安宮牛黃丸微生物限度檢查法適用性試驗(yàn)?zāi)夸汿OC\o"1-1"\h\u中文摘要 ②1ml/皿皿1皿2皿1皿2白色念珠菌-10044364237100-200黑曲霉-1005852556692-200由表6可知，黑曲霉、白色念珠菌的實(shí)驗(yàn)組菌回收率均在合理范圍內(nèi)，因此其總數(shù)測(cè)定可采用稀釋劑稀釋法。2.3控制菌檢查驗(yàn)證方法及結(jié)果記錄2.3.1大腸埃希菌的檢查陽(yáng)性試驗(yàn)組：取10ml的2.2.1項(xiàng)下的供試液，將其加進(jìn)200ml的TBS（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）中向其添加含≤100cfu的大腸埃希菌，在30℃~35℃溫度下培養(yǎng)18~24h取1ml的上述培養(yǎng)物，將其接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基，在42℃~44℃溫度下進(jìn)行24~48h的培養(yǎng)采用劃線接種法，將上述麥康凱液體培養(yǎng)物在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行接種，并在30℃~35℃溫度下進(jìn)行18~72h的培養(yǎng)，依照大腸埃希菌檢查方法繼續(xù)檢查。供試品對(duì)照組:取10ml的2.2.1項(xiàng)下供試液，將其加進(jìn)200ml的TSB（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）中以稀釋液代替菌液，同陽(yáng)性試驗(yàn)組操作。陰性對(duì)照組：為了替代2.2.1項(xiàng)下的供試液，取10ml稀釋液操作與陽(yáng)性試驗(yàn)組的操作方法一致，作為陰性對(duì)照。表7大腸埃希菌檢查驗(yàn)證方法及結(jié)果記錄培養(yǎng)溫度（℃）培養(yǎng)時(shí)間（h）陽(yáng)性試驗(yàn)組供試品對(duì)照組陰性對(duì)照組麥康凱液體培養(yǎng)基42℃~44℃24h（+）（-）（-）麥康凱瓊脂培養(yǎng)基30℃~35℃24h（+）（-）（-）其他試驗(yàn)（大腸桿菌IMVC生化鑒定盒）（+）結(jié)果已檢出未檢出未檢出由表7可知，大腸埃希菌的供試品對(duì)照組與陰性對(duì)照組的結(jié)果一致，均為陰性，陽(yáng)性試驗(yàn)組則為陽(yáng)性，因此可以采用培養(yǎng)基稀釋法來(lái)進(jìn)行對(duì)大腸埃希菌的檢驗(yàn)。2.3.2耐膽鹽革蘭陰性菌陽(yáng)性試驗(yàn)組：將2.2.1項(xiàng)下供試品的1：10，1：100，1：1000三個(gè)稀釋級(jí)各吸取1ml至六支分別裝有10ml的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基管中各自加入含≤100cfu的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌各三支，在30℃~35℃溫度下培養(yǎng)24~48h分別將其劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，在30℃~35℃溫度下培養(yǎng)18~24h，按照耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法繼續(xù)檢查。供試品對(duì)照組：吸取2.2.1項(xiàng)下的供試液，以稀釋液代替菌液，按照陽(yáng)性試驗(yàn)組的操作，進(jìn)行定性試驗(yàn)和定量試驗(yàn)。陰性對(duì)照組：用稀釋液代替2.2.1項(xiàng)下供試液，同陽(yáng)性試驗(yàn)組的操作，在30℃~35℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，作為陰性對(duì)照。表8耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查驗(yàn)證方法以及結(jié)果記錄培養(yǎng)時(shí)間陽(yáng)性試驗(yàn)組供試品對(duì)照組陰性對(duì)照大腸埃希菌銅綠假單胞菌腸道菌增菌液體培養(yǎng)基24h10-110-210-310-110-210-310-110-210-3（-）（+）（+）（+）（+）（+）（+）（-）（-）（-）紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板24h10-110-210-310-110-210-310-110-210-3（-）（+）（+）（+）（+）（+）（+）（-）（-）（-）結(jié)果已檢出已檢出未檢出未檢出由表8可知，耐膽鹽革蘭陰性菌的供試品對(duì)照組與陰性對(duì)照組的結(jié)果一致，均為未檢出，陽(yáng)性試驗(yàn)組則為已檢出。由此可知，耐膽鹽革蘭陰性菌的檢驗(yàn)可以采用常規(guī)法。