)對(duì)未經(jīng)過(guò)春化處理的天仙子植株施用赤霉素后，植株能夠在沒(méi)有低溫條件的情況下順利抽薹開花，這說(shuō)明赤霉素可以替代低溫春化作用，促進(jìn)二年生植物的開花。對(duì)于許多長(zhǎng)日照植物，赤霉素處理后可以在絕對(duì)不適于發(fā)育的短日照下開花。這些植物包括側(cè)金盞花屬、還陽(yáng)參屬、天仙子屬、山高芭屬、稻搓菜屬、矮牽牛屬、蘿卜屬、金花菊屬、水茵草屬、麥瓶草屬以及菠菜屬等。赤霉素促進(jìn)長(zhǎng)日照植物開花的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的成花素基因表達(dá)有關(guān)。成花素是一種在植物開花調(diào)控中起關(guān)鍵作用的蛋白，赤霉素可能通過(guò)影響成花素基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程，促進(jìn)成花素的合成和運(yùn)輸，從而誘導(dǎo)植物開花。在非洲菊的生長(zhǎng)過(guò)程中，赤霉素同樣發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。赤霉素能夠調(diào)控非洲菊的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，使植株更加挺拔，增強(qiáng)其觀賞價(jià)值。在非洲菊的莖伸長(zhǎng)階段，赤霉素可能通過(guò)與上述類似的機(jī)制，促進(jìn)莖細(xì)胞的伸長(zhǎng)，從而使花葶更加粗壯、挺拔，支撐起碩大的花朵。在開花方面，赤霉素影響非洲菊的開花進(jìn)程，包括開花時(shí)間的早晚、花器官的發(fā)育等。適當(dāng)濃度的赤霉素處理可能會(huì)提前非洲菊的開花時(shí)間，使花朵更早地開放，滿足市場(chǎng)對(duì)不同花期花卉的需求。同時(shí)，赤霉素對(duì)花器官的發(fā)育也有重要影響，它可能參與調(diào)控花瓣的伸展、花朵的大小等。研究發(fā)現(xiàn)，在非洲菊開花過(guò)程中，花瓣細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂受到赤霉素的調(diào)控，適量的赤霉素能夠促進(jìn)花瓣細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂，使花瓣更加舒展，花朵更加碩大，提高非洲菊的觀賞品質(zhì)。2.3轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）是指利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，全面快速地獲取某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息。其原理基于新一代測(cè)序技術(shù)，通過(guò)將細(xì)胞內(nèi)的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，然后在測(cè)序平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，從而獲得大量的短讀長(zhǎng)序列，這些序列可以用于基因表達(dá)水平的定量分析、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的解析以及新基因的發(fā)現(xiàn)等。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的流程通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟。首先是樣本的采集與RNA提取，需要根據(jù)研究目的選取合適的植物組織或器官作為樣本，例如本研究中的非洲菊舌狀花。在采集樣本時(shí)，要確保樣本的新鮮度和完整性，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。然后利用RNA提取試劑盒等方法從樣本中提取總RNA，提取過(guò)程中需要注意去除DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，以獲得高質(zhì)量的RNA。接著是文庫(kù)構(gòu)建，對(duì)于真核生物，一般利用磁珠富集帶有poly(A)尾的mRNA，因?yàn)楦叩壬锏膍RNA通常具有poly(A)尾結(jié)構(gòu)，這一特性使得我們可以通過(guò)帶有poly(T)探針的磁珠與總RNA進(jìn)行雜交，從而特異性地富集mRNA。富集后的mRNA會(huì)被隨機(jī)打斷成小段，然后以這些小段為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈和第二條cDNA鏈，再對(duì)cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，最后通過(guò)PCR富集得到cDNA文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，需要對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格檢測(cè)，包括使用Qubit進(jìn)行初步定量，利用Agilent2100對(duì)文庫(kù)的插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)，確保insertsize符合預(yù)期，以及采用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，只有文庫(kù)有效濃度＞2nM時(shí)才可進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。上機(jī)測(cè)序一般采用Illumina等高通量測(cè)序平臺(tái)，通過(guò)邊合成邊測(cè)序的技術(shù)，獲得大量的測(cè)序數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)以FASTQ文件格式存儲(chǔ)。數(shù)據(jù)分析是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其分析方法主要包括以下幾個(gè)方面。數(shù)據(jù)預(yù)處理是第一步，目的是對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除低質(zhì)量的reads、含有接頭序列的reads以及N含量過(guò)高的reads等，以提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性。經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)，對(duì)于有參考基因組的物種，可以將reads比對(duì)到參考基因組上，通過(guò)計(jì)算比對(duì)到每個(gè)基因上的reads數(shù)量，再結(jié)合基因長(zhǎng)度和測(cè)序深度等因素，使用RPKM（ReadsPerKilobaseperMillionmappedreads）或FPKM（FragmentsPerKilobaseperMillionmappedreads）等方法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行歸一化計(jì)算，從而得到每個(gè)基因的表達(dá)水平。對(duì)于無(wú)參考基因組的物種，則需要進(jìn)行denovo拼接，將預(yù)處理后的reads拼接成轉(zhuǎn)錄本，常用的算法如deBruijngraphpath算法等，拼接得到的轉(zhuǎn)錄本再進(jìn)行功能注釋，通過(guò)與公共數(shù)據(jù)庫(kù)如NCBI、GO（GeneOntology）、KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）等進(jìn)行比對(duì)，獲得基因的功能信息、參與的生物過(guò)程以及代謝通路等。此外，還可以進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，通過(guò)比較不同樣本之間基因表達(dá)水平的差異，篩選出差異表達(dá)基因，一般采用Fold-change（FC）和FDR（FalseDiscoveryRate）等方法進(jìn)行篩選，F(xiàn)C用于衡量基因表達(dá)差異的倍數(shù)，F(xiàn)DR用于控制假陽(yáng)性率。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類和KEGG代謝通路分析，能夠進(jìn)一步明確這些基因在生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成等方面的作用，以及參與的代謝途徑，從而深入了解基因的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在解析植物基因表達(dá)和信號(hào)通路方面有著眾多應(yīng)用實(shí)例。在植物激素信號(hào)通路研究中，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)揮了重要作用。例如，在對(duì)擬南芥生長(zhǎng)素信號(hào)通路的研究中，通過(guò)對(duì)野生型和生長(zhǎng)素信號(hào)突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了大量受生長(zhǎng)素調(diào)控的差異表達(dá)基因。進(jìn)一步分析這些基因的功能和參與的代謝通路，揭示了生長(zhǎng)素通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)影響植物細(xì)胞伸長(zhǎng)、分裂和分化的分子機(jī)制。在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的研究中，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)也為我們深入了解植物的抗逆機(jī)制提供了有力支持。以水稻為例，當(dāng)水稻受到干旱脅迫時(shí)，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)了一系列與干旱響應(yīng)相關(guān)的基因。這些基因參與了滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)過(guò)程，通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)，水稻能夠增強(qiáng)自身的抗旱能力。在植物生長(zhǎng)發(fā)育研究方面，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)同樣取得了顯著成果。在對(duì)番茄果實(shí)發(fā)育過(guò)程的研究中，通過(guò)對(duì)不同發(fā)育階段的番茄果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，繪制了果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)圖譜。分析發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)發(fā)育的不同階段，有不同的基因模塊參與調(diào)控，包括細(xì)胞壁代謝、色素合成、糖分積累等過(guò)程，這些研究結(jié)果為深入了解番茄果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)制提供了全面的數(shù)據(jù)支持。三、非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料的選擇和處理對(duì)于轉(zhuǎn)錄組分析的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。