基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測：原理、應(yīng)用與展望一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，一直是全球醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，全球癌癥新發(fā)病例高達(dá)1929萬例，癌癥死亡病例達(dá)996萬例。這些觸目驚心的數(shù)據(jù)凸顯了癌癥對人類生命健康的巨大威脅。在中國，癌癥同樣是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。癌癥的早期診斷和有效治療是提高患者生存率和生活質(zhì)量的關(guān)鍵。早期診斷能夠使患者在病情較輕、治療效果較好的階段接受治療，從而顯著提高治愈率和生存率。據(jù)統(tǒng)計，早期乳腺癌患者的5年生存率可達(dá)90%以上，而晚期患者的5年生存率則降至20%以下。因此，尋找高靈敏度、高特異性的癌癥診斷標(biāo)志物和檢測方法具有極其重要的臨床意義。外泌體是一種由細(xì)胞分泌的納米級脂質(zhì)雙層膜囊泡，直徑約為30-150nm，幾乎所有細(xì)胞均可分泌，廣泛分布于人體體液中，如血液、尿液、唾液、腦脊液等。外泌體攜帶著起源細(xì)胞的多種物質(zhì)，包括膜蛋白、核酸（如mRNA、miRNA）、脂質(zhì)等，這些物質(zhì)反映了來源細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。腫瘤外泌體可以通過傳遞致癌物質(zhì)，如致癌mRNA和miRNA，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，誘導(dǎo)免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤血管生成，從而為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供有利條件。由于腫瘤外泌體具有這些特性，使其成為早期癌癥臨床診斷中一類極具潛力的重要標(biāo)志物。通過檢測腫瘤外泌體的含量、組成和功能變化，可以實(shí)現(xiàn)對癌癥的早期診斷、病情監(jiān)測、療效評價及預(yù)后分析。在肺癌診斷中，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤外泌體中的某些蛋白質(zhì)和miRNA表達(dá)水平與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為肺癌診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。然而，外泌體的檢測面臨著諸多挑戰(zhàn)，如外泌體的分離和純化難度大、檢測方法的靈敏度和特異性有待提高等。傳統(tǒng)的外泌體檢測方法，如超速離心、免疫磁珠分離等，存在操作復(fù)雜、耗時、成本高、分離效率低等問題，難以滿足臨床快速、準(zhǔn)確檢測的需求。電化學(xué)分析檢測技術(shù)作為一種重要的分析方法，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高、易操作、響應(yīng)速度快、成本低等特點(diǎn)，使其在臨床診斷、生物傳感、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。將電化學(xué)分析檢測技術(shù)與外泌體檢測相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)外泌體的高靈敏精準(zhǔn)檢測提供了新的途徑。適配體是一種通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選得到的單鏈DNA或RNA分子，能夠與靶標(biāo)物質(zhì)高親和力和特異性地結(jié)合。適配體具有穩(wěn)定、易于合成、反復(fù)使用、易于保存和化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn)，在生物傳感領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力?；谶m配體的電化學(xué)分析檢測技術(shù)，利用適配體與腫瘤外泌體的特異性識別作用，結(jié)合電化學(xué)檢測的高靈敏度，能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤外泌體的高靈敏、高特異性檢測。本研究旨在開發(fā)一種基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測方法，通過優(yōu)化適配體的篩選和修飾、電極材料的選擇和修飾以及電化學(xué)檢測條件等，構(gòu)建高靈敏、高特異性的腫瘤外泌體電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的快速、準(zhǔn)確檢測。該研究對于癌癥的早期診斷、療效評價及預(yù)后分析具有重要的意義，有望為臨床癌癥診斷和治療提供新的技術(shù)手段和理論依據(jù)。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在開發(fā)一種基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測方法，通過對適配體的篩選和修飾、電極材料的選擇和修飾以及電化學(xué)檢測條件的優(yōu)化，構(gòu)建高靈敏、高特異性的腫瘤外泌體電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的快速、準(zhǔn)確檢測。具體研究目的如下：篩選和修飾適配體：運(yùn)用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX），針對腫瘤外泌體表面的特異性標(biāo)志物，篩選出具有高親和力和高特異性的適配體，并對其進(jìn)行化學(xué)修飾，增強(qiáng)適配體與腫瘤外泌體的結(jié)合能力以及在傳感器表面的固定效果。優(yōu)化電極材料與修飾：篩選合適的電極材料，如金電極、玻碳電極等，對其進(jìn)行表面修飾，提高電極的導(dǎo)電性、生物相容性和穩(wěn)定性，增強(qiáng)電極對適配體和腫瘤外泌體的吸附能力，從而提升傳感器的檢測性能。構(gòu)建電化學(xué)傳感器：將修飾后的適配體固定在優(yōu)化后的電極表面，構(gòu)建基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)傳感器，并對傳感器的性能進(jìn)行全面表征，包括靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等，確定最佳檢測條件。實(shí)際樣品檢測：利用構(gòu)建的電化學(xué)傳感器對實(shí)際腫瘤患者的體液樣本（如血液、尿液等）中的腫瘤外泌體進(jìn)行檢測，并與傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行對比分析，驗(yàn)證該傳感器在臨床檢測中的可行性和可靠性。相較于現(xiàn)有的腫瘤外泌體檢測方法，本研究具有以下創(chuàng)新點(diǎn)：高特異性識別：利用適配體對腫瘤外泌體表面標(biāo)志物的高特異性識別能力，實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的精準(zhǔn)捕獲和檢測，有效提高檢測的特異性，減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。高靈敏度檢測：結(jié)合電化學(xué)分析檢測技術(shù)的高靈敏度特點(diǎn)，通過優(yōu)化適配體和電極材料的修飾以及檢測條件，提高傳感器對腫瘤外泌體的檢測靈敏度，有望實(shí)現(xiàn)對低豐度腫瘤外泌體的檢測。簡便快速的檢測過程：本研究構(gòu)建的電化學(xué)傳感器操作簡單，響應(yīng)速度快，能夠在短時間內(nèi)完成對腫瘤外泌體的檢測，滿足臨床快速診斷的需求。同時，該方法無需復(fù)雜的樣品前處理和大型儀器設(shè)備，降低了檢測成本，具有良好的應(yīng)用前景。多標(biāo)志物聯(lián)合檢測：在適配體的篩選過程中，考慮選擇多種針對腫瘤外泌體不同表面標(biāo)志物的適配體，實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的多標(biāo)志物聯(lián)合檢測，進(jìn)一步提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，為癌癥的早期診斷和病情監(jiān)測提供更全面的信息。二、腫瘤外泌體與適配體概述2.1腫瘤外泌體2.1.1生物起源與形成機(jī)制腫瘤外泌體起源于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多泡體（MVBs）。在腫瘤細(xì)胞的生命活動過程中，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體進(jìn)一步與其他膜細(xì)胞器融合，逐步演變成MVBs。MVBs的形成是一個復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過程，涉及多種分子機(jī)制。內(nèi)體分選復(fù)合體（ESCRT）在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它包含ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II、ESCRT-Ⅲ亞復(fù)合體和ATP酶的VPS4蛋白。ESCRT-0能夠憑借其泛素結(jié)合域識別單泛素化或多泛素化的蛋白，隨后招募ESCRT-I和ESCRT-II，共同構(gòu)建成鞍形蛋白復(fù)合物，這一復(fù)合物對于ESCRT-Ⅲ的組裝至關(guān)重要。VPS4蛋白水解ATP后，ESCRT-Ⅲ亞基依次聚合，驅(qū)動膜變形和分裂，最終促使腔內(nèi)囊泡的產(chǎn)生。除了ESCRT依賴途徑，還有非依賴途徑參與MVBs的形成。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體富含膽固醇、鞘脂、磷脂酰絲氨酸和神經(jīng)酰胺等成分，這些成分與膜脂筏類似。一些外泌體蛋白，如flotillins蛋白和caveolins蛋白，本身就是脂筏的重要組成部分。脂筏在蛋白質(zhì)分選、膜曲率和囊泡出芽等過程中發(fā)揮著多種功能，越來越多的證據(jù)表明，脂筏的成分在ESCRT非依賴途徑的腔內(nèi)囊泡形成中具有關(guān)鍵作用。中性鞘磷脂酶2（nSMase2）-神經(jīng)酰胺途徑是研究最多的ESCRT非依賴途徑，nSMase2作為將鞘磷脂轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺的關(guān)鍵酶，通過熒光探針技術(shù)以及使用中性鞘磷脂酶抑制劑等實(shí)驗(yàn)手段證實(shí)，nSMase2-神經(jīng)酰胺途徑可控制外泌體對多種物質(zhì)的分選，如少突膠質(zhì)細(xì)胞中的脂蛋白、神經(jīng)元細(xì)胞中的朊蛋白、以及腫瘤細(xì)胞中的幾種RNA。