藏紅花對(duì)慢性缺血性腦損傷后膠質(zhì)疤痕的作用摘要目的：研究藏紅花對(duì)大鼠慢性缺血性腦損傷的作用以及膠質(zhì)疤痕的影響。方法：實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、缺血模型組、依達(dá)拉奉組和藏紅花組。術(shù)后進(jìn)行稱重及神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)。術(shù)后第42天起進(jìn)行開場(chǎng)自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、埋珠實(shí)驗(yàn)。采用甲苯胺藍(lán)染色、免疫組化、ELISA分別檢測(cè)腦梗死體積、存活神經(jīng)元數(shù)量、GFAP表達(dá)及膠質(zhì)疤痕厚度、炎癥細(xì)胞因子表達(dá)。結(jié)果：藏紅花能改善慢性缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)癥狀缺失、自主活動(dòng)能力、學(xué)習(xí)記憶能力及焦慮行為，減少腦梗死體積，增加缺血周邊區(qū)存活神經(jīng)元密度，減少缺血周邊區(qū)星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì)疤痕厚度，減少炎癥細(xì)胞分泌。結(jié)論：藏紅花抑制慢性缺血性腦損傷后膠質(zhì)疤痕的形成發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)。關(guān)鍵詞：藏紅花；腦缺血；膠質(zhì)疤痕；星型膠質(zhì)細(xì)胞；膠質(zhì)疤痕EffectofsaffrononglialscarafterchronicischemicbraininjuryAbstractObjective:tostudytheeffectofsaffrononchronicischemicbraininjuryandglialscarinrats.Methods:theexperimentwasdividedintoshamoperationgroup,ischemicmodelgroup,edaravonegroupandsaffrongroup.Postoperativeweighingandneurologicalimpairmentwereevaluated.Onthe42nddayaftertheoperation,spontaneousactivityexperiment,newobjectrecognitionexperiment,viaductcrossmazeexperimentandbeadembeddingexperimentwereconducted.Thevolumeofcerebralinfarction,thenumberofsurvivingneurons,theexpressionofGFAP,thethicknessoftheglialscarandtheexpressionofinflammatorycytokinesweredetectedbytoluidinebluestaining,immunohistochemistryandELISA,respectively.Results:saffroncanimprovetheneurologicalsymptoms,autonomicactivity,learningandmemoryabilityandanxietybehaviorofratswithchronicischemicbraininjury,reducethevolumeofcerebralinfarction,increasethedensityoflivingneuronsintheperipheralareaofischemia,reducetheexpressionofglialscarthicknessofstarglialcellsintheperipheralareaofischemia,andreducethesecretionofinflammatorycells.Conclusion:saffroninhibitstheformationofglialscarafterchronicischemicbraininjuryandplaysaneuroprotectiverole.Keywords:Saffron,Cerebralischemia,Colloidscar,Astrocytes,Glialscar引言缺血性腦損傷具有發(fā)病率高、致殘率高、致死率高的特點(diǎn)ADDINNE.Ref.{6EF5E3E8-55CF-4CB5-B07A-D9B4CD667F2B}[1,2]，后期會(huì)留下不同程度的癲癇、肌陣攣、運(yùn)動(dòng)障礙、認(rèn)知障礙和其他特定的神經(jīng)系統(tǒng)異常ADDINNE.Ref.{20DFA2AF-6494-47E8-84B3-DF6DD3C6EB83}[3]等的后遺癥。目前，沒有特效的藥物保護(hù)大腦缺血所致的神經(jīng)損害ADDINNE.Ref.{54B585F8-3C5E-400C-9E3A-0002A60DD725}[4]，因此積極尋找此類藥物有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生缺血性腦損傷后，均勻分布在腦中的星型膠質(zhì)細(xì)胞在損傷處周圍大量增生，形成膠質(zhì)疤痕ADDINNE.Ref.{AE5A3AEA-9F9E-4028-BA61-C128ED78DE3A}[5,6]。膠質(zhì)疤痕一方面抑制損傷、促進(jìn)再生。另一方面卻對(duì)軸突的再生形成物理屏障，同時(shí)分泌大量的軸突生長(zhǎng)抑制因子，形成化學(xué)性屏障ADDINNE.Ref.{C6A92434-DCEF-4343-8FD6-1AA2F51602D3}[7,8]。