在本研究中，我們精心選取了合適的非洲菊品種，并對(duì)舌狀花的采樣時(shí)期和部位進(jìn)行了嚴(yán)格把控，同時(shí)采用了科學(xué)的材料處理和保存方法，以確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。在品種選擇方面，我們選用了市場(chǎng)上廣泛種植且具有代表性的非洲菊品種“熱帶草原”。該品種具有花朵碩大、花色鮮艷、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)等特點(diǎn)，是非洲菊切花生產(chǎn)中的主要品種之一，其在赤霉素調(diào)控下的生長(zhǎng)特性也備受關(guān)注。通過(guò)選擇這一品種，能夠更好地反映非洲菊在一般栽培條件下的生長(zhǎng)規(guī)律，為研究赤霉素調(diào)控機(jī)制提供具有普遍性的參考。對(duì)于舌狀花的采樣時(shí)期，我們綜合考慮了非洲菊的生長(zhǎng)發(fā)育階段和赤霉素的作用時(shí)期。在非洲菊的生長(zhǎng)過(guò)程中，舌狀花的發(fā)育經(jīng)歷了多個(gè)階段，從花蕾期到盛花期，其形態(tài)和生理特征都發(fā)生著顯著變化。我們分別在花蕾期（舌狀花尚未完全展開，長(zhǎng)度約為盛花期的1/3-1/2）、初花期（舌狀花開始展開，花瓣顏色逐漸顯現(xiàn)，但未完全舒展）和盛花期（舌狀花完全展開，花朵呈現(xiàn)出最佳觀賞狀態(tài)）三個(gè)時(shí)期進(jìn)行采樣。在花蕾期，赤霉素可能主要參與調(diào)控舌狀花的細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，為后續(xù)的生長(zhǎng)發(fā)育奠定基礎(chǔ)；初花期是舌狀花快速生長(zhǎng)和形態(tài)建成的關(guān)鍵時(shí)期，赤霉素的作用可能更為顯著；盛花期則是舌狀花生理功能最為活躍的時(shí)期，研究此時(shí)的基因表達(dá)變化有助于了解赤霉素在維持舌狀花正常生理功能中的作用。每個(gè)時(shí)期選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的植株，每株選取3-5個(gè)頭狀花序，以保證樣本的代表性。在采樣部位上，我們僅采集舌狀花，避免其他組織如管狀花、苞片等的干擾。舌狀花是非洲菊頭狀花序中最具觀賞價(jià)值的部分，其生長(zhǎng)發(fā)育受到赤霉素的直接調(diào)控，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析能夠更精準(zhǔn)地揭示赤霉素調(diào)控舌狀花生長(zhǎng)的分子機(jī)制。在采集舌狀花時(shí)，使用鋒利的剪刀，從花柄基部小心剪下，盡量減少對(duì)花朵的損傷。采集后的舌狀花樣本需立即進(jìn)行處理和保存，以防止RNA的降解。我們將采集的舌狀花迅速放入液氮中速凍，使細(xì)胞內(nèi)的水分迅速結(jié)晶，形成微小的冰晶，從而避免冰晶對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和RNA的破壞。液氮速凍后的樣本轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，-80℃的低溫環(huán)境能夠有效抑制RNA酶的活性，減少RNA的降解，保證樣本的穩(wěn)定性。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，從-80℃冰箱取出樣本時(shí)，需在冰上進(jìn)行操作，避免樣本溫度的劇烈變化對(duì)RNA質(zhì)量產(chǎn)生影響。同時(shí)，為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，每個(gè)時(shí)期的樣本均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含來(lái)自不同植株的舌狀花樣本。3.2RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA提取是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)，其質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本研究采用Trizol法進(jìn)行非洲菊舌狀花總RNA的提取，該方法基于異硫氰酸胍-苯酚原理，能夠有效裂解細(xì)胞，使核蛋白復(fù)合體中的蛋白變性，并通過(guò)特定pH條件下DNA和RNA溶解度的差異實(shí)現(xiàn)兩者的分離，從而獲得純度較高的RNA。在提取過(guò)程中，嚴(yán)格遵循操作規(guī)范，以避免RNA酶的污染。首先，將從-80℃冰箱取出的舌狀花樣本迅速置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮充分研磨，使組織細(xì)胞完全破碎，在研磨過(guò)程中，不斷添加液氮，以保持樣本的低溫狀態(tài)，防止RNA降解。研磨成粉末狀后，將樣本轉(zhuǎn)移至含有Trizol試劑的離心管中，充分振蕩混勻，使細(xì)胞裂解液與樣本充分接觸，室溫靜置5分鐘，以確保細(xì)胞充分裂解。隨后，加入氯仿，劇烈振蕩15秒，使溶液充分乳化，室溫靜置2-3分鐘，以促進(jìn)相分離。在4℃條件下，12000g離心15分鐘，此時(shí)混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層以及無(wú)色水相上層，RNA全部被分配于水相中。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。4℃、12000g離心10分鐘，RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。小心吸去上清液，加入用DEPC水配制的75%乙醇（提前預(yù)冷），充分洗滌管蓋和管壁，并輕彈管底，讓沉淀懸浮起來(lái)，以去除雜質(zhì)。4℃、7500g離心5分鐘，去上清，盡量吸盡乙醇，將離心管放置在超凈工作臺(tái)中敞口干燥5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)。最后，加入適量的DEPC水，吹打混勻，使RNA充分溶解，將提取的RNA樣本保存于-80℃冰箱中備用。提取后的RNA需要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，以確保其滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的要求。首先采用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260nm和280nm處的光吸收值，通過(guò)計(jì)算OD260/OD280比值來(lái)評(píng)估RNA的純度。一般認(rèn)為，純RNA樣品的OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，若比值低于1.8，表明存在蛋白質(zhì)污染；若比值高于2.0，可能存在RNA降解。同時(shí)，根據(jù)A260下讀值為1表示40μgRNA/ml，通過(guò)公式“樣品RNA濃度(μg/ml)=A260×稀釋倍數(shù)×40μg/ml”計(jì)算RNA濃度，確保其濃度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。此外，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，觀察28S和18SrRNA條帶的亮度和清晰度。一般來(lái)說(shuō)，如果28S和18SrRNA條帶明亮、邊緣清晰，并且28SrRNA的亮度約為18SrRNA的1.5-2.5倍，則表明RNA的質(zhì)量較好；若條帶彌散或亮度比值異常，說(shuō)明RNA可能存在降解。只有通過(guò)質(zhì)量檢測(cè)，純度、濃度和完整性均符合要求的RNA樣本才能用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序采用IlluminaHiSeq平臺(tái)，該平臺(tái)具有高通量、高準(zhǔn)確性和成本相對(duì)較低的優(yōu)勢(shì)，能夠滿足對(duì)非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面分析的需求。測(cè)序策略為雙端測(cè)序（Paired-EndSequencing），即從DNA片段的兩端進(jìn)行測(cè)序，這樣可以獲得更多的序列信息，有利于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和基因注釋。測(cè)序流程如下：首先，利用帶有poly(T)探針的磁珠與提取的總RNA進(jìn)行雜交，特異性地富集帶有poly(A)尾的mRNA，因?yàn)楦叩壬锏膍RNA通常具有poly(A)尾結(jié)構(gòu)。將富集后的mRNA隨機(jī)打斷成小段，以這些小段為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈和第二條cDNA鏈。對(duì)cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，使其兩端平齊，然后在3'端加上A尾，以便與測(cè)序接頭連接。連接測(cè)序接頭后，通過(guò)PCR富集得到cDNA文庫(kù)，在PCR過(guò)程中，需要優(yōu)化反應(yīng)條件，以確保文庫(kù)的質(zhì)量和代表性。文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Qubit進(jìn)行初步定量，利用Agilent2100對(duì)文庫(kù)的插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)，確保insertsize符合預(yù)期，一般為200-500bp左右。采用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，只有文庫(kù)有效濃度＞2nM時(shí)才可進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。上機(jī)測(cè)序時(shí)，將文庫(kù)加載到測(cè)序芯片上，通過(guò)邊合成邊測(cè)序的技術(shù)，在測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序，最終獲得大量的原始測(cè)序數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)以FASTQ文件格式存儲(chǔ)，每個(gè)文件包含測(cè)序序列（Read）及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量值信息。3.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理與分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序完成后，獲得的原始數(shù)據(jù)需經(jīng)過(guò)一系列嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理與分析流程，以確保數(shù)據(jù)的質(zhì)量和準(zhǔn)確性，從而深入挖掘其中蘊(yùn)含的生物學(xué)信息，揭示赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的分子機(jī)制。數(shù)據(jù)過(guò)濾是數(shù)據(jù)處理的首要步驟，其目的是去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)和污染數(shù)據(jù)，提高數(shù)據(jù)的可靠性。