然而，nSMase2-神經(jīng)酰胺途徑介導(dǎo)的腔內(nèi)囊泡形成的確切機(jī)制尚未完全明確。當(dāng)MVBs成熟后，其命運(yùn)主要有兩種：一部分MVBs與溶酶體融合，進(jìn)而被降解；另一部分MVBs則與質(zhì)膜融合，將其內(nèi)部的腔內(nèi)囊泡釋放到細(xì)胞外空間，這些釋放出來的腔內(nèi)囊泡即為外泌體。在腫瘤細(xì)胞中，Rab27A和Rab27B等蛋白是引導(dǎo)MVBs向細(xì)胞外周轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì)，它們通過與其他相關(guān)蛋白相互作用，精確調(diào)控MVBs的運(yùn)輸方向和時機(jī)。最后，SNARE復(fù)合物幫助MVBs與質(zhì)膜實(shí)現(xiàn)融合，確保外泌體能夠順利釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。腫瘤細(xì)胞相較于正常細(xì)胞，往往會分泌更多數(shù)量的外泌體，這可能與腫瘤細(xì)胞的快速增殖、代謝活躍以及異常的信號通路調(diào)控等因素密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些致癌信號通路，如Ras-MAPK通路、PI3K-Akt通路等的異常激活，可能會影響外泌體的生物發(fā)生過程，促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和釋放更多的外泌體。2.1.2組成成分與功能腫瘤外泌體包含豐富多樣的組成成分，這些成分反映了腫瘤細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)，并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤外泌體中含有多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)參與了腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。其中，膜蛋白如CD63、CD81、CD9等四跨膜蛋白是外泌體的標(biāo)志性蛋白，它們在維持外泌體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、介導(dǎo)外泌體與靶細(xì)胞的識別和融合等方面發(fā)揮重要作用。腫瘤相關(guān)抗原如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）等也常存在于腫瘤外泌體中，這些抗原的存在使得腫瘤外泌體具有潛在的診斷價值。一些參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，如表皮生長因子受體（EGFR）、磷酸化的蛋白激酶B（p-Akt）等，能夠通過外泌體傳遞到受體細(xì)胞，激活相應(yīng)的信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究表明，腫瘤外泌體中的EGFR可以激活受體細(xì)胞中的Ras-MAPK信號通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。核酸也是腫瘤外泌體的重要組成部分，包括mRNA、miRNA、lncRNA和DNA等。mRNA可以攜帶腫瘤細(xì)胞的遺傳信息，被受體細(xì)胞攝取后，可能會翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，影響受體細(xì)胞的功能。miRNA是一類非編碼RNA，通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而調(diào)控基因表達(dá)。腫瘤外泌體中的miRNA可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤血管生成、免疫逃逸等。某些腫瘤外泌體中的miR-21可以抑制靶細(xì)胞中腫瘤抑制基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。lncRNA在腫瘤外泌體中也有發(fā)現(xiàn)，它們參與了腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、凋亡、分化等。腫瘤外泌體中的DNA包括基因組DNA片段和線粒體DNA片段，雖然其具體功能尚未完全明確，但可能與腫瘤的遺傳信息傳遞和腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性有關(guān)。腫瘤外泌體還含有豐富的脂質(zhì)，如磷脂、膽固醇、鞘脂等。這些脂質(zhì)不僅構(gòu)成了外泌體的膜結(jié)構(gòu)，還參與了外泌體與靶細(xì)胞的相互作用。磷脂酰絲氨酸位于外泌體膜的外側(cè)，能夠被靶細(xì)胞表面的受體識別，從而介導(dǎo)外泌體與靶細(xì)胞的融合。膽固醇和鞘脂等脂質(zhì)可以調(diào)節(jié)外泌體膜的流動性和穩(wěn)定性，影響外泌體的功能。腫瘤外泌體中的脂質(zhì)還可能參與了腫瘤細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在腫瘤發(fā)展過程中，腫瘤外泌體發(fā)揮著多方面的作用。腫瘤外泌體可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，通過傳遞生長因子、信號通路激活分子等，為腫瘤細(xì)胞提供生長所需的信號和物質(zhì)。腫瘤外泌體中的表皮生長因子（EGF）可以與腫瘤細(xì)胞表面的EGFR結(jié)合，激活下游的信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。腫瘤外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中也扮演著重要角色，它們可以誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。腫瘤外泌體還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，招募免疫細(xì)胞、促進(jìn)血管生成等，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。腫瘤外泌體可以吸引巨噬細(xì)胞向腫瘤部位聚集，并使其極化為M2型巨噬細(xì)胞，M2型巨噬細(xì)胞具有免疫抑制和促進(jìn)腫瘤生長的功能。腫瘤外泌體還可以攜帶血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)腫瘤血管生成。腫瘤外泌體在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中也具有重要作用。一方面，腫瘤外泌體可以抑制免疫細(xì)胞的功能，幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。腫瘤外泌體可以抑制T細(xì)胞的活化和增殖，降低自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的細(xì)胞毒性，從而削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。另一方面，腫瘤外泌體也可以激活免疫細(xì)胞，引發(fā)免疫反應(yīng)。腫瘤外泌體中的腫瘤相關(guān)抗原可以被抗原呈遞細(xì)胞（APC）攝取和加工，激活T細(xì)胞，引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，在腫瘤的發(fā)展過程中，腫瘤外泌體更多地是通過抑制免疫反應(yīng)來促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。2.1.3作為腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)勢與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物相比，腫瘤外泌體在癌癥的早期診斷、實(shí)時監(jiān)測和預(yù)后評估等方面具有顯著的優(yōu)勢。在早期診斷方面，腫瘤外泌體具有高靈敏度的特點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞在早期就會分泌外泌體，且外泌體中攜帶的腫瘤相關(guān)分子往往在腫瘤發(fā)展的早期階段就會發(fā)生變化。一些腫瘤特異性的miRNA在腫瘤外泌體中的表達(dá)水平在腫瘤早期就會顯著升高，通過檢測這些miRNA可以實(shí)現(xiàn)對腫瘤的早期診斷。研究表明，在肺癌早期，腫瘤外泌體中的miR-1225-5p和miR-486-5p的表達(dá)水平就明顯高于正常人群，可作為肺癌早期診斷的潛在標(biāo)志物。腫瘤外泌體存在于多種體液中，如血液、尿液、唾液等，通過簡單的液體活檢即可獲取，這為早期診斷提供了便利。與傳統(tǒng)的組織活檢相比，液體活檢具有無創(chuàng)或微創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)，患者更容易接受，有利于腫瘤的早期篩查和診斷。在實(shí)時監(jiān)測方面，腫瘤外泌體能夠反映腫瘤的動態(tài)變化。腫瘤細(xì)胞的生理狀態(tài)和代謝活動不斷變化，其分泌的外泌體的組成和含量也會相應(yīng)改變。通過定期檢測腫瘤外泌體中的相關(guān)標(biāo)志物，可以實(shí)時了解腫瘤的發(fā)展情況，如腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等。在腫瘤治療過程中，腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性逐漸產(chǎn)生，腫瘤外泌體中的一些耐藥相關(guān)蛋白和miRNA的表達(dá)水平會發(fā)生變化，通過監(jiān)測這些變化可以及時調(diào)整治療方案。腫瘤外泌體的檢測可以實(shí)現(xiàn)對腫瘤的動態(tài)監(jiān)測，為臨床治療提供及時、準(zhǔn)確的信息。在預(yù)后評估方面，腫瘤外泌體具有較高的準(zhǔn)確性。腫瘤外泌體中的一些標(biāo)志物與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，通過檢測這些標(biāo)志物可以評估患者的預(yù)后情況。腫瘤外泌體中的某些蛋白質(zhì)和miRNA的表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級以及患者的生存率密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者腫瘤外泌體中的miR-10b的表達(dá)水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)miR-10b的患者預(yù)后較差。腫瘤外泌體還可以作為預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的指標(biāo)，通過監(jiān)測腫瘤外泌體中的相關(guān)標(biāo)志物，可以提前預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險，為患者的后續(xù)治療和管理提供依據(jù)。