因此，抑制腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞激活及膠質(zhì)疤痕形成，是治療缺血性腦損傷的一個(gè)重要策略ADDINNE.Ref.{18F17CED-E005-4BA4-BF2A-BC696E57FBFB}[9-11]。我國(guó)在傳統(tǒng)中藥治療缺血性腦損傷方面具有豐富的經(jīng)驗(yàn)。藏紅花又名西紅花，屬于鳶尾科番紅花屬植物，一般以其柱頭為主要藥用部位，是一種有效的神經(jīng)保護(hù)藥物，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病具有良好的保護(hù)作用ADDINNE.Ref.{D333465E-57D6-41B3-9E36-B910C18E5D43}[12-14]。藏紅花酸可有效預(yù)防大鼠慢性腦低灌注后海馬神經(jīng)病理改變從而改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶ADDINNE.Ref.{C49EAA29-D71C-4FA8-B7D7-C4D026DEA5FE}[15]，減輕神經(jīng)損傷后引起的神經(jīng)疼痛ADDINNE.Ref.{A9E335A9-9C8B-49C7-B47B-2EC240749D58}[16]，并保護(hù)腦挫裂傷和促進(jìn)血管生成ADDINNE.Ref.{5BA29FC3-ED9D-4909-8100-0BC978D1DAFC}[17]。HeADDINNE.Ref.{2133F436-D561-4A24-AE6B-53E5049D859D}[18]等人發(fā)現(xiàn)口服藏紅花主要成分藏紅花素對(duì)缺血性腦損傷和記憶缺陷也有良好的保護(hù)作用?？梢?，藏紅花中的許多活性成分都對(duì)神經(jīng)保護(hù)具有良好的作用，而藏紅花對(duì)缺血腦損傷的保護(hù)作用是否與抑制慢性腦缺血后膠質(zhì)疤痕形成有關(guān)目前尚未見報(bào)道。本項(xiàng)目以大腦中動(dòng)脈栓塞制備局灶性腦缺血模型，評(píng)價(jià)藏紅花提取物對(duì)慢性腦缺血后行為學(xué)及膠質(zhì)疤痕的作用，闡明藏紅花對(duì)慢性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用方式，為治療慢性缺血性腦損傷新藥篩選提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法1實(shí)驗(yàn)器材和試劑：器材：電子分析天平（AL204，METTLERTOLEDO）大小鼠通用型自發(fā)活動(dòng)觀察系統(tǒng)（JLBehv-LAG-4，上海吉量軟件科技有限公司）高架十字迷宮系統(tǒng)（JLBehv-EPMM，上海吉量軟件科技有限公司）動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVisionXT9，諾達(dá)思信息技術(shù)有限公司）冰凍切片機(jī)（LeicaCM1900型，德國(guó)卡萊公司）熒光顯微鏡（LH-M100CB-1，日本Nikon公司）純水儀（Milli-Q，MILLIPORE）試劑：依達(dá)拉奉（國(guó)藥集團(tuán)國(guó)瑞藥業(yè)有限公司）10%水合氯醛（浙江省華東醫(yī)藥股份有限公司）4%多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司）30%蔗糖溶液1%甲苯胺藍(lán)染色3%H2O2（11L19B08，武漢博士德生物工程有限公司）抗體稀釋劑、羊血清（武漢博士德生物工程有限公司）5%BSA封閉液（11K11B04，武漢博士德生物工程有限公司）PBS兔IgG-免疫組化試劑盒SABC（武漢博士德生物工程有限公司）中性樹膠ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）DAB顯色試劑盒*20倍濃縮液（武漢博士德生物工程有限公司）2制備藏紅花粉劑：藏紅花水提物由**醫(yī)院藥劑科贈(zèng)與。（由于涉及到專利申請(qǐng)等問題，不適合寫詳細(xì)方法）3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：）所有動(dòng)物均遵照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，飼養(yǎng)在溫度（22±2）℃和濕度50±10%的環(huán)境下，12h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。4建立大鼠局灶性腦缺血模型：以大腦中動(dòng)脈栓塞（middlecerebralarteryocclusion，MCAO）的方法建立局灶性腦缺血模型。大鼠麻醉后，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及其分支，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈分支。用動(dòng)脈夾暫時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈，雙重絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，從中間剪斷。在頸外動(dòng)脈近心端剪一小口，將涂有硅膠的尼龍線（直徑0.36mm）從小口輕輕插入至頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)尼龍線插入距頸總動(dòng)脈叉2.0～2.5cm處并有輕微阻力，阻塞大腦中動(dòng)脈主干的起始部。隨后，在頸分外動(dòng)脈尼龍線插入的近心端用絲線結(jié)扎。