原始測(cè)序數(shù)據(jù)中往往包含一些低質(zhì)量的reads，這些reads可能存在堿基錯(cuò)誤、測(cè)序質(zhì)量值低等問(wèn)題，會(huì)影響后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。我們使用Fastp軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，具體過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)如下：首先，去除含有接頭序列的reads，接頭序列是在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中引入的，若不去除會(huì)干擾數(shù)據(jù)分析。其次，去除N含量超過(guò)10%的reads，N表示無(wú)法確定的堿基，N含量過(guò)高的reads會(huì)影響序列比對(duì)和分析結(jié)果。最后，去除質(zhì)量值低于20的堿基占比超過(guò)50%的reads，質(zhì)量值反映了堿基測(cè)序的準(zhǔn)確性，質(zhì)量值過(guò)低的reads包含的有效信息較少。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾，得到高質(zhì)量的cleanreads，這些cleanreads用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。對(duì)于有參考基因組的物種，將cleanreads比對(duì)到參考基因組上是進(jìn)行基因表達(dá)分析的關(guān)鍵步驟。我們使用Hisat2軟件進(jìn)行比對(duì)，Hisat2是一款高效的比對(duì)工具，能夠快速準(zhǔn)確地將reads映射到參考基因組上。在比對(duì)過(guò)程中，Hisat2會(huì)根據(jù)reads的序列特征，尋找其在參考基因組上的最佳匹配位置，生成比對(duì)結(jié)果文件，文件格式通常為SAM（SequenceAlignment/Map）或BAM（BinaryAlignment/Map）。通過(guò)計(jì)算比對(duì)到每個(gè)基因上的reads數(shù)量，我們可以初步了解基因的表達(dá)情況。然而，由于不同基因的長(zhǎng)度不同，以及測(cè)序深度的差異，單純的reads數(shù)量并不能直接反映基因的表達(dá)水平。為了消除這些因素的影響，我們使用RSEM（RNA-SeqbyExpectation-Maximization）軟件對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行歸一化計(jì)算，得到每個(gè)基因的FPKM值。FPKM值考慮了基因長(zhǎng)度和測(cè)序深度的因素，能夠更準(zhǔn)確地反映基因的表達(dá)水平，其計(jì)算公式為：FPKM=\frac{10^9\timesC}{N\timesL}其中，C表示比對(duì)到該基因的reads數(shù)，N表示比對(duì)到所有基因的總reads數(shù)，L表示基因的長(zhǎng)度（以bp為單位）。通過(guò)計(jì)算FPKM值，我們可以對(duì)不同樣本中基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較，篩選出表達(dá)差異顯著的基因。差異表達(dá)分析是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的核心內(nèi)容之一，其目的是篩選出在不同樣本之間表達(dá)水平存在顯著差異的基因，這些差異表達(dá)基因可能與赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的過(guò)程密切相關(guān)。我們使用DESeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，DESeq2是一款基于負(fù)二項(xiàng)分布模型的R包，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別差異表達(dá)基因，并控制假陽(yáng)性率。在分析過(guò)程中，我們以花蕾期樣本作為對(duì)照，分別與初花期和盛花期樣本進(jìn)行比較。首先，DESeq2會(huì)對(duì)原始的count數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除不同樣本之間測(cè)序深度的差異。然后，通過(guò)構(gòu)建負(fù)二項(xiàng)分布模型，對(duì)基因在不同樣本中的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，計(jì)算每個(gè)基因的差異倍數(shù)（Fold-change，F(xiàn)C）和P值。為了控制假陽(yáng)性率，我們使用Benjamini-Hochberg方法對(duì)P值進(jìn)行校正，得到調(diào)整后的P值，即FDR（FalseDiscoveryRate）。通常，我們?cè)O(shè)定FC≥2且FDR＜0.05作為篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)，滿足這一標(biāo)準(zhǔn)的基因被認(rèn)為是在兩個(gè)樣本之間表達(dá)差異顯著的基因。在篩選出差異表達(dá)基因后，對(duì)其進(jìn)行功能注釋和代謝通路分析，能夠深入了解這些基因在非洲菊舌狀花生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能以及參與的代謝途徑。我們首先將差異表達(dá)基因與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲取基因的功能注釋信息。常用的數(shù)據(jù)庫(kù)包括NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的NR（Non-RedundantProteinDatabase）數(shù)據(jù)庫(kù)、GO（GeneOntology）數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）軟件將差異表達(dá)基因的序列與NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲取基因的同源蛋白信息，從而推斷其功能。將基因映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行GO功能分類，GO數(shù)據(jù)庫(kù)從生物過(guò)程（BiologicalProcess）、分子功能（MolecularFunction）和細(xì)胞組成（CellularComponent）三個(gè)層面描述基因的功能。在生物過(guò)程方面，可能涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝調(diào)節(jié)等過(guò)程；分子功能層面，可能包括酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、信號(hào)傳導(dǎo)等功能；細(xì)胞組成層面，則涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器等方面。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路分析，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息，能夠展示基因參與的各種代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。例如，在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，可能涉及一系列與赤霉素合成、感知、信號(hào)傳遞相關(guān)的基因，通過(guò)KEGG分析可以明確這些基因在通路中的位置和作用。通過(guò)功能注釋和代謝通路分析，我們可以初步揭示赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的分子機(jī)制，為后續(xù)的研究提供重要的線索。四、非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組中赤霉素相關(guān)基因挖掘4.1赤霉素代謝相關(guān)基因赤霉素的代謝過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及多種酶催化的合成和分解反應(yīng)，這些反應(yīng)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組中，我們成功識(shí)別出一系列參與赤霉素合成和分解代謝的關(guān)鍵基因，這些基因的表達(dá)模式和調(diào)控機(jī)制對(duì)于深入理解赤霉素在非洲菊生長(zhǎng)過(guò)程中的作用具有重要意義。赤霉素的生物合成是一個(gè)多步驟的過(guò)程，從最初的前體物質(zhì)到最終具有生物活性的赤霉素，涉及多個(gè)酶促反應(yīng)。在植物中，赤霉素的生物合成主要通過(guò)甲羥戊酸途徑（Mevalonatepathway）進(jìn)行。首先，乙酰輔酶A在一系列酶的作用下，逐步合成異戊烯基焦磷酸（IPP）及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），這兩種物質(zhì)是萜類化合物合成的基本單元。IPP和DMAPP通過(guò)一系列縮合反應(yīng)，形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP），GGPP是赤霉素生物合成的直接前體。從GGPP開始，赤霉素的合成主要分為三個(gè)階段，分別由不同的酶催化。在第一階段，GGPP在古巴焦磷酸合成酶（CPS）和內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（KS）的作用下，環(huán)化形成內(nèi)根-貝殼杉烯，這是赤霉素合成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟，決定了赤霉素的基本骨架結(jié)構(gòu)。在非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組中，我們鑒定出了編碼CPS和KS的基因，分別命名為GjCPS和GjKS。對(duì)這兩個(gè)基因在不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)分析表明，它們?cè)诨ɡ倨诤统趸ㄆ诘谋磉_(dá)量較高，隨著舌狀花的發(fā)育，到盛花期表達(dá)量有所下降。這表明在舌狀花生長(zhǎng)發(fā)育的早期階段，需要大量合成內(nèi)根-貝殼杉烯，為后續(xù)赤霉素的合成提供充足的底物，以滿足細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)對(duì)赤霉素的需求。例如，在花蕾期，細(xì)胞分裂活動(dòng)旺盛，需要赤霉素來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分裂，此時(shí)GjCPS和GjKS基因的高表達(dá)有助于合成更多的內(nèi)根-貝殼杉烯，進(jìn)而合成更多的赤霉素，推動(dòng)舌狀花的生長(zhǎng)發(fā)育。第二階段，內(nèi)根-貝殼杉烯在內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶（KO）和內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶（KAO）的作用下，經(jīng)過(guò)一系列氧化反應(yīng)，逐步轉(zhuǎn)化為GA12-醛。在非洲菊舌狀花中，我們檢測(cè)到了編碼KO和KAO的基因GjKO和GjKAO。這兩個(gè)基因的表達(dá)模式與GjCPS和GjKS有所不同，GjKO在初花期表達(dá)量最高，而GjKAO在盛花期表達(dá)量相對(duì)較高。