2.2適配體2.2.1適配體的篩選技術(shù)適配體的篩選主要依賴于指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX），該技術(shù)是一種強(qiáng)大的體外篩選方法，能夠從人工合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選出與靶標(biāo)物質(zhì)具有高親和力和特異性結(jié)合的適配體。其基本原理是利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建一個包含大量不同序列的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫，文庫中隨機(jī)寡核苷酸的長度一般在20-100個堿基左右，中間包含一段隨機(jī)序列，為篩選提供了豐富的序列多樣性。理論上，一個40個堿基的隨機(jī)序列可有1.2??10^{24}種核苷酸排列順序（4^{40}=1.2??10^{24}），但實(shí)際上固相DNA合成的隨機(jī)組合核苷酸庫的序列多樣性僅限制于10^{14}-10^{15}種。在篩選過程中，首先將寡核苷酸隨機(jī)序列庫與靶標(biāo)物質(zhì)在特定溫度和緩沖液條件下共同孵育，文庫中的極少數(shù)分子會與靶標(biāo)分子結(jié)合。然后采用物理方法，如硝酸纖維素膜過濾、凝膠柱分離、微孔板分離等，將結(jié)合的分子與未結(jié)合的分子分離開來。以硝酸纖維素膜過濾法為例，Joshi等基于硝酸纖維素膜設(shè)計了橫向流動色譜裝置并與SELEX篩選技術(shù)結(jié)合，經(jīng)過7輪正篩和3輪反篩，成功獲得針對鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白（Omp）的高親和力適配體33和45序列，檢出限低至10-40cfu/mL。接著通過復(fù)合物熱解離獲得與靶標(biāo)結(jié)合的序列，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備下一級文庫。如此經(jīng)過8-20輪不斷篩選，每一輪篩選都對特異性結(jié)合的序列進(jìn)行富集，最終獲得對靶標(biāo)具有高特異性與高親和力的寡核苷酸序列，即適配體。適配體經(jīng)克隆測序后獲得相應(yīng)核酸序列，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。隨著研究的深入，為了提高適配體的篩選效率和質(zhì)量，多種改進(jìn)的SELEX技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。熒光磁珠SELEX（FluMag-SELEX）技術(shù)結(jié)合了磁珠與SELEX技術(shù)，該方法需要的靶標(biāo)量少，并且可通過熒光直觀測定結(jié)合適配體的量。Kim等應(yīng)用FluMag-SELEX技術(shù)篩選獲得廣譜抗炎性藥物布洛芬的5條特異性適配體，其中三條是外消旋布洛芬的特異性適配體，另外兩條能與外消旋和內(nèi)消旋布洛芬特異性作用，且這些適配體與布洛芬類似物、土霉素均沒有結(jié)合作用。毛細(xì)管電泳SELEX技術(shù)（CE-SELEX）則利用不同組分間荷質(zhì)比的差異導(dǎo)致電泳遷移率不同的原理實(shí)現(xiàn)不同組分的分離，能在2-4輪內(nèi)實(shí)現(xiàn)高親和力適配體的篩選，常被用于篩選蛋白質(zhì)、脂多糖、多肽等大分子物質(zhì)，大大提高了篩選效率。Yang等首次利用CE-SELEX實(shí)現(xiàn)了對小分子物質(zhì)甲基嗎啉的適配體的篩選，經(jīng)過3輪篩選后獲得了8條高親和力適配體，其解離常數(shù)為幾百nM到幾μM，其中兩條序列還能夠催化中卟啉的金屬插入反應(yīng)。此外，還有混合靶SELEX、體內(nèi)SELEX、基因組SELEX等子技術(shù)不斷涌現(xiàn)?；旌习蠸ELEX技術(shù)可同時對多個靶標(biāo)進(jìn)行篩選，拓寬了適配體的應(yīng)用范圍；體內(nèi)SELEX技術(shù)在生物體內(nèi)進(jìn)行篩選，能夠更真實(shí)地反映適配體與靶標(biāo)的相互作用；基因組SELEX技術(shù)則基于基因組信息進(jìn)行篩選，為適配體的篩選提供了新的思路和方法。這些改進(jìn)的SELEX技術(shù)在不同領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，為適配體的篩選和應(yīng)用提供了更多的可能性。2.2.2適配體與腫瘤外泌體的相互作用機(jī)制適配體與腫瘤外泌體的相互作用主要基于適配體對腫瘤外泌體表面特定靶點(diǎn)的特異性識別和結(jié)合。腫瘤外泌體表面存在多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等分子，這些分子可作為適配體的靶點(diǎn)。適配體通過自身折疊形成特定的三維空間結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G四分體等，借助氫鍵、疏水堆積作用、范德華力等與腫瘤外泌體表面的靶點(diǎn)緊密結(jié)合。在篩選針對腫瘤外泌體的適配體時，通常以腫瘤外泌體表面高表達(dá)的標(biāo)志性蛋白為靶標(biāo)，如上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）、程序性死亡受體-配體1（PD-L1）等。以EpCAM為例，EpCAM在多種腫瘤外泌體表面高度表達(dá)，是腫瘤診斷和治療的重要靶點(diǎn)。適配體通過與EpCAM的特異性結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤外泌體的捕獲和檢測。適配體與EpCAM的結(jié)合模式主要涉及適配體的特定堿基序列與EpCAM蛋白表面的氨基酸殘基之間的相互作用。適配體的某些堿基可以與EpCAM上的特定氨基酸形成氫鍵，從而穩(wěn)定兩者的結(jié)合。適配體的三維結(jié)構(gòu)也與EpCAM的空間構(gòu)象相匹配，通過疏水堆積作用和范德華力進(jìn)一步增強(qiáng)了結(jié)合的穩(wěn)定性。這種特異性結(jié)合使得適配體能夠準(zhǔn)確地識別和捕獲攜帶EpCAM的腫瘤外泌體，而對其他不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM的外泌體及生物分子具有較低的親和力，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的特異性檢測。PD-L1也是腫瘤外泌體表面的重要靶點(diǎn)之一。在腫瘤免疫逃逸過程中，腫瘤外泌體表面的PD-L1可以與T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活性，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。適配體可以通過與PD-L1的特異性結(jié)合，阻斷PD-L1與PD-1的相互作用，恢復(fù)T細(xì)胞的免疫活性，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫攻擊。適配體與PD-L1的結(jié)合不僅可以用于腫瘤外泌體的檢測，還具有潛在的腫瘤免疫治療應(yīng)用價值。適配體與PD-L1的結(jié)合機(jī)制與EpCAM類似，通過堿基與氨基酸之間的氫鍵以及空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合。但由于PD-L1的結(jié)構(gòu)和功能較為復(fù)雜，適配體與PD-L1的結(jié)合可能還涉及到一些其他的分子間相互作用，如靜電相互作用等，這些相互作用共同決定了適配體與PD-L1結(jié)合的特異性和親和力。除了蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，腫瘤外泌體表面的脂質(zhì)分子也可能成為適配體的作用靶點(diǎn)。某些脂質(zhì)在腫瘤外泌體膜上具有獨(dú)特的分布和結(jié)構(gòu)，適配體可以通過識別這些脂質(zhì)分子的特定結(jié)構(gòu)特征，與之特異性結(jié)合。脂質(zhì)適配體與腫瘤外泌體的結(jié)合可能涉及到適配體與脂質(zhì)分子之間的疏水相互作用、靜電相互作用等。這種基于脂質(zhì)靶點(diǎn)的適配體與腫瘤外泌體的相互作用為腫瘤外泌體的檢測和研究提供了新的視角和方法。2.2.3適配體在生物分析檢測中的優(yōu)勢在生物分析檢測領(lǐng)域，適配體相較于傳統(tǒng)的抗體具有多方面的顯著優(yōu)勢。在穩(wěn)定性方面，適配體表現(xiàn)出卓越的性能。適配體是由核酸組成，其化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，能夠在較寬的溫度、pH值和離子強(qiáng)度范圍內(nèi)保持結(jié)構(gòu)和功能的完整性。在高溫條件下，適配體的結(jié)構(gòu)不會像抗體那樣容易發(fā)生變性，仍能保持與靶標(biāo)的結(jié)合能力。研究表明，適配體在60℃甚至更高溫度下處理一段時間后，依然可以特異性地結(jié)合腫瘤外泌體，而抗體在這樣的溫度下往往會失去活性。適配體對核酸酶等生物酶的耐受性也較強(qiáng)，能夠在復(fù)雜的生物樣品中長時間穩(wěn)定存在，這使得適配體在實(shí)際檢測應(yīng)用中具有更高的可靠性。特異性是生物分析檢測中至關(guān)重要的指標(biāo)，適配體在這方面表現(xiàn)出色。適配體通過SELEX技術(shù)篩選得到，能夠針對特定的靶標(biāo)物質(zhì)形成高度特異性的結(jié)合。在腫瘤外泌體檢測中，適配體可以精確識別腫瘤外泌體表面的獨(dú)特標(biāo)志物，而對其他非相關(guān)的生物分子幾乎沒有交叉反應(yīng)。一種針對乳腺癌外泌體表面特定蛋白的適配體，能夠準(zhǔn)確地捕獲乳腺癌外泌體，而對正常細(xì)胞來源的外泌體以及血液中的其他成分幾乎不發(fā)生結(jié)合，有效提高了檢測的準(zhǔn)確性和特異性，減少了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。適配體與靶標(biāo)之間具有較高的親和力，其解離常數(shù)（Kd）通?？梢赃_(dá)到納摩爾（nM）甚至皮摩爾（pM）級別，與抗體的親和力相當(dāng)。這種高親和力使得適配體能夠在低濃度靶標(biāo)存在的情況下實(shí)現(xiàn)高效結(jié)合，從而提高檢測的靈敏度。在檢測低豐度的腫瘤外泌體時，適配體可以與腫瘤外泌體表面的標(biāo)志物緊密結(jié)合，即使腫瘤外泌體的含量極低，也能夠被適配體有效捕獲和檢測，為癌癥的早期診斷提供了有力的技術(shù)支持。適配體的可修飾性也是其重要優(yōu)勢之一。適配體是由核酸組成，便于進(jìn)行化學(xué)修飾?？梢栽谶m配體的末端或特定位置引入各種功能基團(tuán)，如熒光基團(tuán)、生物素、巰基等。引入熒光基團(tuán)后，適配體可以用于熒光標(biāo)記檢測，通過熒光信號的變化直觀地反映與腫瘤外泌體的結(jié)合情況，實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的可視化檢測。