在假手術(shù)組，只分離頸總動(dòng)脈。缺血90min后，將尼龍線輕輕抽出，扎緊切口，并松開頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈夾。5分組與給藥：實(shí)驗(yàn)共分為6組：假手術(shù)組、缺血模型組、依達(dá)拉奉3mg/kg組、藏紅花30、100、300mg/kg。其中，假手術(shù)組和缺血模型組分別灌胃給予生理鹽水溶液0.5ml/100g，依達(dá)拉奉組和藏紅花組分別灌胃給予相應(yīng)劑量的依達(dá)拉奉和藏紅花溶液。MCAO術(shù)后2h第1次給藥。第2天開始，每日一次，連續(xù)給藥14天，術(shù)后第42天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)后灌流取腦、制備新鮮腦組織和切片備用。6體重的測(cè)量：每天測(cè)量體重1次，上午9時(shí)進(jìn)行。7神經(jīng)癥狀評(píng)分：采用Longar評(píng)分方法評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損程度?？偡譃?分，正常為0分，最大功能缺損為5分。0分：神經(jīng)功能正常；1分：輕度神經(jīng)功能缺損；2分：中度神經(jīng)功能缺損；4分：無(wú)法自發(fā)行走，意識(shí)減退；5分：與缺血有關(guān)的死亡。8開場(chǎng)自發(fā)活動(dòng)：將大鼠放入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1h，然后放入開場(chǎng)內(nèi)（80cm*80cm*80cm），在安靜環(huán)境下先適應(yīng)5min后在開場(chǎng)內(nèi)自由活動(dòng)5min，用DigBehv動(dòng)物行為分析系進(jìn)行分析，最后以運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)總路程和中央?yún)^(qū)時(shí)間作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清除糞便，用稀乙醇擦拭開場(chǎng)，消除異味。9新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)：階段1（T1）：在80cm×80cm開場(chǎng)的兩個(gè)相對(duì)的區(qū)域中央放置2個(gè)完全相同的物體（物體1和1’），將大鼠單獨(dú)放入開場(chǎng)中探索5min。探索完畢后將大鼠取出，放回飼養(yǎng)籠。清理觀察箱，消除異味。階段2（T2）：10min后，物體1不變（舊物體），物體1’更換為物體2（新物體），再將大鼠放入開場(chǎng)中探索5min。探索物體1的時(shí)間記為F，探索物體1’或2的時(shí)間記為N，探索兩個(gè)物體的總時(shí)間記為（F+N），計(jì)算大鼠的分辨率Discriminationratio（DR）=[N/(N+F)]×100%和分辨指數(shù)Discriminationindex（DI）=[(N-F)/(N+F)]×100。探索定義為大鼠面朝物體，鼻子與該物體的距離≤2cm。10高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：先將大鼠放到高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1h。將大鼠置于迷宮中央頭朝向一側(cè)開臂區(qū)，通過攝像監(jiān)視器垂直監(jiān)視記錄大鼠5min內(nèi)的活動(dòng)情況。分別以大鼠開臂運(yùn)動(dòng)總路程和百分比、開臂內(nèi)停留時(shí)間和百分比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用稀乙醇擦拭高架十字迷宮，消除異味對(duì)其他動(dòng)物的影響。11埋珠實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入埋珠盒（鋪有5cm厚的玉米芯墊料）內(nèi)適應(yīng)15min后放回鼠籠，20個(gè)直徑11cm的藍(lán)色玻璃珠均勻放在玉米芯墊料上后，大鼠放入原來適應(yīng)的埋珠盒內(nèi)。30min后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，計(jì)算超過2/3體積被埋的玻璃珠的數(shù)量。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束，更換墊料，并用酒精擦拭埋珠盒和蓋子。12.腦組織制備：行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射（400mg/kg）麻醉，先以生理鹽水經(jīng)左心室快速?zèng)_洗20min，再以4%多聚甲醛灌流固定30min。然后斷頭取腦，以4%多聚甲醛后固定24h，30%蔗糖溶液脫水處理3天。用冰凍切片機(jī)切成12μm和20μm冠狀切片，晾干后-20℃保存。其中20μm用于腦梗死體積測(cè)定，12μm用于病理學(xué)檢測(cè)和免疫組化分析。13腦梗死體積測(cè)定：20μm冠狀切片采用1%甲苯胺藍(lán)染色，用數(shù)碼相機(jī)拍攝大體像，采用Medbrain計(jì)算腦片左、右半腦面積和梗死面積，將每一腦片的面積乘以厚度（2mm）再相加，分別得到左半腦體積、右半腦體積和梗死體積的近似值。14免疫組化：以GFAP特異性免疫組化染色檢測(cè)缺血周邊區(qū)星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和膠質(zhì)疤痕厚度。組織切片以H2O2去除內(nèi)源性IgG后，血清封閉非特異性抗原，加入相應(yīng)的一抗（兔抗GFAP抗體，1:400），4℃孵育過夜。