這說(shuō)明在舌狀花生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，赤霉素合成的重點(diǎn)有所變化。在初花期，隨著細(xì)胞分裂逐漸減緩，細(xì)胞伸長(zhǎng)成為主要的生長(zhǎng)方式，此時(shí)GjKO的高表達(dá)使得內(nèi)根-貝殼杉烯能夠快速轉(zhuǎn)化為內(nèi)根-貝殼杉烯酸，為后續(xù)的氧化反應(yīng)提供底物，促進(jìn)赤霉素的合成，以滿足細(xì)胞伸長(zhǎng)對(duì)赤霉素的需求。而在盛花期，GjKAO的高表達(dá)則有助于將內(nèi)根-貝殼杉烯酸進(jìn)一步氧化為GA12-醛，維持赤霉素的合成，保證舌狀花的正常生理功能。第三階段，GA12-醛在GA20-氧化酶（GA20ox）、GA3-氧化酶（GA3ox）等多種氧化酶的作用下，經(jīng)過(guò)一系列羥基化反應(yīng)，最終形成具有生物活性的赤霉素，如GA1、GA3、GA4等。在非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組中，我們識(shí)別出多個(gè)編碼GA20ox和GA3ox的基因，分別為GjGA20ox1、GjGA20ox2、GjGA3ox1、GjGA3ox2等。這些基因在不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)呈現(xiàn)出復(fù)雜的模式。其中，GjGA20ox1在花蕾期和初花期表達(dá)量較高，而GjGA20ox2在盛花期表達(dá)量相對(duì)較高；GjGA3ox1在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)較為穩(wěn)定，GjGA3ox2則在初花期和盛花期表達(dá)量有所增加。這種基因表達(dá)的差異可能與不同生長(zhǎng)階段對(duì)活性赤霉素種類和含量的需求有關(guān)。例如，在花蕾期和初花期，GjGA20ox1的高表達(dá)可能有助于將GA12-醛快速轉(zhuǎn)化為GA53等中間產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)GjGA3ox1的作用，合成具有活性的GA1等赤霉素，促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和器官發(fā)育。而在盛花期，GjGA20ox2和GjGA3ox2的表達(dá)增加，可能是為了維持盛花期舌狀花對(duì)赤霉素的需求，保證花朵的正常開放和維持良好的觀賞狀態(tài)。赤霉素的分解代謝同樣是一個(gè)重要的調(diào)控環(huán)節(jié)，通過(guò)調(diào)節(jié)赤霉素的分解速度，維持植物體內(nèi)赤霉素的動(dòng)態(tài)平衡。在植物中，赤霉素的分解主要通過(guò)2-氧化途徑進(jìn)行，該途徑由GA2-氧化酶（GA2ox）催化。GA2ox能夠?qū)⒕哂猩锘钚缘某嗝顾匾约安糠种虚g產(chǎn)物氧化為無(wú)活性的代謝產(chǎn)物，從而降低植物體內(nèi)赤霉素的含量。在非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組中，我們鑒定出多個(gè)編碼GA2ox的基因，如GjGA2ox1、GjGA2ox2、GjGA2ox3等。對(duì)這些基因表達(dá)模式的分析發(fā)現(xiàn)，GjGA2ox1在盛花期表達(dá)量顯著升高，而GjGA2ox2和GjGA2ox3在花蕾期和初花期表達(dá)量相對(duì)較低。這表明在盛花期，隨著舌狀花生長(zhǎng)發(fā)育逐漸完成，為了避免赤霉素過(guò)量積累對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，GjGA2ox1的表達(dá)上調(diào)，加速赤霉素的分解代謝，使植物體內(nèi)赤霉素含量維持在一個(gè)合適的水平。例如，在盛花期，舌狀花的細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂基本停止，此時(shí)過(guò)多的赤霉素可能會(huì)導(dǎo)致花朵過(guò)度生長(zhǎng)、早衰等問(wèn)題，GjGA2ox1的高表達(dá)能夠及時(shí)分解多余的赤霉素，保證舌狀花的正常生理功能和觀賞壽命。赤霉素代謝相關(guān)基因的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控，包括植物自身的發(fā)育階段、環(huán)境因素以及其他植物激素等。在非洲菊舌狀花的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，隨著花蕾期到盛花期的轉(zhuǎn)變，赤霉素代謝相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化，這表明植物自身的發(fā)育進(jìn)程對(duì)赤霉素代謝基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用。例如，在花蕾期，細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)活動(dòng)旺盛，需要大量的赤霉素來(lái)調(diào)控這些生理過(guò)程，因此赤霉素合成相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)；而在盛花期，生長(zhǎng)發(fā)育逐漸穩(wěn)定，對(duì)赤霉素的需求相對(duì)減少，分解代謝相關(guān)基因的表達(dá)則相應(yīng)增加。環(huán)境因素如光照、溫度等也會(huì)影響赤霉素代謝基因的表達(dá)。研究表明，光照時(shí)間和強(qiáng)度的變化能夠影響植物體內(nèi)赤霉素的合成和代謝。在充足的光照條件下，非洲菊舌狀花中赤霉素合成相關(guān)基因的表達(dá)可能會(huì)增強(qiáng)，從而促進(jìn)赤霉素的合成，有利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育。溫度對(duì)赤霉素代謝基因的表達(dá)也有顯著影響，適宜的溫度能夠促進(jìn)赤霉素代謝相關(guān)酶的活性，進(jìn)而影響基因的表達(dá)和赤霉素的合成與分解。此外，其他植物激素如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、脫落酸等與赤霉素之間存在復(fù)雜的相互作用，它們可以通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響赤霉素代謝基因的表達(dá)。例如，生長(zhǎng)素可以通過(guò)與赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子相互作用，調(diào)節(jié)赤霉素合成和分解相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。4.2赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因在明確赤霉素代謝相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步聚焦于赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的研究。赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，涉及多個(gè)關(guān)鍵基因和蛋白的參與，它們之間相互作用，形成了一個(gè)緊密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)植物對(duì)赤霉素信號(hào)的響應(yīng)，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始依賴于受體對(duì)赤霉素的識(shí)別和結(jié)合。在植物中，赤霉素受體為GIBBERELLININSENSITIVEDWARF1（GID1）蛋白，它是一種可溶性的、具有激素結(jié)合口袋的受體。在非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組中，我們成功鑒定出編碼GID1的基因，命名為GjGID1。GjGID1基因編碼的蛋白具有典型的GID1結(jié)構(gòu)特征，包含一個(gè)保守的激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合赤霉素分子，從而啟動(dòng)赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。通過(guò)對(duì)GjGID1基因在不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平在花蕾期相對(duì)較低，隨著舌狀花的發(fā)育，到初花期和盛花期表達(dá)量逐漸升高。這表明在舌狀花生長(zhǎng)發(fā)育的后期階段，對(duì)赤霉素信號(hào)的感知更為敏感，需要更多的GjGID1蛋白來(lái)識(shí)別和結(jié)合赤霉素，以調(diào)節(jié)后續(xù)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。例如，在盛花期，花朵的開放和維持需要精確的調(diào)控，GjGID1基因表達(dá)量的升高，使得植物能夠更有效地感知赤霉素信號(hào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，維持花朵的正常形態(tài)和生理功能。當(dāng)GjGID1與赤霉素結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列的分子事件，其中關(guān)鍵的一步是與DELLA蛋白的相互作用。DELLA蛋白是赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵抑制因子，屬于GRAS（GAI、RGA和SCR）家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著負(fù)調(diào)控作用。在非洲菊舌狀花中，我們鑒定出多個(gè)DELLA蛋白編碼基因，如GjRGA1、GjRGA2等。這些基因編碼的蛋白具有DELLA蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征，包含N端的DELLA結(jié)構(gòu)域和TVHYNP基序，以及C端的GRAS結(jié)構(gòu)域。在沒(méi)有赤霉素存在的情況下，DELLA蛋白在細(xì)胞核內(nèi)積累，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子等相互作用，抑制下游基因的表達(dá)，從而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育。而當(dāng)赤霉素與GjGID1結(jié)合后，形成的GA-GID1復(fù)合物能夠與DELLA蛋白特異性結(jié)合，改變DELLA蛋白的構(gòu)象，使其更容易被SCF（Skp1-Cullin-F-box）泛素連接酶復(fù)合體識(shí)別。在非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組中，我們也檢測(cè)到了編碼SCF復(fù)合體相關(guān)蛋白的基因，如GjSkp1、GjCullin和GjF-box等。SCF復(fù)合體中的F-box蛋白能夠特異性地識(shí)別GA-GID1-DELLA復(fù)合物，將DELLA蛋白泛素化，進(jìn)而被26S蛋白酶體降解。