2.3.3沙門菌陽(yáng)性試驗(yàn)組：將10g供試品加入300ml的TSB（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）中加入含≤100cfu的沙門菌，在30℃~35℃下培養(yǎng)18~24h吸取0.1ml上述培養(yǎng)物接種至10mlRV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基，在30℃~35℃下培養(yǎng)18~24h，吸取少量上述培養(yǎng)物于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，采用劃線接種法，在30℃~35℃下培養(yǎng)18~24h，按照沙門菌的檢查方法繼續(xù)檢查。供試品對(duì)照組：取10g供試品加入300ml的TSB（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）中將菌液用稀釋液代替，按照陽(yáng)性試驗(yàn)組的同樣操作，培養(yǎng)溫度為30℃~35℃，作為供試品對(duì)照。陰性對(duì)照組：將菌液用稀釋液代替同陽(yáng)性試驗(yàn)組的方法操作，培養(yǎng)溫度為30℃~35℃，作為陰性對(duì)照。表9沙門菌檢查驗(yàn)證方法及結(jié)果記錄陽(yáng)性試驗(yàn)組供試品對(duì)照組陰性對(duì)照組胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（24h）（+）（-）（-）RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（24h）（+）（-）（-）木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（24h）（+）（-）（-）三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（24h）（+）（-）（-）其他試驗(yàn)（沙門氏菌生化鑒定盒）（+）結(jié)果已檢出未檢出未檢出由表9可知，沙門菌的供試品對(duì)照組與陰性對(duì)照組的結(jié)果相同，均為未檢出，陽(yáng)性試驗(yàn)組則為已檢出。綜上所述，沙門菌的檢驗(yàn)可以采用培養(yǎng)基稀釋法檢驗(yàn)。3.討論從中國(guó)藥典2005年版[1]開始，藥品微生物限度檢查由微生物限度檢查方法驗(yàn)證發(fā)展至微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)，無(wú)論在稱呼還是方法兩方面都更適合于對(duì)品種方法的確認(rèn)，從而建立符合要求的方法。此外，現(xiàn)用培養(yǎng)基與前兩部藥典相比，擁有更高的靈敏度[4]。2015年版的大腸埃希菌的檢查方法為對(duì)耐膽鹽格蘭陰性菌檢查，其包含的范圍更大，而且培養(yǎng)基的選擇以及產(chǎn)氣導(dǎo)管的取消都更有利于觀察結(jié)果。沙門菌檢驗(yàn)也從以往的只需對(duì)含動(dòng)物成分進(jìn)行檢驗(yàn)改為對(duì)所有含藥材原粉制劑均實(shí)行控制，要求更嚴(yán)格了。本安宮牛黃丸的制作需要用到11味中藥材，其中包括：水牛角濃縮粉、牛黃、人工麝香、黃芩、朱砂、雄黃、黃連、梔子、郁金、珍珠、冰片，為具有抑菌活性的藥品。根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》，當(dāng)藥品中含有抑菌成分的時(shí)候，我們可以采取下列方法去除樣品的抑菌活性[1]：一、加入中和劑或滅活劑，二、增大稀釋液，三、采用薄膜過(guò)濾法，四、上述3種方法的聯(lián)合使用等等。通過(guò)以上方法的應(yīng)用，藥品真實(shí)的微生物污染情況[2]才能更真實(shí)地反映出來(lái)，同時(shí)還能夠檢驗(yàn)藥品的抑菌作用是否有效去除，以及所使用的去除的方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)檢出的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)安宮牛黃丸（大蜜丸）進(jìn)行需氧菌、霉菌、酵母菌以及控制菌的微生物檢查方法驗(yàn)證，用空白對(duì)照以及條件對(duì)照的方法得出結(jié)論。這兩種方法的結(jié)合既可以排除因安宮牛黃丸中存在抑菌成分從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的影響，又可以達(dá)到更準(zhǔn)確地得到該檢驗(yàn)方法是否恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。針對(duì)需氧菌總數(shù)測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用了稀釋劑稀釋法。對(duì)于霉菌和酵母菌的總數(shù)測(cè)定，同樣運(yùn)用了稀釋劑稀釋法。此外，控制菌檢查中的大腸埃希菌則應(yīng)用了培養(yǎng)基稀釋法檢驗(yàn)；常規(guī)法檢驗(yàn)則適用于耐膽鹽革蘭陰性菌；沙門菌采用培養(yǎng)基稀釋法檢驗(yàn)。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針對(duì)安宮牛黃丸（大蜜丸）的微生物采取的檢查方法都證實(shí)有效。