第二日PBS清洗后，加入生物素化的相應(yīng)二抗室溫孵育2小時(shí)，DAB顯色后，采用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察，攝像后保存。陰性對(duì)照切片不加一抗，以正常羊血清代替，其余操作同上。顯微鏡拍攝后，計(jì)算缺血周邊區(qū)單位面積GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)計(jì)算膠質(zhì)疤痕的厚度，評(píng)價(jià)藏紅花對(duì)大鼠慢性腦缺血再灌注損傷星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)疤痕的影響。15ELISA：分別取缺血周邊區(qū)腦組織，根據(jù)TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1βELISA檢測(cè)試劑盒說明書操作，求出各組TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β的濃度。16統(tǒng)計(jì)分析（補(bǔ)充）結(jié)果1藏紅花對(duì)慢性缺血性腦損傷大鼠行為學(xué)變化的影響1.1藏紅花對(duì)神經(jīng)功能缺損的影響假手術(shù)組大鼠體重保持穩(wěn)定增長(zhǎng)（圖1A），神經(jīng)功能幾乎無(wú)缺損情況（圖1B）。與假手術(shù)組比較，模型組從缺血第后14至42天體重增長(zhǎng)緩慢（圖1A），從第28天至42天神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重（圖1B）。與模型組相比，第35至42天藏紅花300kg/mg顯著改善大鼠體重下降，第42天依達(dá)拉組和藏紅花（30、100kg/mg）大鼠對(duì)體重下降也有改善作用（圖1A）。與模型組比較，術(shù)后第42天藏紅花30kg/mg明顯改善大鼠缺血后神經(jīng)功能缺損（圖1B），藏紅花100kg/mg則改善缺血后第28天至42天神經(jīng)功能缺損（圖1B），藏紅花300kg/mg則改善缺血后第35至第42天神經(jīng)功能缺損（圖1B）。圖1藏紅花對(duì)局灶性腦缺血大鼠體重和神經(jīng)功能缺損程度的影響。與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。1.2開場(chǎng)自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)大鼠開場(chǎng)活動(dòng)軌跡圖和熱圖發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠進(jìn)入開場(chǎng)自發(fā)活動(dòng)后在周邊區(qū)探索新環(huán)境，中央?yún)^(qū)域活動(dòng)較少（圖2A，2B）。模型組大鼠活動(dòng)量明顯減少，失去對(duì)中央?yún)^(qū)的偏好。依達(dá)拉奉和藏紅花300mg/kg活動(dòng)軌跡較模型組的有所改善，對(duì)開場(chǎng)活動(dòng)的空間選擇性有明顯改善（圖2A，2B）。與假手術(shù)組相比，模型組活動(dòng)速度、總活動(dòng)路程和中央時(shí)間明顯減少。與模型組相比，依達(dá)拉奉和藏紅花（100、300mg/kg）大鼠活動(dòng)速度明顯提高（圖2C），依達(dá)拉奉和藏紅花（300mg/kg）大鼠活動(dòng)總路程和中央時(shí)間顯著增加（圖2D，2E）。圖2藏紅花對(duì)大鼠自發(fā)活動(dòng)的影響。運(yùn)動(dòng)熱圖（A）、運(yùn)動(dòng)軌跡圖（B）、運(yùn)動(dòng)速度（C）、運(yùn)動(dòng)總路程（D）以及中央時(shí)間（E）。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。1.3新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)假手術(shù)組大鼠在Test2對(duì)新物體探究顯著增加，提示可區(qū)別新舊物體（圖3A），對(duì)新物體（T2）識(shí)別分辨比與分辨指數(shù)均顯著高于對(duì)舊物體（T1）（圖3B，3C）。模型組大鼠對(duì)T2的探索時(shí)間沒有明顯增加（圖3A），且該組大鼠對(duì)T1和T2探索的分辨比和分辨指數(shù)無(wú)明顯差異（圖3B、3C）；與T1組比較，藏紅花（100、300mg/kg）組大鼠對(duì)T2的分辨比和分辨指數(shù)明顯升高（圖3B，3C）；而依達(dá)拉奉與藏紅花30mg/kg大鼠T2的分辨比和分辨指數(shù)與T1與差異（圖3A，3B）。圖3藏紅花對(duì)慢性局灶性腦缺血后大鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的影響。（A）NORT熱圖；（B）分辨比；（C）分辨指數(shù)。與T1比較，*P<0.05。1.4高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和埋珠實(shí)驗(yàn)EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠在開臂和閉臂內(nèi)活動(dòng)（圖4A）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在開臂處活動(dòng)總路程有所減少，但無(wú)顯著差異（圖4B），活動(dòng)總路程百分比、停留時(shí)間及停留時(shí)間百分比顯著降低（圖4C，4D，4E）。