引入生物素后，適配體可以通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)進(jìn)行固定或檢測，增強(qiáng)適配體在傳感器表面的固定效果，提高檢測的穩(wěn)定性和重復(fù)性。引入巰基則可以使適配體與金電極等材料表面的金原子形成牢固的化學(xué)鍵，實(shí)現(xiàn)適配體在電極表面的穩(wěn)定固定，為構(gòu)建基于適配體的電化學(xué)傳感器提供了便利。適配體的可修飾性為其在生物分析檢測中的應(yīng)用提供了更多的靈活性和多樣性，能夠滿足不同檢測需求和檢測技術(shù)的要求。三、基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測原理3.1電化學(xué)檢測技術(shù)基礎(chǔ)3.1.1電化學(xué)檢測的基本原理電化學(xué)檢測是基于物質(zhì)在溶液中的電化學(xué)性質(zhì)及其變化規(guī)律，通過測量電學(xué)量（如電位、電流、電導(dǎo)、電量等）與被測物質(zhì)的某些量之間建立的計量關(guān)系，來對被測組分進(jìn)行定性和定量分析的方法。其基礎(chǔ)理論源于電化學(xué)中的電極過程動力學(xué)和電化學(xué)熱力學(xué)。電位分析法是電化學(xué)檢測的重要方法之一，主要基于Nernst方程，通過測量指示電極和參比電極之間的電位差，來確定溶液中待測離子的活度或濃度。當(dāng)將指示電極和參比電極浸入待測溶液中時，會構(gòu)成一個原電池，電池電動勢E與指示電極電位\varphi_{????¤o}和參比電極電位\varphi_{????ˉ?}之間的關(guān)系為E=\varphi_{????¤o}-\varphi_{????ˉ?}+E_{L}，其中E_{L}為液體接界電位。在實(shí)際測量中，參比電極電位保持恒定，而指示電極電位會隨待測離子活度的變化而改變，對于氧化還原體系Ox+ne^-=Red，其電極電位\varphi與溶液中待測離子活度的關(guān)系符合Nernst方程：\varphi=\varphi^{0}+\frac{RT}{nF}ln\frac{a_{Ox}}{a_{Red}}，式中\(zhòng)varphi^{0}為標(biāo)準(zhǔn)電極電位，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度，n為電極反應(yīng)中轉(zhuǎn)移的電子數(shù)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，a_{Ox}和a_{Red}分別為氧化態(tài)和還原態(tài)物質(zhì)的活度。通過測量電池電動勢，利用Nernst方程即可計算出待測離子的活度或濃度。在測定溶液中的氫離子濃度時，常使用玻璃電極作為指示電極，飽和甘汞電極作為參比電極，通過測量電池電動勢，根據(jù)Nernst方程計算出溶液的pH值。電流分析法是在一定電位下，測量通過電極的電流來確定被測物質(zhì)的含量。其原理基于電極反應(yīng)中電流與電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)濃度之間的關(guān)系。當(dāng)在電極上施加一個恒定的電位時，溶液中的電活性物質(zhì)會在電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流。根據(jù)法拉第定律，電流i與參與電極反應(yīng)的物質(zhì)的量n之間的關(guān)系為i=\frac{nF}{t}，其中t為時間。在一定條件下，電流與溶液中被測物質(zhì)的濃度成正比，因此可以通過測量電流來定量分析被測物質(zhì)。在測定重金屬離子濃度時，可以利用伏安法，在電極上施加線性變化的電位，使重金屬離子在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，記錄電流隨電位的變化曲線，根據(jù)曲線的特征和電流大小來確定重金屬離子的濃度。電導(dǎo)分析法是通過測量溶液的電導(dǎo)來確定被測物質(zhì)的含量。溶液的電導(dǎo)G是電阻R的倒數(shù)，即G=\frac{1}{R}，根據(jù)歐姆定律I=\frac{E}{R}（I為電流，E為電壓），可得G=\frac{I}{E}。在電導(dǎo)分析中，通常使用兩個電極插入溶液中，施加一定的交流電壓，測量通過溶液的電流，從而計算出溶液的電導(dǎo)。溶液的電導(dǎo)與溶液中離子的濃度、離子的遷移率以及溫度等因素有關(guān)。在一定條件下，對于強(qiáng)電解質(zhì)溶液，溶液的電導(dǎo)與離子濃度成正比。通過測量溶液的電導(dǎo)，可以間接測定溶液中強(qiáng)電解質(zhì)的濃度。在測定水中的鹽含量時，可以利用電導(dǎo)分析法，通過測量水樣的電導(dǎo)，根據(jù)電導(dǎo)與鹽濃度的關(guān)系，計算出水中鹽的含量。3.1.2常用的電化學(xué)檢測技術(shù)循環(huán)伏安法（CyclicVoltammetry，CV）是一種常用的電化學(xué)檢測技術(shù)，在腫瘤外泌體檢測中具有重要應(yīng)用。其原理是在工作電極上施加一個線性變化的掃描電壓，電壓隨時間呈周期性變化，通常從初始電位開始，先向一個方向掃描，達(dá)到終止電位后再反向掃描回到初始電位，構(gòu)成一個循環(huán)。在掃描過程中，記錄工作電極上的電流隨電位的變化曲線，即循環(huán)伏安曲線。當(dāng)工作電極電位達(dá)到被測物質(zhì)的氧化還原電位時，被測物質(zhì)會在電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流。在正向掃描過程中，若溶液中存在可氧化的物質(zhì)，當(dāng)電位達(dá)到其氧化電位時，物質(zhì)在電極表面失去電子被氧化，產(chǎn)生陽極電流；在反向掃描過程中，氧化產(chǎn)物在電極表面得到電子被還原，產(chǎn)生陰極電流。循環(huán)伏安曲線中會出現(xiàn)氧化峰和還原峰，氧化峰電位E_{pa}和還原峰電位E_{pc}以及氧化峰電流I_{pa}和還原峰電流I_{pc}等參數(shù)可以提供有關(guān)被測物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)和反應(yīng)機(jī)理的信息。對于可逆電極反應(yīng)，氧化峰電流I_{pa}和還原峰電流I_{pc}的比值\frac{I_{pa}}{I_{pc}}\approx1，且氧化峰電位E_{pa}和還原峰電位E_{pc}的差值\DeltaE_{p}=E_{pa}-E_{pc}\approx\frac{59}{n}mV（n為電極反應(yīng)中轉(zhuǎn)移的電子數(shù)，25^{\circ}C時）。在腫瘤外泌體檢測中，循環(huán)伏安法可以用于研究適配體與腫瘤外泌體的相互作用。將修飾有適配體的電極浸入含有腫瘤外泌體的溶液中，適配體與腫瘤外泌體特異性結(jié)合后，會改變電極表面的電子傳遞特性，從而在循環(huán)伏安曲線上表現(xiàn)出電流和電位的變化。通過比較結(jié)合前后循環(huán)伏安曲線的差異，可以判斷適配體與腫瘤外泌體的結(jié)合情況，以及評估適配體傳感器的性能。差分脈沖伏安法（DifferentialPulseVoltammetry，DPV）是在恒電位儀在階梯線性掃描的基礎(chǔ)上疊加一系列正向和反向的脈沖信號作為激勵信號。在每個脈沖期間，測量電流的變化，一個周期內(nèi)正向和反向脈沖的電流相減，得到這個周期內(nèi)的電解電流\Deltai。隨著電勢的增加，連續(xù)測得多個周期內(nèi)的電解電流\Deltai，并用\Deltai對E作圖，得到差分脈沖曲線。差分脈沖伏安法具有較高的分辨率，可同時檢測多種元素、多種物質(zhì)。其背景電流非常平緩，由于電流差減的緣故，因雜質(zhì)的氧化還原電流導(dǎo)致的背景電流也被大大地消除，因此具有更高的檢測靈敏度及更低的檢測限，在實(shí)驗(yàn)條件控制良好的條件下，DPV的檢測限可低至10^{-8}mol/L。在定量測試方面，甚至比大部分分子或者原子吸收光譜更加靈敏。在腫瘤外泌體檢測中，差分脈沖伏安法可以用于檢測腫瘤外泌體表面標(biāo)志物的含量。利用適配體與腫瘤外泌體表面標(biāo)志物的特異性結(jié)合，將修飾有適配體的電極浸入含有腫瘤外泌體的溶液中，當(dāng)施加差分脈沖信號時，腫瘤外泌體表面標(biāo)志物與適配體結(jié)合后會引起電極表面電荷分布和電子傳遞的變化，從而在差分脈沖曲線上產(chǎn)生特征峰。通過測量特征峰的電流和電位，可以定量分析腫瘤外泌體表面標(biāo)志物的含量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的檢測。電化學(xué)阻抗譜（ElectrochemicalImpedanceSpectroscopy，EIS）是一種測量電化學(xué)系統(tǒng)的電化學(xué)行為的方法，通過測量系統(tǒng)對于正弦電壓或電流的響應(yīng)，來研究電化學(xué)反應(yīng)過程中的阻抗變化。其原理是利用正弦電壓或電流去激勵待測電化學(xué)系統(tǒng)，并測量響應(yīng)信號的振幅和相位，然后將這些數(shù)據(jù)在頻率域或時間域中進(jìn)行分析，從而得到電化學(xué)系統(tǒng)的等效電路模型，如電阻、電容、電感等參數(shù)，這些參數(shù)可以反映出系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、特性和電化學(xué)反應(yīng)的動力學(xué)信息。在EIS測量中，通常用復(fù)平面阻抗圖（Nyquist圖）和Bode圖來表示測量結(jié)果。在Nyquist圖中，橫坐標(biāo)表示實(shí)部阻抗Z_{re}，縱坐標(biāo)表示虛部阻抗Z_{im}，阻抗的變化以半圓或弧線的形式呈現(xiàn)。在Bode圖中，通常包括兩條曲線，一條是阻抗模值|Z|隨頻率f的變化曲線，另一條是相位角\theta隨頻率f的變化曲線。通過分析EIS譜圖，可以獲得電極界面的電荷轉(zhuǎn)移電阻R_{ct}、雙電層電容C_{dl}、溶液電阻R_{s}等參數(shù)，從而了解電化學(xué)反應(yīng)的機(jī)理和動力學(xué)過程。在腫瘤外泌體檢測中，電化學(xué)阻抗譜可以用于表征適配體修飾電極與腫瘤外泌體的結(jié)合過程。當(dāng)適配體修飾電極與腫瘤外泌體結(jié)合后，電極界面的電荷轉(zhuǎn)移電阻和雙電層電容等參數(shù)會發(fā)生變化。通過測量結(jié)合前后EIS譜圖的變化，可以判斷適配體與腫瘤外泌體的結(jié)合情況，以及評估適配體傳感器的性能。若腫瘤外泌體與適配體結(jié)合后，電極界面的電荷轉(zhuǎn)移電阻增大，說明適配體與腫瘤外泌體的結(jié)合阻礙了電子傳遞，從而可以根據(jù)電阻的變化來定量分析腫瘤外泌體的含量。三、基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測原理3.2適配體-腫瘤外泌體電化學(xué)傳感器的構(gòu)建3.2.1電極材料的選擇與修飾電極材料的選擇與修飾是構(gòu)建適配體-腫瘤外泌體電化學(xué)傳感器的關(guān)鍵步驟，直接影響傳感器的性能。在眾多電極材料中，金電極和碳電極是常用的選擇，它們各自具有獨(dú)特的特性，適用于不同的檢測需求。金電極具有良好的導(dǎo)電性，其電子遷移率較高，能夠快速傳遞電子，使得電化學(xué)反應(yīng)過程中的電子轉(zhuǎn)移更加高效。