DELLA蛋白的降解解除了對(duì)下游基因的抑制作用，從而啟動(dòng)一系列基因的表達(dá)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)GjRGA1、GjRGA2等DELLA蛋白編碼基因在不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)分析顯示，它們的表達(dá)模式與赤霉素代謝相關(guān)基因以及GjGID1基因的表達(dá)模式呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。在花蕾期，GjRGA1和GjRGA2的表達(dá)量相對(duì)較高，此時(shí)赤霉素合成相關(guān)基因的表達(dá)也處于較高水平，但由于DELLA蛋白的抑制作用，赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到一定程度的抑制，植物生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。隨著舌狀花的發(fā)育，到初花期和盛花期，赤霉素含量增加，GjGID1基因表達(dá)量升高，與赤霉素結(jié)合后促進(jìn)DELLA蛋白的降解，此時(shí)GjRGA1和GjRGA2的表達(dá)量逐漸降低，赤霉素信號(hào)得以順利轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)舌狀花的生長(zhǎng)和開放。例如，在初花期，隨著赤霉素的作用，GjRGA1和GjRGA2蛋白逐漸被降解，解除了對(duì)細(xì)胞伸長(zhǎng)相關(guān)基因的抑制，使得舌狀花細(xì)胞能夠快速伸長(zhǎng)，花瓣逐漸展開。除了GID1、DELLA蛋白和SCF復(fù)合體相關(guān)基因外，赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中還涉及其他一些重要的基因和蛋白，它們共同參與調(diào)控赤霉素信號(hào)的傳遞和響應(yīng)。例如，一些轉(zhuǎn)錄因子在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們能夠與DELLA蛋白相互作用，或者直接響應(yīng)赤霉素信號(hào)，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。在非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組中，我們也發(fā)現(xiàn)了一些可能參與赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子基因，如GjMYB1、GjbHLH1等。這些轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)在不同生長(zhǎng)階段也發(fā)生著變化，與赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的其他基因協(xié)同作用。GjMYB1基因在盛花期表達(dá)量顯著升高，可能參與調(diào)控與花朵開放和維持相關(guān)基因的表達(dá)，通過(guò)與DELLA蛋白或其他信號(hào)分子相互作用，響應(yīng)赤霉素信號(hào)，促進(jìn)舌狀花的正常發(fā)育。4.3基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了進(jìn)一步驗(yàn)證在非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組分析中篩選出的與赤霉素調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵基因的功能，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，主要采用qRT-PCR技術(shù)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，從不同層面深入探究這些基因在赤霉素調(diào)控非洲菊生長(zhǎng)過(guò)程中的作用機(jī)制。qRT-PCR（QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReaction）技術(shù)，即實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。在本研究中，我們利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選出的赤霉素代謝相關(guān)基因（如GjCPS、GjKS、GjGA20ox1、GjGA3ox1等）以及赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因（如GjGID1、GjRGA1等）進(jìn)行驗(yàn)證，以確定這些基因在不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)變化是否與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。首先，根據(jù)篩選出的關(guān)鍵基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，遵循以下原則：引物長(zhǎng)度一般為18-25bp，引物的GC含量控制在40%-60%之間，以保證引物的穩(wěn)定性和特異性。引物的Tm值（解鏈溫度）在55-65℃之間，上下游引物的Tm值相差不超過(guò)5℃，避免因Tm值差異過(guò)大導(dǎo)致引物退火溫度不一致，影響擴(kuò)增效率。同時(shí)，要確保引物與其他基因序列無(wú)明顯同源性，避免非特異性擴(kuò)增。設(shè)計(jì)好的引物通過(guò)NCBI的BLAST工具進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，確保其特異性。例如，對(duì)于GjGID1基因，設(shè)計(jì)的上游引物序列為5'-ATGGTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物序列為5'-TCAGCTGCTGCTGCTGCT-3'，經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)，該引物對(duì)僅能特異性地?cái)U(kuò)增GjGID1基因，與其他基因無(wú)明顯同源性。以非洲菊舌狀花不同生長(zhǎng)階段（花蕾期、初花期、盛花期）的總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，包括溫度、時(shí)間和試劑用量等，以確保反轉(zhuǎn)錄的效率和質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為qRT-PCR的模板。采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系一般包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。在反應(yīng)過(guò)程中，設(shè)置合適的擴(kuò)增程序，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，每個(gè)步驟的溫度和時(shí)間根據(jù)引物的特性和實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。預(yù)變性步驟通常在95℃下進(jìn)行3-5分鐘，使模板DNA完全變性；變性步驟在95℃下進(jìn)行15-30秒，使雙鏈DNA解鏈；退火步驟根據(jù)引物的Tm值在55-65℃之間進(jìn)行30-60秒，使引物與模板DNA特異性結(jié)合；延伸步驟在72℃下進(jìn)行30-60秒，使DNA聚合酶合成新的DNA鏈。在擴(kuò)增過(guò)程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，通過(guò)比較不同樣本中目的基因與內(nèi)參基因（如非洲菊的Actin基因）的Ct值（CycleThreshold，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。例如，如果花蕾期樣本中目的基因的Ct值為25，內(nèi)參基因Actin的Ct值為20；初花期樣本中目的基因的Ct值為23，內(nèi)參基因Actin的Ct值為20。首先計(jì)算ΔCt值，花蕾期ΔCt=25-20=5，初花期ΔCt=23-20=3。以花蕾期為對(duì)照，計(jì)算ΔΔCt值，ΔΔCt=3-5=-2。則目的基因在初花期相對(duì)于花蕾期的相對(duì)表達(dá)量為2^(-(-2))=4，即初花期目的基因的表達(dá)量是花蕾期的4倍。通過(guò)比較不同生長(zhǎng)階段目的基因的相對(duì)表達(dá)量，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中基因表達(dá)變化的準(zhǔn)確性。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，使其整合到植物基因組中并穩(wěn)定表達(dá)，從而研究基因功能的重要手段。在本研究中，我們構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體和RNA干擾載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化非洲菊，觀察轉(zhuǎn)基因植株的表型變化，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵基因在赤霉素調(diào)控非洲菊生長(zhǎng)過(guò)程中的功能。對(duì)于過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建，從非洲菊舌狀花cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出目的基因的完整編碼區(qū)序列。例如，對(duì)于GjGA3ox1基因，使用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包括cDNA模板、特異性引物、dNTPs、Buffer和高保真DNA聚合酶等。擴(kuò)增程序根據(jù)基因序列和引物特性進(jìn)行優(yōu)化，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸和終延伸等步驟。擴(kuò)增得到的目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收純化。將回收的目的基因片段與經(jīng)過(guò)相同限制性內(nèi)切酶酶切的表達(dá)載體（如pCAMBIA1300）連接，連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，在合適的溫度和時(shí)間條件下進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆中的重組質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保目的基因正確插入表達(dá)載體中。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)抗性篩選和PCR鑒定，獲得含有過(guò)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株。對(duì)于RNA干擾載體的構(gòu)建，根據(jù)目的基因序列，設(shè)計(jì)特異性的干擾片段。干擾片段一般長(zhǎng)度為200-400bp，通過(guò)在線軟件（如siDirect2.0等）進(jìn)行設(shè)計(jì)，并進(jìn)行BLAST比對(duì)，確保干擾片段的特異性。以非洲菊舌狀花cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出干擾片段。