與模型組相比，依達(dá)拉奉組和藏紅花（30、100和300mg/kg）組使開臂處活動(dòng)總路程有所增加，但無(wú)顯著差異（圖4B），但能使開臂內(nèi)活動(dòng)總路程百分比顯著增加（圖4C）；依達(dá)拉奉組、藏紅花（100、300mg/kg）組與依達(dá)拉奉組、藏紅花（30、100mg/kg）組分別使開臂停留時(shí)間（圖4D）與開臂停留時(shí)間百分比（圖4E）明顯增加。埋珠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠埋珠動(dòng)作較少（圖4F）。模型組大鼠埋珠數(shù)量顯著增加（圖4F）。與模型組相比，依達(dá)拉奉組和藏紅花（100，300mg/kg）組大鼠埋珠數(shù)量明顯減少（圖4F）。圖4藏紅花對(duì)局灶性腦缺血大鼠EPM和MBT的影響。（A）EPM運(yùn)動(dòng)軌跡圖；（B）開臂運(yùn)動(dòng)總路程；（C）開臂運(yùn)動(dòng)路程百分比；（D）開臂停留時(shí)間；（E）停留時(shí)間百分比；（F）埋珠實(shí)驗(yàn)示意圖和埋珠數(shù)量。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。2腦梗死體積測(cè)定腦組織切片結(jié)果顯示，假手術(shù)組大腦無(wú)損傷，而模型組大腦明顯萎縮（圖5A）。與模型組相比，依達(dá)拉奉組和藏紅花（100、300mg/kg）組腦梗死體積明顯變?。▓D5B），而藏紅花（30mg/kg）無(wú)此作用。圖5藏紅花對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積的影響。與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。n.d.：未測(cè)定。3存活神經(jīng)元密度假手術(shù)組存活神經(jīng)元形態(tài)正常大小，胞核胞漿清晰（圖6）。模型組大鼠缺血周邊區(qū)存活神經(jīng)元密度顯著減少，胞體縮小，核固縮明顯。依達(dá)拉奉和藏紅花（100、300mg/kg）使存活神經(jīng)元密度明顯增大，神經(jīng)元形態(tài)也得到了改善，而藏紅花（30mg/kg）無(wú)此作用。圖6藏紅花對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織中存活神經(jīng)元密度的影響。與假手術(shù)組比較，**P<0.01。與模型組比較，##P<0.01。4GFAP+細(xì)胞數(shù)量和膠質(zhì)疤痕厚度免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠腦組織缺血周邊區(qū)GFAP+細(xì)胞數(shù)量較少（圖7A）。模型組大鼠腦組織中的GFAP+細(xì)胞數(shù)量明顯增多（圖7B），胞體增大，突起增加（圖7A）；依達(dá)拉奉和藏紅花300mg/kg使GFAP+細(xì)胞數(shù)量較模型組顯著減少（圖7B）。在膠質(zhì)疤痕檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，缺血周邊區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，形成一個(gè)緊密連接的膠質(zhì)疤痕，在缺血中央?yún)^(qū)大量壞死組織（圖7C）。假手術(shù)大鼠無(wú)膠質(zhì)疤痕形成，模型組大鼠腦缺血周邊區(qū)膠質(zhì)疤痕明顯（圖7C）。與模型組相比，依達(dá)拉奉和藏紅花（100、300mg/kg）腦缺血周邊區(qū)膠質(zhì)疤痕厚度明顯減?。▓D6C，6D）。圖7藏紅花對(duì)大鼠腦缺血周邊區(qū)GFAP+細(xì)胞數(shù)量和膠質(zhì)疤痕厚度的影響。（A）星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)；（B）GFAP+細(xì)胞數(shù)量；（C）膠質(zhì)疤痕；（D）膠質(zhì)疤痕厚度。。與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。5炎癥細(xì)胞因子假手術(shù)組大鼠腦缺血周邊區(qū)有少量炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α均有表達(dá)。與假手術(shù)比較，模型組大鼠腦缺血周邊區(qū)IL-6和IL-1β含量明顯增多（圖8A，8C）；IL-10含量明顯減少（圖8B），而TNF-α含量無(wú)顯著變化（圖8D）。與模型組相比，依達(dá)拉奉和藏紅花（100、300mg/kg）使周邊區(qū)IL-6表達(dá)減小，IL-10表達(dá)增多（圖8A，8B）；依達(dá)拉奉組和藏紅花（30、100、300mg/kg）IL-1β表達(dá)降低（圖8A）；對(duì)TNF-α表達(dá)顯著影響（圖8D）。圖8藏紅花對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦缺血周邊區(qū)IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α表達(dá)的影響。。與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01。與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。分析與討論本研究表明藏紅花對(duì)慢性缺血性腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，表現(xiàn)為缺血后行為學(xué)改善、梗死體積減小、缺血周邊區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量、GFAP細(xì)胞數(shù)量、膠質(zhì)疤痕厚度和炎癥細(xì)胞數(shù)量減少。