除此之外，此種微生物限度檢查方法還可以為其他含有抑菌成分的大蜜丸的微生物限度檢查法適用性試驗(yàn)提供借鑒。不過(guò)，在日常的生產(chǎn)中，安宮牛黃丸（大蜜丸）在微生物限度檢查中也常常出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。原因?yàn)榘矊m牛黃丸（大蜜丸）屬于非無(wú)菌口服固體制劑，可能發(fā)生由于非目的菌的生長(zhǎng)而導(dǎo)致的霉菌和酵母菌總數(shù)不符合限度標(biāo)準(zhǔn)的情況。原因有三點(diǎn)：一、藥材原粉存在于安宮牛黃丸（大蜜丸）中，二、其原輔料生產(chǎn)及炮制工藝、包裝、儲(chǔ)藏和給藥途徑等有高濃度的需氧菌（一般都在104cfu/g以上）存在[11]，其容易在普通SDA上生長(zhǎng)，導(dǎo)致霉菌和酵母菌總數(shù)超出限度，三、2015年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查中計(jì)數(shù)法的適用范圍發(fā)生了改變［1］，微生物的促生長(zhǎng)能力在SDA和TSA的幫助下得以提高，同時(shí)也擴(kuò)大了計(jì)數(shù)微生物的類型和范圍［10，4］，供試品的霉菌和酵母菌總數(shù)為SDA上生長(zhǎng)的總菌落。因此，在這種情況下就容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。這時(shí)候我們就可以選擇使用選擇性培養(yǎng)基或者其他添加適量抗生素的SDA［9］來(lái)建立檢查方法，從而避免假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生，能夠反映產(chǎn)品真實(shí)的霉菌和酵母菌污染狀況。4.結(jié)論一、需氧菌總數(shù)測(cè)定：稀釋劑稀釋法；二、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定：稀釋劑稀釋法；三、大腸埃希菌測(cè)定：培養(yǎng)基稀釋法；四、耐膽鹽革蘭陰性菌測(cè)定：常規(guī)法；五、沙門菌測(cè)定：培養(yǎng)基稀釋法檢驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：140-151.人民衛(wèi)生出版社.[2]莫小林，伍小燕，韋振源，等.10種中藥制劑微生物限度檢查法的建立與標(biāo)準(zhǔn)操作探討[J].西北藥學(xué)雜志，2008，23（6）：384-386.[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005.[4]由亞寧，陳雪芹，周志云，等.2005年版中國(guó)藥典和歐洲藥典菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基比較[J].中國(guó)藥事，2010，24（6）：587-590[5]王永智,吳宏斌,邱文娜等.人工牛黃微生物限度檢查方法適用性實(shí)驗(yàn)[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2019,38(3):380-383.[6]田青.略述安宮牛黃丸臨床應(yīng)用[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2009,7(11):202-204.[7]謝鍇標(biāo),陳震堯,邱新華,謝德秋,陳海陽(yáng).八種醫(yī)院中藥制劑微生物限度檢查方法的研究[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2019,26(09):7-12.[8]劉靜.安宮牛黃丸的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2019,39(04):142-146.[9]吳幼玲．幾種沙氏培養(yǎng)基真菌生長(zhǎng)情況比較［J］.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2014，20(4):46-47[10]徐偉東，許華玉，范一靈，等．胰酪胨大豆培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的微生物促生長(zhǎng)能力考察［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2013，14(4):271-275[11]楊曉東，劉興文．中藥丸劑的染菌途徑與防控措施分析［J］．中國(guó)藥業(yè)，2011，20(22):92-93致

謝

光陰似箭，大學(xué)即將劃上一個(gè)句號(hào)，而于我的人生只是一個(gè)冒號(hào)，我將開啟全新的篇章。四年的求學(xué)生涯在師長(zhǎng)、親友的大力支持下，收獲頗豐，在論文即將付梓之際，思緒萬(wàn)千，心情久久不能平靜。回想論文攥寫期間，我的導(dǎo)師司徒穎治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，學(xué)識(shí)淵博，思想深邃，視野雄闊，為我營(yíng)造了一種良好的精神