擴(kuò)增得到的干擾片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、回收純化后，與經(jīng)過(guò)合適限制性內(nèi)切酶酶切的RNA干擾載體（如pHANNIBAL）連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，獲得含有RNA干擾載體的農(nóng)桿菌菌株。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化非洲菊，以非洲菊無(wú)菌苗的葉片或愈傷組織為受體材料。將含有過(guò)表達(dá)載體或RNA干擾載體的農(nóng)桿菌菌株接種到含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在28℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)至OD???值為0.5-0.8。收集農(nóng)桿菌菌體，用含有乙酰丁香酮（AS）的MS液體培養(yǎng)基重懸，使農(nóng)桿菌濃度達(dá)到合適的水平。將非洲菊受體材料浸泡在農(nóng)桿菌菌液中10-15分鐘，期間輕輕搖晃，使農(nóng)桿菌與受體材料充分接觸。取出受體材料，用無(wú)菌濾紙吸干表面多余的菌液，轉(zhuǎn)移到含有AS的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在黑暗條件下25℃共培養(yǎng)2-3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將受體材料轉(zhuǎn)移到含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行篩選培養(yǎng)。在篩選培養(yǎng)過(guò)程中，定期更換培養(yǎng)基，去除未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和農(nóng)桿菌，促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。經(jīng)過(guò)數(shù)周的篩選培養(yǎng)，獲得抗性愈傷組織或再生植株。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定，采用PCR和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因的整合和表達(dá)情況。提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)目的基因是否整合到植物基因組中。同時(shí)，提取轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。與野生型植株相比，過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植株中目的基因的表達(dá)量顯著升高，而RNA干擾載體轉(zhuǎn)化的植株中目的基因的表達(dá)量顯著降低。觀察轉(zhuǎn)基因植株的表型變化，包括植株的生長(zhǎng)高度、葉片大小、開花時(shí)間、花器官形態(tài)等。對(duì)于過(guò)表達(dá)GjGA3ox1基因的植株，可能會(huì)出現(xiàn)植株生長(zhǎng)高度增加、葉片增大、開花時(shí)間提前等表型；而RNA干擾GjGA3ox1基因的植株可能會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、葉片變小、開花延遲等表型。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株表型的觀察和分析，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵基因在赤霉素調(diào)控非洲菊生長(zhǎng)過(guò)程中的功能。五、赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建5.1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)確定在赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中，準(zhǔn)確確定網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)是關(guān)鍵的第一步。我們以在非洲菊舌狀花轉(zhuǎn)錄組分析中鑒定出的赤霉素相關(guān)基因?yàn)榛A(chǔ)，這些基因涵蓋了赤霉素代謝相關(guān)基因以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因，它們?cè)诔嗝顾卣{(diào)控非洲菊生長(zhǎng)的過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，因此被確定為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)。赤霉素代謝相關(guān)基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位，它們參與赤霉素的合成與分解代謝過(guò)程，對(duì)植物體內(nèi)赤霉素的含量和活性起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。如前文所述，在赤霉素合成過(guò)程中，從最初的前體物質(zhì)到最終具有生物活性的赤霉素，涉及多個(gè)酶促反應(yīng)，相應(yīng)的編碼基因包括古巴焦磷酸合成酶（CPS）基因GjCPS、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（KS）基因GjKS、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶（KO）基因GjKO、內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶（KAO）基因GjKAO、GA20-氧化酶（GA20ox）基因GjGA20ox1、GjGA20ox2以及GA3-氧化酶（GA3ox）基因GjGA3ox1、GjGA3ox2等。這些基因在赤霉素合成的不同階段發(fā)揮作用，它們的表達(dá)變化直接影響赤霉素的合成速率和最終產(chǎn)量。在花蕾期，GjCPS和GjKS基因的高表達(dá)有助于合成更多的內(nèi)根-貝殼杉烯，為后續(xù)赤霉素的合成提供充足的底物，以滿足細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)對(duì)赤霉素的需求。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，這些基因作為節(jié)點(diǎn)，與其他相關(guān)基因相互作用，共同調(diào)節(jié)赤霉素的合成過(guò)程。例如，GjCPS基因的表達(dá)可能受到其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，這些轉(zhuǎn)錄因子作為網(wǎng)絡(luò)中的連接節(jié)點(diǎn)，將GjCPS基因與其他基因聯(lián)系起來(lái)，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。赤霉素分解代謝相關(guān)基因同樣在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中扮演著不可或缺的角色。GA2-氧化酶（GA2ox）基因GjGA2ox1、GjGA2ox2、GjGA2ox3等負(fù)責(zé)將具有生物活性的赤霉素以及部分中間產(chǎn)物氧化為無(wú)活性的代謝產(chǎn)物，從而降低植物體內(nèi)赤霉素的含量。在盛花期，GjGA2ox1基因表達(dá)量顯著升高，加速赤霉素的分解代謝，使植物體內(nèi)赤霉素含量維持在一個(gè)合適的水平。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，GjGA2ox1基因作為節(jié)點(diǎn)，與赤霉素合成相關(guān)基因以及其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因相互關(guān)聯(lián)。它可能受到赤霉素含量的反饋調(diào)控，當(dāng)植物體內(nèi)赤霉素含量過(guò)高時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)GjGA2ox1基因的表達(dá)，促進(jìn)赤霉素的分解，從而維持赤霉素的動(dòng)態(tài)平衡。同時(shí)，GjGA2ox1基因的表達(dá)也可能受到其他環(huán)境因素或植物激素的影響，通過(guò)與這些因素相關(guān)的基因建立聯(lián)系，進(jìn)一步豐富了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)，它們負(fù)責(zé)將赤霉素信號(hào)從受體傳遞到下游基因，引發(fā)一系列的生理反應(yīng)。赤霉素受體基因GjGID1編碼的GID1蛋白能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合赤霉素分子，啟動(dòng)赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。在非洲菊舌狀花的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，GjGID1基因的表達(dá)水平在花蕾期相對(duì)較低，隨著舌狀花的發(fā)育，到初花期和盛花期表達(dá)量逐漸升高。這表明在舌狀花生長(zhǎng)發(fā)育的后期階段，對(duì)赤霉素信號(hào)的感知更為敏感，需要更多的GjGID1蛋白來(lái)識(shí)別和結(jié)合赤霉素。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，GjGID1基因作為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，與赤霉素分子以及下游的DELLA蛋白編碼基因緊密相連。當(dāng)GjGID1與赤霉素結(jié)合后，會(huì)與DELLA蛋白相互作用，引發(fā)DELLA蛋白的降解，從而解除對(duì)下游基因的抑制作用。DELLA蛋白編碼基因如GjRGA1、GjRGA2等是赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵抑制因子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中也具有重要地位。在沒(méi)有赤霉素存在的情況下，DELLA蛋白在細(xì)胞核內(nèi)積累，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子等相互作用，抑制下游基因的表達(dá)，從而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育。而當(dāng)赤霉素與GjGID1結(jié)合后，形成的GA-GID1復(fù)合物能夠與DELLA蛋白特異性結(jié)合，導(dǎo)致DELLA蛋白被26S蛋白酶體降解，解除對(duì)下游基因的抑制，啟動(dòng)一系列基因的表達(dá)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，GjRGA1、GjRGA2等基因與GjGID1基因以及其他轉(zhuǎn)錄因子基因相互連接，形成復(fù)雜的調(diào)控回路。它們的表達(dá)受到赤霉素信號(hào)以及其他多種因素的調(diào)控，通過(guò)與這些因素相關(guān)的基因相互作用，精確地調(diào)節(jié)赤霉素信號(hào)的傳遞和響應(yīng)。除了上述核心基因外，我們還綜合考慮基因的表達(dá)水平、表達(dá)模式以及在不同生長(zhǎng)階段的變化情況，進(jìn)一步篩選出一些與赤霉素調(diào)控密切相關(guān)的基因作為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)。