藏紅花是種有效的神經(jīng)保護(hù)劑ADDINNE.Ref.{15E00A1D-5912-48F0-A5D8-FF6BC384FDD2}[19]，對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用ADDINNE.Ref.{EBF72A86-498E-48F2-AA48-73B8B2E7566A}[20]。中風(fēng)是世界上第二大最常見的致死原因，在急性期的病理生理變化主要包括興奮毒性、氧化和硝化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡等引起腦損傷ADDINNE.Ref.{3F9BB665-D204-44B4-96F2-25790082982C}[21]。到了長(zhǎng)期缺血后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)因再灌注、血腦屏障破壞和炎癥而造成長(zhǎng)期損傷，最終導(dǎo)致中風(fēng)后的行為障礙和殘疾ADDINNE.Ref.{B8D0FCFB-BB27-4EAC-98C8-54C37F088D91}[22]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給個(gè)人、家庭、社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。長(zhǎng)期缺血性腦損傷后神經(jīng)元死亡導(dǎo)致感覺運(yùn)動(dòng)功能ADDINNE.Ref.{BA720E1F-B373-450A-BFBA-5FEB9ECE7F76}[23]、認(rèn)知社交互動(dòng)、焦慮樣和抑郁樣行為ADDINNE.Ref.{C9C16990-F7D3-41C8-8686-58D6558DB653}[24-26]、空間學(xué)習(xí)記憶障礙ADDINNE.Ref.{E4B5FEC0-9D5D-42F4-AB4B-B1027C1670E6}[27]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺血模型大鼠也有此類改變，而依達(dá)拉奉和藏紅花明顯改善作用。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)ADDINNE.Ref.{4253DC3E-DABE-4437-88CF-7591C4798301}[28]、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)ADDINNE.Ref.{96DD2ABD-B1DA-4BEC-9634-095F1ADF44DF}[29]和埋珠實(shí)驗(yàn)ADDINNE.Ref.{E354C43C-8B2A-4D94-9C2F-F5580C1E68A8}[30]可評(píng)價(jià)缺血性腦損傷造成的認(rèn)知障礙以及焦慮抑郁樣行為。本實(shí)驗(yàn)表明藏紅花可顯著改善缺血性腦損傷大鼠的空間記憶能力、認(rèn)知缺陷和焦慮情況。腦缺血后神經(jīng)功能缺損、感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙、及學(xué)習(xí)記憶能力下降、焦慮情緒與腦梗死面積的大小具有一定的相關(guān)性ADDINNE.Ref.{015FF128-63A9-4038-8786-CC19A8E944CD}[31]。我們的結(jié)果提示藏紅花不僅使腦梗死體積減少，而且存活神經(jīng)元數(shù)量也增加，這與其改善神經(jīng)功能作用是一致的。缺血性中風(fēng)發(fā)生時(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞中的星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均被激活，而激活的膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮雙刃劍的作用ADDINNE.Ref.{729F45C4-EB0F-4284-9081-9513C2AF412D}[32]。慢性腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，又稱為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，大量活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞相互交織重疊，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，最終在損傷周圍形成致密的膠質(zhì)疤痕。膠質(zhì)疤痕抑制軸突的再生，同時(shí)分泌大量的軸突生長(zhǎng)抑制因子，使梗死區(qū)難以建立新的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)ADDINNE.Ref.{121B9F5F-9953-4E13-86E5-9CFA21FF2227}[33]；并參與形成癲癇病灶，促進(jìn)神經(jīng)元死亡ADDINNE.Ref.{26B91431-51CE-4A5A-BA5B-70CE0284BC36}[34]。膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白質(zhì)（GFAP）特異性表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此其水平的高低可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及激活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)一些抗腦缺血藥物也以此為靶點(diǎn)評(píng)價(jià)對(duì)慢性腦缺血的作用ADDINNE.Ref.