這一特性使得金電極在電化學(xué)檢測中能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的電信號，有利于提高檢測的靈敏度。金電極的化學(xué)穩(wěn)定性也非常出色，在多種化學(xué)環(huán)境下都能保持穩(wěn)定的性能，不易被氧化或腐蝕，從而保證了傳感器的長期穩(wěn)定性和可靠性。金電極表面易于進(jìn)行化學(xué)修飾，通過自組裝等方法，可以在其表面固定各種功能性分子，如適配體、納米材料等，為構(gòu)建高性能的電化學(xué)傳感器提供了便利。在構(gòu)建基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)傳感器時，金電極可以通過自組裝單分子層技術(shù)，將含有巰基的適配體固定在其表面。巰基與金原子之間能夠形成牢固的Au-S鍵，使得適配體能夠穩(wěn)定地固定在金電極表面，與腫瘤外泌體發(fā)生特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的檢測。碳電極同樣具有諸多優(yōu)點(diǎn)。它具有較高的比表面積，能夠提供更多的活性位點(diǎn)，增加與待測物質(zhì)的接觸面積，從而提高檢測的靈敏度。碳電極的表面性質(zhì)可以通過多種方法進(jìn)行調(diào)控，如氧化、還原、化學(xué)修飾等，使其能夠適應(yīng)不同的檢測需求。碳電極還具有良好的生物相容性，在生物樣品檢測中不會對生物分子的活性產(chǎn)生明顯影響，有利于保持腫瘤外泌體的完整性和生物活性。在腫瘤外泌體檢測中，常常會使用到納米材料修飾電極，以進(jìn)一步提升電極性能。納米材料由于其獨(dú)特的納米尺寸效應(yīng)，具有比表面積大、表面活性高、催化性能優(yōu)異等特點(diǎn)。納米金粒子具有良好的導(dǎo)電性和生物相容性，將其修飾在電極表面，可以顯著提高電極的電子傳遞速率，增強(qiáng)電化學(xué)反應(yīng)的活性。在適配體-腫瘤外泌體電化學(xué)傳感器中，納米金粒子修飾的電極可以加速適配體與腫瘤外泌體結(jié)合過程中的電子傳遞，從而提高檢測的靈敏度和響應(yīng)速度。研究表明，將納米金粒子修飾在玻碳電極表面，構(gòu)建的適配體傳感器對腫瘤外泌體的檢測限可降低至10^{-15}mol/L，比未修飾的玻碳電極傳感器靈敏度提高了數(shù)倍。碳納米管也是常用的納米修飾材料，它具有優(yōu)異的電學(xué)性能和力學(xué)性能，能夠增強(qiáng)電極的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性。碳納米管的高比表面積還可以增加適配體的固定量，進(jìn)一步提高傳感器的檢測性能。將多壁碳納米管修飾在金電極表面，然后固定適配體，構(gòu)建的傳感器對腫瘤外泌體的檢測具有良好的選擇性和穩(wěn)定性，能夠在復(fù)雜的生物樣品中準(zhǔn)確檢測腫瘤外泌體的含量。除了納米材料，一些聚合物也可用于電極修飾。聚多巴胺具有良好的粘附性和生物相容性，能夠在電極表面形成均勻的涂層，為適配體的固定提供穩(wěn)定的平臺。聚多巴胺修飾的電極可以通過與適配體之間的氫鍵、π-π堆積等相互作用，實(shí)現(xiàn)適配體的牢固固定，同時還能改善電極的表面性質(zhì)，提高傳感器的性能。3.2.2適配體固定化策略適配體固定化是構(gòu)建適配體-腫瘤外泌體電化學(xué)傳感器的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，合適的固定化策略能夠確保適配體在電極表面穩(wěn)定存在，并保持其與腫瘤外泌體的特異性結(jié)合能力。目前，常用的適配體固定化策略包括自組裝單分子層法、共價鍵合法、生物素-親和素法等。自組裝單分子層法是基于分子間的相互作用，使適配體在電極表面自發(fā)形成緊密排列的單分子層。以金電極為例，巰基化適配體可以通過Au-S鍵與金電極表面的金原子形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵，從而實(shí)現(xiàn)適配體的固定。這種方法操作簡單，能夠精確控制適配體在電極表面的密度和取向。通過調(diào)節(jié)巰基化適配體的濃度和固定時間，可以優(yōu)化適配體在電極表面的覆蓋度，提高傳感器的性能。自組裝單分子層法還能夠保持適配體的天然構(gòu)象，使其與腫瘤外泌體的結(jié)合能力不受影響。研究表明，采用自組裝單分子層法固定適配體的電化學(xué)傳感器，對腫瘤外泌體的檢測具有良好的特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確識別和檢測腫瘤外泌體。共價鍵合法是通過化學(xué)反應(yīng)在適配體和電極表面引入活性基團(tuán)，使兩者之間形成共價鍵，實(shí)現(xiàn)適配體的固定。常用的共價鍵合方法包括使用交聯(lián)劑如戊二醛等。首先在電極表面修飾含有氨基或羧基等活性基團(tuán)的物質(zhì)，然后利用戊二醛等交聯(lián)劑將適配體與電極表面的活性基團(tuán)連接起來。這種方法能夠使適配體與電極表面牢固結(jié)合，提高適配體的穩(wěn)定性。但在共價鍵合過程中，可能會對適配體的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生一定影響，因此需要優(yōu)化反應(yīng)條件，盡量減少對適配體的損傷。在使用共價鍵合法固定適配體時，需要控制交聯(lián)劑的用量和反應(yīng)時間，以確保適配體能夠保持良好的活性和特異性。生物素-親和素法利用生物素與親和素之間的高親和力特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)適配體的固定。首先將生物素標(biāo)記在適配體上，然后將親和素固定在電極表面，當(dāng)含有生物素標(biāo)記適配體的溶液與修飾有親和素的電極接觸時，生物素與親和素特異性結(jié)合，從而將適配體固定在電極表面。生物素-親和素之間的結(jié)合常數(shù)非常高，Kd可達(dá)10^{-15}mol/L，這種高親和力使得適配體能夠穩(wěn)定地固定在電極表面。該方法還具有通用性好的優(yōu)點(diǎn)，可以方便地將不同的適配體固定在電極表面。通過生物素-親和素法固定適配體的傳感器，在檢測腫瘤外泌體時表現(xiàn)出良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，能夠多次重復(fù)使用，且性能不會明顯下降。3.2.3信號轉(zhuǎn)換與放大機(jī)制在適配體-腫瘤外泌體電化學(xué)傳感器中，信號轉(zhuǎn)換與放大機(jī)制是實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測的關(guān)鍵。通過合理設(shè)計和利用這些機(jī)制，可以將適配體與腫瘤外泌體結(jié)合產(chǎn)生的微小信號轉(zhuǎn)化為可檢測的強(qiáng)信號，提高傳感器的檢測性能。酶催化反應(yīng)是常用的信號轉(zhuǎn)換與放大機(jī)制之一。辣根過氧化物酶（HRP）是一種廣泛應(yīng)用的酶，它能夠催化過氧化氫（H_2O_2）分解，產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移過程，從而產(chǎn)生電信號。在適配體-腫瘤外泌體檢測體系中，可以將HRP標(biāo)記在適配體上，當(dāng)適配體與腫瘤外泌體特異性結(jié)合后，加入底物H_2O_2，HRP催化H_2O_2分解，產(chǎn)生的電信號與腫瘤外泌體的含量相關(guān)。由于酶的催化作用具有放大效應(yīng)，一個HRP分子可以催化多個H_2O_2分子分解，從而實(shí)現(xiàn)信號的放大。通過檢測催化反應(yīng)產(chǎn)生的電流變化，可以實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的定量檢測。研究表明，基于HRP催化反應(yīng)的適配體電化學(xué)傳感器對腫瘤外泌體的檢測限可達(dá)到10^{-12}mol/L，具有較高的靈敏度。納米材料的獨(dú)特特性也可用于信號轉(zhuǎn)換與放大。金納米粒子不僅具有良好的導(dǎo)電性，還能夠增強(qiáng)電子傳遞效率。在適配體-腫瘤外泌體傳感器中，金納米粒子可以作為信號放大器。當(dāng)適配體與腫瘤外泌體結(jié)合后，金納米粒子可以加速電子在電極表面的轉(zhuǎn)移，使得電信號增強(qiáng)。金納米粒子還可以通過表面等離子體共振效應(yīng)，增強(qiáng)適配體與腫瘤外泌體之間的相互作用，進(jìn)一步提高檢測的靈敏度。研究發(fā)現(xiàn)，在適配體修飾的金電極表面引入金納米粒子后，傳感器對腫瘤外泌體的檢測靈敏度提高了一個數(shù)量級。核酸擴(kuò)增技術(shù)也是實(shí)現(xiàn)信號放大的有效手段。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種常用的核酸擴(kuò)增技術(shù)，它能夠在體外快速擴(kuò)增特定的核酸序列。在適配體-腫瘤外泌體檢測中，可以設(shè)計與腫瘤外泌體相關(guān)的核酸序列作為擴(kuò)增模板，利用PCR技術(shù)對其進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的核酸產(chǎn)物可以通過電化學(xué)方法進(jìn)行檢測，由于核酸序列的大量擴(kuò)增，使得檢測信號顯著增強(qiáng)。但PCR技術(shù)操作相對復(fù)雜，需要特定的儀器設(shè)備和反應(yīng)條件，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定限制。為了克服這些限制，一些等溫擴(kuò)增技術(shù)如環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）等也被應(yīng)用于適配體-腫瘤外泌體檢測中。LAMP技術(shù)在恒溫條件下即可進(jìn)行核酸擴(kuò)增，操作簡單，反應(yīng)速度快，能夠在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)信號的放大。RPA技術(shù)則具有反應(yīng)速度快、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠在常溫下快速擴(kuò)增核酸序列，為適配體-腫瘤外泌體的快速檢測提供了新的方法。四、檢測方法與應(yīng)用實(shí)例4.1基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測方法4.1.1一步法檢測一步法檢測是基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測中的一種高效方法，其核心在于利用多種適配體對腫瘤外泌體表面不同標(biāo)志物的特異性識別，實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的多標(biāo)志物同時檢測。以湖南大學(xué)王青教授和羊小海教授研究小組發(fā)表在Elsevier旗下AnalyticaChimicaActa雜志上的研究成果為例，該研究聚焦于乳腺癌外泌體的檢測，以HER2陽性乳腺癌細(xì)胞(SK-BR-3)來源的外泌體為模型靶標(biāo)。研究選用CD63、HER2和EpCAM三種核酸適配體作為識別探針，這些適配體分別對乳腺癌外泌體表面的CD63蛋白、HER2蛋白和EpCAM蛋白具有高度特異性。