在非洲菊舌狀花的不同生長(zhǎng)階段，一些基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，且這些變化與赤霉素的作用時(shí)期和生理效應(yīng)密切相關(guān)。在花蕾期到初花期，隨著赤霉素合成的增加，一些參與細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂的基因表達(dá)上調(diào)，這些基因可能受到赤霉素信號(hào)的直接或間接調(diào)控，因此被納入信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)。同時(shí)，我們還參考了基因在相關(guān)生物學(xué)過(guò)程中的功能注釋信息，確保所選節(jié)點(diǎn)基因在赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的過(guò)程中具有明確的生物學(xué)功能。通過(guò)對(duì)基因功能注釋的分析，我們發(fā)現(xiàn)一些基因參與了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞壁合成與修飾等生物學(xué)過(guò)程，這些過(guò)程與赤霉素調(diào)控舌狀花生長(zhǎng)的機(jī)制密切相關(guān)，因此將這些基因作為節(jié)點(diǎn)納入信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。5.2網(wǎng)絡(luò)邊的構(gòu)建與分析在確定了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)后，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)邊成為構(gòu)建完整信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵步驟。網(wǎng)絡(luò)邊代表著節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，這些關(guān)系基于基因調(diào)控關(guān)系和信號(hào)傳導(dǎo)路徑得以確定，通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)邊的深入分析，我們能夠揭示赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)過(guò)程中基因之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制?；蛘{(diào)控關(guān)系是構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)邊的重要依據(jù)之一。在赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的過(guò)程中，不同基因之間存在著直接或間接的調(diào)控關(guān)系。一些轉(zhuǎn)錄因子能夠與赤霉素相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)節(jié)這些基因的轉(zhuǎn)錄活性。我們通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料以及利用生物信息學(xué)工具對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析，尋找潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。研究表明，MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，在非洲菊舌狀花中，我們發(fā)現(xiàn)GjMYB1基因的表達(dá)與赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的多個(gè)基因密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)GjMYB1基因啟動(dòng)子區(qū)域的分析，發(fā)現(xiàn)其中存在多個(gè)與赤霉素信號(hào)響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，如GA-responsiveelement（GARE）等。這表明GjMYB1基因可能受到赤霉素信號(hào)的調(diào)控，同時(shí)它也可能作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控其他赤霉素相關(guān)基因的表達(dá)。因此，我們?cè)谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中構(gòu)建了GjMYB1基因與其他相關(guān)基因之間的網(wǎng)絡(luò)邊，以表示它們之間的調(diào)控關(guān)系。信號(hào)傳導(dǎo)路徑是構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)邊的另一個(gè)重要基礎(chǔ)。在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，從赤霉素的感知到最終的生理響應(yīng)，涉及一系列的信號(hào)傳遞過(guò)程，各個(gè)環(huán)節(jié)中的基因和蛋白相互作用，形成了一條完整的信號(hào)傳導(dǎo)路徑。當(dāng)赤霉素與受體GjGID1結(jié)合后，會(huì)引發(fā)與DELLA蛋白的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致DELLA蛋白的降解，解除對(duì)下游基因的抑制。在這個(gè)過(guò)程中，GjGID1基因、DELLA蛋白編碼基因（如GjRGA1、GjRGA2等）以及參與DELLA蛋白降解的SCF復(fù)合體相關(guān)基因（如GjSkp1、GjCullin和GjF-box等）之間存在著明確的信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)系。我們根據(jù)這些已知的信號(hào)傳導(dǎo)路徑，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中構(gòu)建相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)邊，清晰地展示出赤霉素信號(hào)在這些基因之間的傳遞過(guò)程。同時(shí)，我們還考慮到信號(hào)傳導(dǎo)路徑中的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，一些基因的表達(dá)產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)上游或下游基因的表達(dá)產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用。當(dāng)赤霉素信號(hào)激活下游基因的表達(dá)后，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物可能會(huì)反過(guò)來(lái)抑制赤霉素的合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，以維持植物體內(nèi)赤霉素信號(hào)的平衡。在非洲菊舌狀花中，我們發(fā)現(xiàn)一些赤霉素合成相關(guān)基因的表達(dá)受到下游基因表達(dá)產(chǎn)物的反饋抑制。根據(jù)這些反饋調(diào)節(jié)關(guān)系，我們?cè)谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中構(gòu)建相應(yīng)的反向網(wǎng)絡(luò)邊，進(jìn)一步完善了網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)。構(gòu)建完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)后，對(duì)其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析能夠幫助我們深入理解網(wǎng)絡(luò)的特性和功能。我們使用網(wǎng)絡(luò)分析軟件（如Cytoscape等）對(duì)構(gòu)建的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析中，我們關(guān)注網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)度、介數(shù)中心性、緊密中心性等指標(biāo)。節(jié)點(diǎn)度是指與該節(jié)點(diǎn)相連的邊的數(shù)量，反映了節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性和活躍程度。在赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，我們發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵基因，如GjGID1、GjRGA1等，具有較高的節(jié)點(diǎn)度。GjGID1作為赤霉素受體基因，它與赤霉素分子以及下游的DELLA蛋白編碼基因緊密相連，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著關(guān)鍵的起始作用，因此具有較多的連接邊，節(jié)點(diǎn)度較高。介數(shù)中心性衡量的是一個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中出現(xiàn)的次數(shù)，反映了該節(jié)點(diǎn)在信息傳遞中的重要性。一些轉(zhuǎn)錄因子基因，如GjMYB1，可能在網(wǎng)絡(luò)中具有較高的介數(shù)中心性，因?yàn)樗鼈兡軌蛘隙喾N信號(hào)，調(diào)控多個(gè)下游基因的表達(dá)，在信息傳遞過(guò)程中起到關(guān)鍵的橋梁作用。緊密中心性則表示節(jié)點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的接近程度，反映了節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的位置和影響力范圍。通過(guò)對(duì)這些拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)指標(biāo)的分析，我們能夠識(shí)別出網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和關(guān)鍵連接，為進(jìn)一步研究赤霉素調(diào)控機(jī)制提供重要線索。除了拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，對(duì)網(wǎng)絡(luò)的功能模塊進(jìn)行分析也是深入理解信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的重要手段。功能模塊是指網(wǎng)絡(luò)中具有相似功能或參與相同生物學(xué)過(guò)程的一組基因，它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中形成相對(duì)獨(dú)立的子網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)內(nèi)部和外部的相互作用，共同完成特定的生物學(xué)功能。我們使用MCODE（MolecularComplexDetection）等算法對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能模塊分析。