{572B97D5-9CE2-4ACB-8904-3C69B73320F5}[35]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)藏紅花抑制膠質(zhì)疤痕形成、減少GFAP的表達(dá)，其改善神經(jīng)功能效果可能與該作用有關(guān)。星形膠質(zhì)細(xì)胞除了抑制神經(jīng)生長(zhǎng)因子的分泌，還釋放大量的炎癥細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)ADDINNE.Ref.{67577DCB-2518-42CB-BBAC-107172D23D9B}[36]。促進(jìn)抗炎因子IL-10和抑制炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β的表達(dá)可減少炎癥反應(yīng)，改善缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能ADDINNE.Ref.{A0DC2A2C-5F0F-46C4-9385-C2FD5F4868A4}[37]，且IL-6有抗凋亡和減少反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖的作用ADDINNE.Ref.{9030F8A0-EB3E-4EB9-B098-2EFDFB7FF9FC}[38]。本結(jié)果表明炎癥細(xì)胞因子數(shù)量與星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及膠質(zhì)疤痕厚度一致。但是藏紅花只抑制白介素類炎癥細(xì)胞因子的釋放，對(duì)TNF-α的釋放無(wú)影響，這可能與動(dòng)物疾病模型或腦缺血的不同階段相關(guān)。我們的結(jié)果表明，藏紅花可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞激活及膠質(zhì)疤痕的形成，減少炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而改善慢性腦缺血所引起的神經(jīng)癥狀缺失、感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙、學(xué)習(xí)記憶能力下降及焦慮情緒，其有效劑量范圍為100~300mg/kg。但是，藏紅花對(duì)慢性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制目前尚不清楚，后續(xù)將在星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷模型中，采用相應(yīng)的藥物激動(dòng)劑或拮抗劑，進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，完善研究方案，為抗腦缺血藥物的篩選提供候選藥物。ADDINNE.Bib參考文獻(xiàn)[1]FugateJE.Anoxic-IschemicBrainInjury.NEUROLCLIN,2017;35:601～611.[2]RadakD,KatsikiN,ResanovicI,etal.ApoptosisandAcuteBrainIschemiainIschemicStroke.CURRVASCPHARMACOL,2017;15:115～122.[3]Lu-EmersonC,KhotS.Neurologicalsequelaeofhypoxic-ischemicbraininjury.NEUROREHABILITATION,2010;26:35.[4]ZhangB,WeiK,LiX,etal.UpregulationofCdh1signalinginthehippocampusattenuatesbraindamageaftertransientglobalcerebralischemiainrats.NEUROCHEMINT,2018;112:166～178.[5]SofroniewMV,VintersHV.Astrocytes:biologyandpathology.ACTANEUROPATHOL,2010;119:7～35.[6]AdamsKL,GalloV.Thediversityanddisparityoftheglialscar.NATNEUROSCI,2018;21:9～15.[7]PeknyM,PeknaM,MessingA,etal.Astrocytes:acentralelementinneurologicaldiseases.ACTANEUROPATHOL,2016;131:323～345.[8]PeknyM,PeknaM.AstrocyteReactivityandReactiveAstrogliosis:CostsandBenefits.PHYSIOLREV,2014;94:1077～1098.[9]RocamondeB,ParadellsS,BarciaJM,etal.Neuroprotectionoflipoicacidtreatmentpromotesangiogenesisandreducestheglialscarformationafterbraininjury.NEUROSCIENCE,2012;224:102～115.[10]DiGiovanniS,MovsesyanV,AhmedF,etal.Cellcycleinhibitionprovidesneuroprotectionandreducesglialproliferationandscarformationaftertraumaticbraininjury.ProcNatlAcadSciUSA,2005;102:8333～8338.