在實(shí)驗(yàn)操作中，研究人員將標(biāo)記了亞甲基藍(lán)(MB)的HER2適配體和標(biāo)記了二茂鐵(Fc)的EpCAM適配體分別修飾在金納米顆粒（AuNPs）上（DNA-AuNPs），構(gòu)建成信號探針。金納米顆粒具有高比表面積和良好的導(dǎo)電性，能夠增強(qiáng)適配體與腫瘤外泌體的結(jié)合能力，并促進(jìn)電子傳遞，提高檢測信號。然后，將目標(biāo)外泌體與上述兩種信號探針的混合物添加到CD63適配體修飾的金電極表面。此時，CD63適配體首先與外泌體表面的CD63蛋白特異性結(jié)合，將外泌體捕獲到電極表面。接著，HER2適配體和EpCAM適配體分別與外泌體表面的HER2蛋白和EpCAM蛋白特異性結(jié)合，使得DNA-AuNPs被捕獲到電極上。通過這種多適配體的特異性識別作用，實(shí)現(xiàn)了對乳腺癌外泌體的精準(zhǔn)捕獲和固定。最后，通過檢測MB和Fc的電化學(xué)信號，即可在同一電極上一步實(shí)現(xiàn)乳腺癌外泌體的多重分析。亞甲基藍(lán)和二茂鐵是常用的電化學(xué)活性分子，它們在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)時會產(chǎn)生特征性的電流信號。當(dāng)HER2適配體和EpCAM適配體與外泌體結(jié)合并將DNA-AuNPs固定在電極表面后，MB和Fc的氧化還原反應(yīng)受到影響，其產(chǎn)生的電流信號與外泌體的含量密切相關(guān)。通過檢測電流信號的變化，就能夠定量分析乳腺癌外泌體的含量。該方法展現(xiàn)出了極高的靈敏度，可檢測低至3.4??10^3particles/mL的SK-BR-3外泌體。多探針識別策略提高了檢測的準(zhǔn)確性，可用于不同細(xì)胞亞型的乳腺癌外泌體的區(qū)分，對乳腺癌的早期篩查和預(yù)后具有潛在的應(yīng)用價值。4.1.2三明治夾心檢測法三明治夾心檢測法是基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測中另一種常用的方法，其原理是利用兩種或多種適配體，與腫瘤外泌體形成夾心結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的檢測。杜克大學(xué)黃俊教授團(tuán)隊在這方面開展了深入研究，他們基于雜交鏈反應(yīng)放大策略構(gòu)建了微適配體電化學(xué)生物傳感器用于外泌體檢測。該研究成果發(fā)表在Microsystems&Nanoengineering上。在該研究中，團(tuán)隊利用抗EpCAM適配體和CD63適配體來實(shí)現(xiàn)對腫瘤外泌體的特異性捕獲和檢測。首先，制備生物素標(biāo)記的HCR標(biāo)記外泌體?？笶pCAM適配體修飾在HCR產(chǎn)物上，用于特異性選擇腫瘤外泌體。這里的雜交鏈反應(yīng)（HCR）是一種重要的信號放大策略，它能夠在無需酶催化的條件下，通過兩條發(fā)夾狀DNA探針的交替雜交，形成長鏈的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)信號的放大。當(dāng)HCR-外泌體樣品加入微流體室時，微電極上的CD63適配體捕獲HCR-外泌體，形成了由CD63、外泌體和抗EpCAM嵌入的HCR產(chǎn)物組成的夾心結(jié)構(gòu)。為了實(shí)現(xiàn)信號的檢測，團(tuán)隊利用生物素與親和素-HRP的特異性結(jié)合。生物素標(biāo)記的HCR可以與親和素-HRP結(jié)合，而HRP能夠催化電極表面TMB/H_2O_2之間的反應(yīng)，從而產(chǎn)生電流信號。由于親和素-HRP與生物素的特異性識別，通過酶反應(yīng)產(chǎn)生的電流信號與HCR產(chǎn)物上HRP的量和外泌體濃度呈現(xiàn)出正相關(guān)。當(dāng)外泌體濃度增加時，更多的HCR-外泌體被CD63適配體捕獲，進(jìn)而結(jié)合更多的親和素-HRP，催化更多的TMB/H_2O_2反應(yīng)，產(chǎn)生更強(qiáng)的電流信號。通過檢測電流信號的變化，就能夠準(zhǔn)確地測定外泌體的濃度。在優(yōu)化的最佳條件下，該傳感器對不同濃度（1??10^3、1??10^4、1??10^5、1??10^6、2.5??10^6和1.0??10^7外泌體/mL）的MCF-7衍生外泌體進(jìn)行分析，結(jié)果顯示隨著外泌體濃度從2.5??10^3增加到2.5??10^6外泌體/mL，測得的電流值顯著增加。當(dāng)濃度從2.5??10^6進(jìn)一步增加到1.0??10^7外泌體/mL時，電流值僅略微增加，這是因?yàn)閭鞲衅鞯姆治鑫锊东@能力逐漸達(dá)到飽和。電流值信號與外泌體濃度的對數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R）為0.9910，線性回歸方程為Ic=-0.08305logc-0.8012(R^2=0.9910)，其中Ic代表電流強(qiáng)度，c代表外泌體濃度。該傳感器對EpCAM陽性外泌體具有高度特異性，只有來自EpCAM陽性細(xì)胞系的外泌體才能產(chǎn)生高電流響應(yīng)，而EpCAM陰性細(xì)胞系的外泌體產(chǎn)生的電流值要低得多。該生物傳感器還具有良好的重復(fù)性，在相同條件下制備并使用該適體傳感器來檢測濃度為2.0??10^6外泌體/mL的EpCAM陽性外泌體，從五個不同傳感器測得的電流值具有1.86%的小相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。4.1.3競爭檢測法競爭檢測法是基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測中的一種獨(dú)特方法，其原理是在檢測體系中，腫瘤外泌體與標(biāo)記的競爭物競爭結(jié)合適配體，通過檢測信號變化來確定外泌體的含量。在這種檢測方法中，首先需要選擇合適的競爭物，競爭物通常是與腫瘤外泌體具有相似結(jié)構(gòu)或能夠與適配體特異性結(jié)合的物質(zhì)。競爭物會被標(biāo)記上電化學(xué)活性分子，以便后續(xù)檢測。當(dāng)將適配體修飾在電極表面后，將含有腫瘤外泌體和標(biāo)記競爭物的混合溶液加入到檢測體系中。此時，腫瘤外泌體和標(biāo)記競爭物會同時競爭與電極表面的適配體結(jié)合。如果腫瘤外泌體的濃度較高，那么它與適配體結(jié)合的概率就會增大，從而減少標(biāo)記競爭物與適配體的結(jié)合。反之，如果腫瘤外泌體的濃度較低，標(biāo)記競爭物與適配體結(jié)合的比例就會增加。由于標(biāo)記競爭物上標(biāo)記了電化學(xué)活性分子，其與適配體的結(jié)合情況會影響電極表面的電化學(xué)信號。通過檢測電化學(xué)信號的變化，就可以推斷出腫瘤外泌體與標(biāo)記競爭物的競爭結(jié)合情況，進(jìn)而確定腫瘤外泌體的含量。在實(shí)際應(yīng)用中，常用的電化學(xué)活性分子標(biāo)記包括熒光素、量子點(diǎn)、酶等。以酶標(biāo)記為例，若競爭物標(biāo)記了辣根過氧化物酶（HRP），當(dāng)HRP標(biāo)記的競爭物與適配體結(jié)合后，加入底物H_2O_2和顯色底物，HRP會催化底物反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化或電流變化。通過檢測顏色變化的程度或電流的大小，就可以判斷腫瘤外泌體的含量。如果腫瘤外泌體濃度高，與適配體結(jié)合多，HRP標(biāo)記的競爭物結(jié)合少，催化反應(yīng)產(chǎn)生的信號就弱；反之，信號就強(qiáng)。通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以根據(jù)檢測信號準(zhǔn)確地定量腫瘤外泌體的含量。4.2實(shí)際樣本檢測應(yīng)用實(shí)例4.2.1乳腺癌外泌體檢測湖南大學(xué)王青教授和羊小海教授研究小組基于金納米顆粒（AuNPs）輔助的電化學(xué)策略，開發(fā)了一種用于乳腺癌外泌體一步多重分析的電化學(xué)適配體傳感器。臨床上乳腺癌主要分為三種亞型，其中人表皮生長因子受體-2（HER2）陽性乳腺癌患者的腫瘤細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險相對較大，預(yù)后更差。因此，該研究以HER2陽性乳腺癌細(xì)胞(SK-BR-3)來源的外泌體為模型靶標(biāo)，并以CD63、HER2和EpCAM三種核酸適配體為識別探針來實(shí)現(xiàn)對乳腺癌外泌體的精準(zhǔn)檢測。在實(shí)際樣本檢測中，該方法展現(xiàn)出了卓越的性能。從檢測靈敏度來看，可檢測低至3.4??10^3particles/mL的SK-BR-3外泌體，這一靈敏度使得在乳腺癌早期，當(dāng)外泌體含量較低時也能夠被準(zhǔn)確檢測到。對于乳腺癌的早期篩查，傳統(tǒng)檢測方法往往因靈敏度不足而難以發(fā)現(xiàn)早期病變，而該基于適配體的電化學(xué)檢測方法能夠檢測到極少量的乳腺癌外泌體，大大提高了早期篩查的準(zhǔn)確性和可靠性。在對早期乳腺癌患者的血液樣本檢測中，成功檢測到了低豐度的乳腺癌外泌體，為早期診斷提供了有力的依據(jù)。在亞型區(qū)分方面，通過多探針識別策略，該傳感器提高了檢測的準(zhǔn)確性，可用于不同細(xì)胞亞型的乳腺癌外泌體的區(qū)分。不同亞型的乳腺癌具有不同的生物學(xué)行為和治療反應(yīng)，準(zhǔn)確區(qū)分亞型對于制定個性化的治療方案至關(guān)重要。該研究通過檢測不同亞型乳腺癌患者血液樣本中的外泌體，利用三種適配體對不同標(biāo)志物的特異性識別，能夠準(zhǔn)確判斷外泌體來源于哪種亞型的乳腺癌細(xì)胞。對于HER2陽性和HER2陰性的乳腺癌外泌體，傳感器能夠根據(jù)HER2適配體與外泌體的結(jié)合情況，清晰地區(qū)分兩種亞型，為臨床醫(yī)生選擇合適的治療藥物和治療方案提供了關(guān)鍵信息。在預(yù)后監(jiān)測中，乳腺癌外泌體的檢測也具有重要價值。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，而乳腺癌外泌體能夠反映腫瘤細(xì)胞的活性和狀態(tài)。通過定期檢測患者血液中的乳腺癌外泌體含量和標(biāo)志物變化，可以實(shí)時監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況。在對乳腺癌患者術(shù)后的隨訪過程中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)患者血液中的乳腺癌外泌體含量升高，且某些標(biāo)志物的表達(dá)發(fā)生變化時，往往預(yù)示著腫瘤可能復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。這使得醫(yī)生能夠及時調(diào)整治療方案，采取更積極的治療措施，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。4.2.2肺癌外泌體檢測中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所與中科院重慶綠色智能技術(shù)研究院研究人員開發(fā)的基于二維過渡金屬碳/氮化物MXene材料的新型電化學(xué)傳感器，在肺癌外泌體檢測中取得了顯著成果。