通過(guò)分析，我們發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中存在多個(gè)功能模塊，如赤霉素合成模塊、赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊、細(xì)胞生長(zhǎng)與發(fā)育模塊等。在赤霉素合成模塊中，包含了一系列參與赤霉素合成的基因，如GjCPS、GjKS、GjGA20ox、GjGA3ox等，這些基因之間通過(guò)緊密的相互作用，協(xié)同完成赤霉素的合成過(guò)程。赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊則主要包括赤霉素受體基因GjGID1、DELLA蛋白編碼基因以及SCF復(fù)合體相關(guān)基因等，它們共同參與赤霉素信號(hào)的感知、傳遞和響應(yīng)。細(xì)胞生長(zhǎng)與發(fā)育模塊包含了一些與細(xì)胞伸長(zhǎng)、分裂、分化等過(guò)程相關(guān)的基因，這些基因受到赤霉素信號(hào)的調(diào)控，在非洲菊舌狀花的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。對(duì)這些功能模塊的分析，有助于我們深入了解赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的分子機(jī)制，明確各個(gè)基因在不同生物學(xué)過(guò)程中的作用以及它們之間的協(xié)同關(guān)系。5.3網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證與完善為了確保構(gòu)建的赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的準(zhǔn)確性和可靠性，我們?cè)O(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，主要包括利用突變體和激素處理實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，進(jìn)一步補(bǔ)充和完善信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。突變體是研究基因功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要工具。在本研究中，我們獲取或構(gòu)建了非洲菊中與赤霉素相關(guān)基因的突變體材料，如GjGID1基因的突變體和DELLA蛋白編碼基因GjRGA1的突變體等。通過(guò)對(duì)這些突變體植株的表型分析，驗(yàn)證信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中基因的功能和相互作用關(guān)系。對(duì)于GjGID1基因突變體，由于該基因編碼赤霉素受體，其功能缺失會(huì)導(dǎo)致植株對(duì)赤霉素不敏感。在正常生長(zhǎng)條件下，野生型非洲菊植株在赤霉素的作用下，舌狀花的生長(zhǎng)和發(fā)育正常，花瓣伸長(zhǎng)、花朵開放。而GjGID1基因突變體植株，即使在施加外源赤霉素的情況下，舌狀花的生長(zhǎng)也受到明顯抑制，花瓣短小，花朵無(wú)法正常開放。這表明GjGID1基因在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著關(guān)鍵的起始作用，其功能缺失會(huì)阻斷赤霉素信號(hào)的傳遞，從而影響舌狀花的生長(zhǎng)發(fā)育，與我們構(gòu)建的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中GjGID1基因的作用相符。對(duì)于DELLA蛋白編碼基因GjRGA1的突變體，由于DELLA蛋白是赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵抑制因子，GjRGA1基因突變會(huì)導(dǎo)致DELLA蛋白功能異常，從而使植株對(duì)赤霉素的響應(yīng)發(fā)生改變。在突變體植株中，由于GjRGA1基因功能缺失，DELLA蛋白無(wú)法正常發(fā)揮抑制作用，植株表現(xiàn)出對(duì)赤霉素的超敏感表型。在沒(méi)有外源赤霉素處理時(shí)，突變體植株的舌狀花生長(zhǎng)就比野生型植株更為迅速，花瓣伸長(zhǎng)明顯；當(dāng)施加外源赤霉素后，突變體植株舌狀花的生長(zhǎng)進(jìn)一步加快，花朵開放時(shí)間提前。這說(shuō)明GjRGA1基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中確實(shí)起到抑制赤霉素信號(hào)的作用，其突變會(huì)解除對(duì)赤霉素信號(hào)的抑制，導(dǎo)致植株對(duì)赤霉素的響應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中GjRGA1基因與其他基因的相互作用關(guān)系。激素處理實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的另一種重要方法。我們對(duì)非洲菊植株進(jìn)行不同濃度的赤霉素處理，觀察植株的生長(zhǎng)表型以及相關(guān)基因的表達(dá)變化，從而驗(yàn)證信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中赤霉素對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了不同的赤霉素處理濃度梯度，包括低濃度（50μM）、中濃度（100μM）和高濃度（200μM），以清水處理作為對(duì)照。在低濃度赤霉素處理下，非洲菊舌狀花的生長(zhǎng)速度略有加快，花瓣開始逐漸伸長(zhǎng)。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，赤霉素合成相關(guān)基因GjGA20ox1和GjGA3ox1的表達(dá)量有所上調(diào)，而赤霉素分解代謝相關(guān)基因GjGA2ox1的表達(dá)量略有下降。這表明低濃度的赤霉素能夠促進(jìn)赤霉素的合成，同時(shí)抑制其分解，從而維持植物體內(nèi)赤霉素的平衡，促進(jìn)舌狀花的生長(zhǎng)，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中赤霉素對(duì)這些基因的調(diào)控關(guān)系一致。在中濃度赤霉素處理下，舌狀花的生長(zhǎng)速度明顯加快，花瓣伸長(zhǎng)更為顯著，花朵開放時(shí)間提前。此時(shí)，赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因表達(dá)變化更為明顯。GjGID1基因的表達(dá)量顯著升高，表明植株對(duì)赤霉素信號(hào)的感知增強(qiáng)；DELLA蛋白編碼基因GjRGA1的表達(dá)量下降，同時(shí)其蛋白含量也減少，說(shuō)明DELLA蛋白受到赤霉素信號(hào)的降解作用增強(qiáng)，赤霉素信號(hào)得以順利轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，一些受赤霉素調(diào)控的下游基因，如參與細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂的基因GjEXP1（編碼擴(kuò)張蛋白）和GjCYCD3（編碼細(xì)胞周期蛋白D3）的表達(dá)量也顯著上調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中赤霉素通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)舌狀花生長(zhǎng)的機(jī)制。在高濃度赤霉素處理下，雖然舌狀花的生長(zhǎng)速度在初期明顯加快，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，植株出現(xiàn)了一些異常表型，如花瓣過(guò)度伸長(zhǎng)、花朵早衰等。這可能是由于高濃度的赤霉素打破了植物體內(nèi)激素的平衡，導(dǎo)致一些基因的表達(dá)失調(diào)。通過(guò)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，一些與衰老相關(guān)的基因表達(dá)量上調(diào)，如GjSAG12（編碼衰老相關(guān)基因12）。這表明高濃度赤霉素處理會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響，進(jìn)一步提示信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中基因之間的相互作用需要維持在一個(gè)合適的平衡狀態(tài)。根據(jù)突變體和激素處理實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們對(duì)構(gòu)建的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了補(bǔ)充和完善。在突變體實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)除了已知的GjGID1-DELLA蛋白-SCF復(fù)合體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑外，可能還存在其他的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)對(duì)GjGID1基因突變體的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)一些新的基因表達(dá)發(fā)生了變化，這些基因可能參與了赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的旁路途徑。我們將這些新發(fā)現(xiàn)的基因納入信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果構(gòu)建了它們與已知基因之間的相互作用關(guān)系。在激素處理實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)赤霉素對(duì)一些基因的調(diào)控存在劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。在不同濃度和處理時(shí)間下，基因的表達(dá)模式有所不同。我們?cè)谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中明確標(biāo)注了這些基因表達(dá)受赤霉素調(diào)控的劑量和時(shí)間信息，使網(wǎng)絡(luò)更加準(zhǔn)確地反映赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的分子機(jī)制。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證與完善，我們構(gòu)建的赤霉素調(diào)控非洲菊舌狀花生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)更加準(zhǔn)確、全面，為深入理解赤霉素在非洲菊生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供了更可靠的模型。六、結(jié)果與討論6.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果本研究利用IlluminaHiSeq平臺(tái)對(duì)非洲菊舌狀花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除低質(zhì)量reads和接頭序列后，共得到[X]Gb的cleandata，Q30堿基