[11]FischerAJ,SchmidtM,OmarG,etal.BMP4andCNTFareneuroprotectiveandsuppressdamage-inducedproliferationofMullergliaintheretina.MOLCELLNEUROSCI,2004;27:531～542.[12]SkladnevNV,GaneshanV,KimJY,etal.Widespreadbraintranscriptomealterationsunderlietheneuroprotectiveactionsofdietarysaffron.JNEUROCHEM,2016;139:858～871.[13]HatziagapiouK,LambrouGI.TheProtectiveRoleofCrocusSativusL.(Saffron)AgainstIschemia-ReperfusionInjury,HyperlipidemiaandAtherosclerosis:NatureOpposingCardiovascularDiseases.CurrCardiolRev,2018;14:272～289.[14]Tashakori-SabzevarF,HosseinzadehH,MotamedshariatyVS,etal.Crocetinattenuatesspatiallearningdysfunctionandhippocampalinjuryinamodelofvasculardementia.CURRNEUROVASCRES,2013;10:-.[15]WangX,ZhangG,QiaoY,etal.Crocetinattenuatessparednerveinjury-inducedneuropathicpaininmice.JPHARMACOLSCI,2017;135:141～147.[16]BieX,ChenY,ZhengX,etal.Theroleofcrocetininprotectionfollowingcerebralcontusionandintheenhancementofangiogenesisinrats.FITOTERAPIA,2011;82:997～1002.[17]HeWB,ZhangJL,XueW,etal.[Comparisonoftheactionofisolicheninandmethanolextractofsaffrononlong-termpotentiationinhippocampaldentategyrusinvivo].YaoXueXueBao,2009;44:858～862.[18]MoshiriM,VahabzadehM,HosseinzadehH.ClinicalApplicationsofSaffron(Crocussativus)anditsConstituents:AReview.DrugRes(Stuttg),2015;65:287～295.[19]AsadollahiM,NikdokhtP,HatefB,etal.Protectivepropertiesoftheaqueousextractofsaffron(CrocussativusL.)inischemicstroke,randomizedclinicaltrial.JETHNOPHARMACOL,2019;238:111833.[20]KhoshnamSE,WinlowW,FarzanehM,etal.Pathogenicmechanismsfollowingischemicstroke.NEUROLSCI,2017;38:1167～1186.[21]BoeseAC,LeQE,PhamD,etal.Neuralstemcelltherapyforsubacuteandchronicischemicstroke.STEMCELLRESTHER,2018;9:154.[22]AzarfarA,CalciniN,HuangC,etal.Neuralcoding:Asingleneuron'sperspective.NeurosciBiobehavRev,2018;94:238～247.[23]ZanierER,PischiuttaF,VillaP,etal.Six-monthischemicmiceshowsensorimotorandcognitivedeficitsassociatedwithbrainatrophyandaxonaldisorganization.CNSNEUROSCITHER,2013;19:695～704.[24]KapoorA,ScottC,LanctotKL,etal.Symptomsofdepressionandcognitiveimpairmentinyoungadultsafterstroke/transientischemicattack.PsychiatryRes,2019;279:361～363.[25]NampoothiriSS,PotluriT,SubramanianH,etal.RodentGymnastics:NeurobehavioralAssaysinIschemicStroke.MOLNEUROBIOL,2017;54:6750～6761.[26]ChenXL,JiangL.[Physicaltrainingimprovesspatiallearningandmemoryimpairmentsfollowinghypoxicischemicbraindamageinneonatalrats].ZhongguoDangDaiErKeZaZhi,2010;12:363～367.[27]ColeE,SimundicA,MossaFP,etal.Assessingobject-recognitionmemoryinrats:Pitfallsoftheexistenttasksandtheadvantagesofanewtest.LEARNBEHAV,2019;47:141～155.[28]KraeuterAK,GuestPC,SarnyaiZ.TheElevatedPlusMazeTestforMeasuring