該研究通過真空輔助的方法制備二維MXene平面膜，并利用電化學(xué)外加電位作用在二維膜表面負(fù)載金（Au）納米陣列，得到Au-MXene二維復(fù)合膜。一方面，該方法利用了MXene二維材料構(gòu)筑成膜，能夠負(fù)載大量的上皮細(xì)胞粘附分子蛋白適配體，特異性識別捕獲外泌體；另一方面，通過超速離心分離純化肺癌細(xì)胞（A549）分泌的外泌體，對其進(jìn)行溶酶體相關(guān)膜蛋白適配體修飾，能夠填充復(fù)合膜表面未結(jié)合的活性位點(diǎn)，進(jìn)一步放大檢測信號。在肺癌早期診斷中，該傳感器具有重要意義。肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，早期診斷對于提高患者的生存率至關(guān)重要。傳統(tǒng)的肺癌診斷方法，如影像學(xué)檢查和組織活檢，存在一定的局限性。影像學(xué)檢查在肺癌早期可能無法檢測到微小的腫瘤病變，而組織活檢屬于侵入性檢查，對患者造成的創(chuàng)傷較大。該基于適配體的電化學(xué)傳感器能夠通過檢測肺癌患者體液中的外泌體，實(shí)現(xiàn)肺癌的早期診斷。在對肺癌高危人群的篩查中，該傳感器能夠檢測到早期肺癌患者血液中極少量的肺癌外泌體，為早期診斷提供了新的途徑。對于肺癌患者的病情監(jiān)測，該傳感器也發(fā)揮著重要作用。肺癌的病情發(fā)展復(fù)雜多變，及時了解病情變化對于調(diào)整治療方案至關(guān)重要。通過定期檢測肺癌患者血液或其他體液中的外泌體，能夠?qū)崟r監(jiān)測肺癌的發(fā)展情況。當(dāng)肺癌患者的病情惡化時，外泌體的含量和組成往往會發(fā)生變化，傳感器能夠準(zhǔn)確檢測到這些變化，為醫(yī)生判斷病情提供依據(jù)。在肺癌患者接受化療或放療期間，通過檢測外泌體的變化，可以評估治療效果，及時發(fā)現(xiàn)治療抵抗等問題，從而調(diào)整治療方案，提高治療效果。在療效評估方面，該傳感器同樣具有優(yōu)勢。肺癌患者接受治療后，需要準(zhǔn)確評估治療效果，以確定下一步的治療方案。傳統(tǒng)的療效評估方法主要依賴于影像學(xué)檢查和腫瘤標(biāo)志物檢測，但這些方法存在一定的滯后性。該基于適配體的電化學(xué)傳感器能夠通過檢測外泌體的變化，快速、準(zhǔn)確地評估肺癌治療的療效。在肺癌患者接受靶向治療后，傳感器可以檢測到外泌體中與靶向治療相關(guān)的標(biāo)志物的變化，從而判斷治療是否有效。如果外泌體中相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)降低，說明靶向治療有效；反之，則可能需要調(diào)整治療方案。4.2.3其他腫瘤類型外泌體檢測除了乳腺癌和肺癌外泌體檢測，基于適配體的電化學(xué)分析檢測技術(shù)在肝癌、結(jié)腸癌等其他腫瘤外泌體檢測中也展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。在肝癌外泌體檢測中，廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院“微納生物分析團(tuán)隊”設(shè)計了“自下而上”的信號增益策略，協(xié)同高曲率納米結(jié)構(gòu)和DNA引物交換反應(yīng)（PER），研制外泌體電化學(xué)傳感器（NPExo），用于肝癌外泌體的超靈敏檢測。該工作以低成本印刷碳電極的納米孔隙為模板，運(yùn)用多尺度界面工程原理構(gòu)建了穩(wěn)定性高、導(dǎo)電性好的高曲率無機(jī)金屬納米結(jié)構(gòu)，調(diào)控生物傳感界面增強(qiáng)對靶標(biāo)外泌體的捕獲效能。進(jìn)一步利用外泌體磷脂雙分子層引入PER級聯(lián)信號擴(kuò)增模塊，從而自下而上增強(qiáng)檢測信號，實(shí)現(xiàn)肝癌外泌體高效捕獲和超靈敏檢測，并應(yīng)用于檢測臨床樣本，成功區(qū)分健康人群與肝癌患者。這一技術(shù)的應(yīng)用，為肝癌的早期診斷和病情監(jiān)測提供了新的手段。在早期肝癌的診斷中，能夠檢測到低豐度的肝癌外泌體，提高了早期診斷的準(zhǔn)確性。在對肝癌患者的治療過程中，通過檢測外泌體的變化，可以實(shí)時監(jiān)測治療效果，為調(diào)整治療方案提供依據(jù)。延邊大學(xué)金明實(shí)教授課題組開發(fā)的基于二氧化鈦納米管陣列薄膜的新型電化學(xué)生物傳感器，在結(jié)腸癌外泌體檢測中表現(xiàn)出色。該傳感器無需修飾抗體或適配體，利用TiO2NTAs表面Lewis酸位點(diǎn)與外泌體磷脂雙分子層上磷酸基團(tuán)之間的高親和相互作用和高生物相容性捕獲外泌體，同時略大于外泌體尺寸的納米管有效排除大尺寸微囊泡和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾，其高度有序的納米管陣列結(jié)構(gòu)使其電學(xué)性質(zhì)對表面吸附非常敏感，從而提高了傳感器的靈敏度。研究分別利用Huh7（肝癌）、HCT116（結(jié)腸癌）和NCM460（正常結(jié)腸上皮細(xì)胞）三種細(xì)胞系衍生的外泌體驗(yàn)證了該傳感器用于外泌體檢測的優(yōu)異性能。結(jié)果表明，三種不同來源外泌體標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性檢測范圍均為5??10^1???1??10^7particles/μL，R^2均達(dá)到了0.9960以上，且方法檢出限（LOD）均低于12.7particles/μL。該傳感器在檢測結(jié)腸癌患者血清中的外泌體時，能夠準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)腸癌患者與健康人群，為結(jié)腸癌的診斷和病情監(jiān)測提供了有力的支持。在對結(jié)腸癌患者的臨床檢測中，通過檢測外泌體的含量變化，可以判斷腫瘤的發(fā)展階段和治療效果，有助于制定個性化的治療方案。五、優(yōu)勢與挑戰(zhàn)分析5.1技術(shù)優(yōu)勢5.1.1高靈敏度與特異性相較于傳統(tǒng)的腫瘤外泌體檢測技術(shù)，基于適配體的電化學(xué)分析檢測技術(shù)在靈敏度與特異性方面具有顯著優(yōu)勢。傳統(tǒng)的免疫印跡法（WesternBlotting）檢測腫瘤外泌體時，需要對樣本進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理和蛋白質(zhì)分離步驟，檢測過程繁瑣且耗時較長。由于抗體的特異性有限，在復(fù)雜的生物樣本中容易出現(xiàn)非特異性結(jié)合，導(dǎo)致檢測的靈敏度和特異性受到影響。免疫印跡法對于低豐度的腫瘤外泌體檢測效果不佳，檢測限通常在10^{-9}mol/L級別，難以滿足早期癌癥診斷中對低含量腫瘤外泌體檢測的需求。而基于適配體的電化學(xué)分析檢測技術(shù)，憑借適配體與腫瘤外泌體表面標(biāo)志物的高特異性結(jié)合能力，能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤外泌體的精準(zhǔn)識別。適配體通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選得到，其獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)使其能夠與靶標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合，這種特異性結(jié)合能力甚至可以區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的分子。以針對EpCAM的適配體為例，它能夠準(zhǔn)確識別腫瘤外泌體表面的EpCAM蛋白，而對其他非相關(guān)蛋白幾乎沒有結(jié)合作用，有效減少了非特異性信號的干擾，提高了檢測的特異性。在靈敏度方面，電化學(xué)檢測技術(shù)本身具有高靈敏度的特點(diǎn)，能夠檢測到微小的電流或電位變化。將適配體與電化學(xué)檢測相結(jié)合，通過信號轉(zhuǎn)換與放大機(jī)制，進(jìn)一步提高了檢測靈敏度。在一些研究中，利用金納米粒子增強(qiáng)電子傳遞效率，結(jié)合酶催化反應(yīng)的信號放大作用，基于適配體的電化學(xué)傳感器對腫瘤外泌體的檢測限可低至10^{-15}mol/L，比傳統(tǒng)免疫印跡法的檢測限降低了多個數(shù)量級。這種高靈敏度使得該技術(shù)能夠檢測到極低含量的腫瘤外泌體，為癌癥的早期診斷提供了有力支持。5.1.2快速檢測與實(shí)時監(jiān)測基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測技術(shù)在檢測速度上具有明顯優(yōu)勢。傳統(tǒng)的外泌體檢測方法，如超速離心法，需要較長的離心時間來分離外泌體，整個檢測過程可能需要數(shù)小時甚至數(shù)天。而基于適配體的電化學(xué)檢測方法，操作相對簡便快捷。適配體與腫瘤外泌體的結(jié)合反應(yīng)通常在較短時間內(nèi)即可完成，一般在幾分鐘到幾十分鐘之間。電化學(xué)檢測過程也非常迅速，通過電化學(xué)工作站可以實(shí)時讀取檢測信號，整個檢測過程可以在1小時內(nèi)完成。在臨床緊急情況下，這種快速檢測能力能夠?yàn)獒t(yī)生提供及時的診斷信息，有助于患者的及時治療。該技術(shù)還具備實(shí)時監(jiān)測腫瘤外泌體的能力。通過將適配體修飾的電極置于含有腫瘤外泌體的溶液中，利用電化學(xué)阻抗譜（EIS）或循環(huán)伏安法（CV）等技術(shù)，可以實(shí)時監(jiān)測適配體與腫瘤外泌體的結(jié)合過程以及電極表面的電化學(xué)變化。當(dāng)腫瘤外泌體與適配體結(jié)合時，電極表面的電荷分布和電子傳遞特性會發(fā)生改變，這些變化會實(shí)時反映在電化學(xué)信號中。通過連續(xù)監(jiān)測電化學(xué)信號的變化，可以實(shí)時了解腫瘤外泌體的濃度變化以及其與適配體的相互作用動態(tài)，為研究腫瘤的發(fā)展進(jìn)程和治療效果提供實(shí)時數(shù)據(jù)支持。在腫瘤治療過程中，可以實(shí)時監(jiān)測患者體液中腫瘤外泌體的含量變化，及時評估治療效果，調(diào)整治療方案。5.1.3操作簡便與成本效益從操作流程來看，基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測技術(shù)相對簡便。傳統(tǒng)的外泌體檢測方法，如免疫沉淀法，需要使用大量的抗體和復(fù)雜的免疫反應(yīng)步驟，操作過程繁瑣，對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高。而該電化學(xué)檢測技術(shù)，適配體的固定和檢測過程相對簡單。通過自組裝單分子層法、共價鍵合法或生物素-親和素法等方法，可以將適配體穩(wěn)定地固定在電極表面，這些固定方法操作相對容易掌握。在檢測時，只需將修飾有適配體的電極浸入含有腫瘤外泌體的樣本溶液中，然后通過電化學(xué)工作站進(jìn)行檢測即可，無需復(fù)雜的樣本預(yù)處理和反應(yīng)步驟。在儀器設(shè)備方面，基于適配體的電化學(xué)分析檢測技術(shù)所需的儀器相對簡單，主要是電化學(xué)工作站等常規(guī)電化學(xué)儀器。這些儀器價格相對較低，維護(hù)成本也不高，易于在普通實(shí)驗(yàn)室和臨床檢測機(jī)構(gòu)中普及。相比之下，一些傳統(tǒng)的腫瘤外泌體檢測技術(shù)，如質(zhì)譜分析法，需要昂貴的質(zhì)譜儀等大型儀器設(shè)備，儀器購置成本高，維護(hù)和操作也較為復(fù)雜，限制了其在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的應(yīng)用。從試劑成本來看，適配體的合成成本相對較低。適配體是通過化學(xué)合成得到的單鏈DNA或RNA分子，其合成過程相對簡單，成本可控。與傳統(tǒng)的抗體相比，適配體的生產(chǎn)周期短，不需要動物免疫等復(fù)雜過程，進(jìn)一步降低了成本。在檢測過程中，所需的試劑種類相對較少，主要是一些用于電化學(xué)檢測的電解質(zhì)溶液和信號放大試劑等，這些試劑價格相對便宜?；谶m配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測技術(shù)在操作簡便性和成本效益方面具有明顯優(yōu)勢，具有良好的臨床應(yīng)用前景。5.2面臨的挑戰(zhàn)5.2.1生物樣品復(fù)雜性的干擾生物樣品的復(fù)雜性是基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測技術(shù)面臨的一大挑戰(zhàn)。實(shí)際生物樣品，如血液、尿液等，成分極為復(fù)雜，除了腫瘤外泌體，還包含大量的其他生物分子和細(xì)胞成分。在血液中，除了腫瘤外泌體，還有紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等各種血細(xì)胞，以及白蛋白、球蛋白、纖維蛋白原等多種蛋白質(zhì)，還有各種代謝產(chǎn)物、離子等。這些成分可能會與適配體發(fā)生非特異性結(jié)合，干擾適配體與腫瘤外泌體的特異性識別，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。一些血清中的蛋白質(zhì)可能會通過靜電作用或疏水作用與適配體結(jié)合，占據(jù)適配體的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致適配體無法有效地與腫瘤外泌體結(jié)合。生物樣品中的雜質(zhì)還可能會影響電化學(xué)信號的檢測，導(dǎo)致背景信號增強(qiáng)，降低檢測的靈敏度和信噪比。為了應(yīng)對生物樣品復(fù)雜性的干擾，研究人員采取了多種策略。在樣品預(yù)處理方面，優(yōu)化外泌體的分離和純化方法至關(guān)重要。超速離心法是常用的外泌體分離方法，但該方法存在操作繁瑣、耗時較長、分離效率較低等問題。為了提高分離效率，一些改進(jìn)的超速離心方法被提出，如差速超速離心結(jié)合密度梯度離心法。這種方法首先通過差速超速離心初步分離外泌體，然后利用密度梯度離心進(jìn)一步純化外泌體，能夠有效去除生物樣品中的雜質(zhì)，提高外泌體的純度。免疫磁珠分離法也是一種常用的外泌體分離方法，它利用抗體與外泌體表面標(biāo)志物的特異性結(jié)合，通過磁珠將外泌體分離出來。為了提高免疫磁珠分離法的特異性，研究人員可以選擇針對腫瘤外泌體特異性標(biāo)志物的抗體，減少與其他生物分子的非特異性結(jié)合。在適配體設(shè)計與修飾方面，也可以采取一些措施來提高其抗干擾能力。對適配體進(jìn)行化學(xué)修飾是一種有效的方法，如在適配體的末端引入一些屏蔽基團(tuán)，能夠減少適配體與非靶標(biāo)物質(zhì)的非特異性結(jié)合。在適配體的5'端或3'端引入甲基化修飾，可以改變適配體的電荷分布和空間結(jié)構(gòu)，降低其與血清中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的非特異性結(jié)合。合理設(shè)計適配體的序列和結(jié)構(gòu)，提高其與腫瘤外泌體的結(jié)合親和力和特異性，也能夠增強(qiáng)其抗干擾能力。通過計算機(jī)輔助設(shè)計，優(yōu)化適配體的堿基序列和二級結(jié)構(gòu)，使其與腫瘤外泌體表面標(biāo)志物的結(jié)合更加緊密和特異性，減少與其他生物分子的交叉反應(yīng)。5.2.2適配體的穩(wěn)定性和通用性問題適配體的穩(wěn)定性和通用性是基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測技術(shù)應(yīng)用中需要解決的重要問題。適配體在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性存在一定差異，其結(jié)構(gòu)和功能可能會受到溫度、pH值、離子強(qiáng)度等因素的影響。在高溫環(huán)境下，適配體的二級和三級結(jié)構(gòu)可能會發(fā)生改變，導(dǎo)致其與腫瘤外泌體的結(jié)合能力下降。當(dāng)溫度升高到一定程度時，適配體的堿基對之間的氫鍵會被破壞，使其原本的發(fā)夾、假結(jié)等結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋，從而影響適配體與腫瘤外泌體表面標(biāo)志物的特異性結(jié)合。在不同pH值的溶液中，適配體的電荷分布和空間構(gòu)象也會發(fā)生變化，進(jìn)而影響其穩(wěn)定性和結(jié)合能力。在酸性條件下，適配體中的某些堿基可能會發(fā)生質(zhì)子化，改變其電荷性質(zhì)，導(dǎo)致適配體與腫瘤外泌體的結(jié)合親和力降低。適配體針對不同腫瘤類型或同一腫瘤不同亞型的通用性也存在局限。不同腫瘤類型的外泌體表面標(biāo)志物存在差異，即使是同一腫瘤的不同亞型，其外泌體表面標(biāo)志物的表達(dá)水平和種類也可能不同。一種針對乳腺癌外泌體表面EpCAM的適配體，可能對其他類型腫瘤外泌體的檢測效果不佳，因?yàn)槠渌[瘤外泌體表面EpCAM的表達(dá)水平可能較低或不表達(dá)。同一腫瘤的不同亞型，如乳腺癌的luminal型、HER2過表達(dá)型和三陰型，其外泌體表面除了EpCAM外，還可能存在其他特異性標(biāo)志物，單一的適配體難以同時對這些不同亞型的腫瘤外泌體進(jìn)行有效檢測。為了解決適配體的穩(wěn)定性問題，可以采用多種修飾策略?；瘜W(xué)修飾是常用的方法之一，如在適配體中引入鎖核酸（LNA）、肽核酸（PNA）等修飾基團(tuán)。LNA是一種經(jīng)過修飾的核酸類似物，其核糖的2'-O和4'-C原子通過亞甲基橋連接形成剛性的雙環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)適配體的穩(wěn)定性。研究表明，將LNA修飾引入適配體中，可以提高適配體對核酸酶的抗性，使其在血清等復(fù)雜生物樣品中保持穩(wěn)定。PNA則是一種以中性肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代核糖磷酸二酯鍵骨架的核酸類似物，它具有良好的穩(wěn)定性和抗核酸酶降解能力。通過將PNA與適配體結(jié)合，可以增強(qiáng)適配體的穩(wěn)定性，提高其在不同環(huán)境下的性能。為了提高適配體的通用性，可以篩選針對多種腫瘤外泌體共同標(biāo)志物的適配體，或者采用多適配體聯(lián)合檢測策略。通過對多種腫瘤外泌體的分析，發(fā)現(xiàn)一些在多種腫瘤外泌體中均有表達(dá)的標(biāo)志物，如CD63、CD81等四跨膜蛋白。針對這些共同標(biāo)志物篩選適配體，可以提高適配體對不同腫瘤類型外泌體的檢測能力。采用多適配體聯(lián)合檢測策略，同時使用針對不同腫瘤外泌體標(biāo)志物的適配體進(jìn)行檢測，能夠更全面地覆蓋不同腫瘤類型和亞型的外泌體。在檢測乳腺癌外泌體時，可以同時使用針對EpCAM、HER2和CD63的適配體，通過多適配體的協(xié)同作用，提高對不同亞型乳腺癌外泌體的檢測準(zhǔn)確性和通用性。5.2.3檢測設(shè)備與技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化建立統(tǒng)一的檢測設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)、操作規(guī)范和質(zhì)量控制體系對于基于適配體的腫瘤外泌體電化學(xué)分析檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用和推廣至關(guān)重要。目前，市場上的電化學(xué)檢測設(shè)備種類繁多，不同廠家生產(chǎn)的設(shè)備在性能、靈敏度、準(zhǔn)確性等方面存在差異。不同品牌的電化學(xué)工作站，其檢測精度、噪聲水平、信號采集速度等參數(shù)各不相同，這使得不同實(shí)驗(yàn)室之間的檢測結(jié)果難以直接比較和驗(yàn)證。由于缺乏統(tǒng)一的操作規(guī)范，不同實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行適配體修飾電極的制備、樣品檢測等操作時，可能會存在操作差異，導(dǎo)致檢測結(jié)果的重復(fù)性和可靠性受到影響。在適配體固定化過程中，不同實(shí)驗(yàn)人員對固定化時間、溫度、溶液濃度等條件的控制不一致，會導(dǎo)致適配體在電極表面的固定量和固定方式不同，從而影響傳感器的性能和檢測結(jié)果。質(zhì)量控制體系的不完善也會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在檢測過程中，缺乏有效的質(zhì)量控制指標(biāo)和方法，難以判斷檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。沒有對檢測過程中的背景信號、噪聲水平、電極穩(wěn)定性等進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和控制，可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。在進(jìn)行腫瘤外泌體檢測時，如果電極表面發(fā)生污染或損壞，而沒有及時發(fā)現(xiàn)和處理，會導(dǎo)致檢測信號異常，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了實(shí)現(xiàn)檢測設(shè)備與技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，需要從多個方面入手。制定統(tǒng)一的檢測設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)是關(guān)鍵。相關(guān)部門和行業(yè)協(xié)會應(yīng)組織專家，根據(jù)電化學(xué)檢測技術(shù)的原理和特點(diǎn)，制定統(tǒng)一的設(shè)備性能指標(biāo)、技術(shù)參數(shù)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。明確規(guī)定電化學(xué)工作站的檢測精度、噪聲水平、線性范圍、穩(wěn)定性等關(guān)鍵指標(biāo)，確保不同廠家生產(chǎn)的設(shè)備在性能上具有可比性。制定統(tǒng)一的操作規(guī)范，對適配體修飾電極的制備、樣