第1頁共13頁醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程1.1規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC/CMCC/NIM溯源)的復(fù)蘇、傳代、純度驗(yàn)證、儲存操作，確保菌株活性、純度符合要求；1.2防止菌株污染、變異或失活，保障微生物檢測(無菌檢查、限度檢查、消毒效果驗(yàn)證)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性；2.1適用菌株：本規(guī)程適用于企業(yè)微生物檢測用所有標(biāo)準(zhǔn)菌株，包·細(xì)菌：大腸埃希菌(ATCC25922/CMCC44102)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538/CMCC26003)、枯草芽孢桿菌黑色變種(ATCC9372/CMCC63501)等；16404/CMCC3.5808)等；·其他：按檢測需求引入的NIM溯源標(biāo)準(zhǔn)菌2.2適用場景：菌株首次復(fù)蘇、定期傳代、應(yīng)急備用菌株制備、儲第2頁共13頁存條件變更后的復(fù)蘇驗(yàn)證。3.職責(zé)3.1微生物檢驗(yàn)工程師：·嚴(yán)格按本規(guī)程執(zhí)行菌株復(fù)蘇、傳代、接種操作；·負(fù)責(zé)復(fù)蘇/傳代過程的質(zhì)量控制(純度、活性驗(yàn)證);·及時、準(zhǔn)確填寫操作記錄，確保符合ALCOA+原則；·發(fā)現(xiàn)異常(污染、菌株失活)立即啟動偏差處理。3.2質(zhì)量負(fù)責(zé)人：·審核菌株復(fù)蘇/傳代記錄及質(zhì)量控制結(jié)果；·批準(zhǔn)菌株用于檢測或儲存；3.3設(shè)備部：·保障生物安全柜、培養(yǎng)箱、冰箱等設(shè)備正常運(yùn)行及校準(zhǔn)；·定期維護(hù)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境(溫濕度、潔凈度)。3.4試劑管理員：·提供經(jīng)適用性驗(yàn)證合格的培養(yǎng)基、稀釋液、無菌耗材；4.1法規(guī)依據(jù)：第3頁共13頁·2025版《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》及附錄；控制樣品要求和指南》;·YY/T0962-2014《醫(yī)療器械總有機(jī)碳測定方法》;·GB19489-2008《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》;4.2術(shù)語定義：生長期的過程；·傳代：將復(fù)蘇后或培養(yǎng)成熟的菌株轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基，保持菌株活性與純度的操作；免菌株變異);·純培養(yǎng)：單一菌株在無菌條件下培養(yǎng)，無其他雜菌污染。準(zhǔn)備項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室環(huán)境BSL-2實(shí)驗(yàn)室，溫濕度20-26℃/40-60%RH,萬級潔凈度，沉降菌≤1CFU/皿(30min)查看沉降菌檢測報告第4頁共13頁生物安全柜ClassII型，運(yùn)行正常，操作前紫外線消毒30min,風(fēng)速0.38-檢查設(shè)備運(yùn)行狀態(tài)，核對校準(zhǔn)證書(有效期內(nèi))培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)箱(35-37℃/25-28℃),溫度波動≤±0.5℃;真菌培養(yǎng)需帶濕度控制(70-80%)記錄培養(yǎng)箱溫度，查看溫度校準(zhǔn)報告儲存設(shè)備-80℃超低溫冰箱(長期儲存)、2-8℃冷藏冰箱(短期儲存),溫度記錄完整確保符合儲存要求5.2試劑與耗材準(zhǔn)備培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)等，經(jīng)適用性驗(yàn)證合格(促生長率≥90%)證報告，核對批號、稀釋液無菌生理鹽水(0.9%NaCl)或磷酸鹽緩沖液(PBS),無菌性驗(yàn)證合格查看無菌檢查報告，確保無雜菌污染無菌耗材培養(yǎng)皿(φ90mm)、移液管(1mL/10mL,A級)、離心管(1.5mL)、接種環(huán)(一次性/可滅菌)等，無菌包裝完好檢查耗材包裝完整性，核對滅菌批號、輔助試劑2Compact)、麥?zhǔn)媳葷峁艿龋谟行趦?nèi)核對試劑批號、有效期，查看儲存條件是否符合要求準(zhǔn)備項(xiàng)目第5頁共13頁菌株信息確認(rèn)原始菌株：冷凍干燥管/甘油管，具備有效溯源證書(ATCC/CMCC/NIM),批號與實(shí)物一致核查溯源證書編號、批號、儲存條件，記錄菌株名稱、編號、復(fù)蘇次數(shù)菌株解凍(冷凍干燥管)室溫下緩慢解凍(避免劇烈震蕩),或按供應(yīng)商推薦方法解凍解凍后立即操作，避免長時間暴露在室溫環(huán)境菌株解凍(甘油37℃水浴快速解凍(1-2min),解凍后立即接種(避免反復(fù)凍解凍后迅速轉(zhuǎn)移至生物安全柜，禁止室溫放置6.1標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇操作(冷凍干燥管)步驟編意事項(xiàng)記錄要點(diǎn)復(fù)水1.生物安全柜內(nèi)，用無菌移液管吸取0.5-1.0mL無菌稀釋液(生理鹽水/TSB);2.緩慢注入冷5-10min(使菌株充分溶解)一移液管避免觸碰管壁，防止污染；一禁止劇烈震蕩，避免菌株受損記錄稀釋體積，復(fù)水時間接種培養(yǎng)1.用無菌移液管吸取復(fù)水后的菌懸液，接種至含10mLTSB培養(yǎng)0.2mL);2.細(xì)菌：35-37℃振蕩培養(yǎng)(150rpm)18-24h;真菌：25-28℃靜置培養(yǎng)48-72h格無菌操作，避免雜菌污染；一振蕩培養(yǎng)確保菌株充分接觸培養(yǎng)基記錄接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)方式初步純化1.取培養(yǎng)后的菌液，用無菌生理鹽水梯度稀釋至10-10-;2.取0.1mL稀釋液，均勻涂布于一稀釋過程嚴(yán)格按無菌操作，避免交叉記錄稀釋倍數(shù)、涂第6頁共13頁37℃培養(yǎng)18-24h;真菌：25-28℃培養(yǎng)48-72h污染；一涂布均勻，確保菌落分離清晰布量、培養(yǎng)條件單菌落挑取1.觀察平板菌落形態(tài)，挑取3個形態(tài)一致的單菌落；2.分別接種至新的TSA/SDA平板(劃線接種),進(jìn)行純培養(yǎng)-單菌落需形線接種采用四區(qū)劃線法，確保純化效果記錄菌落形態(tài)(顏色、大小、邊緣、隆起否有雜菌6.2標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇操作(甘油管)步驟編記錄要點(diǎn)直接接種1.生物安全柜內(nèi)，用無菌接種環(huán)挑取少量甘油菌(避免帶出過多甘油);2.劃線接種至TSA/SDA平板，或接種至10mLTSB培養(yǎng)基試管抑制菌株生長，接種后可離心去除甘油；一接種環(huán)滅菌后冷卻使用，避免燙傷菌株否去除甘油純培養(yǎng)1.平板培養(yǎng)：細(xì)菌35-37℃/18-24h,真菌25-28℃/48-72h;2.液體培養(yǎng)：細(xì)菌35-37℃振蕩培養(yǎng)18-24h,真菌25-28℃靜態(tài)，細(xì)菌液體培養(yǎng)應(yīng)渾濁，真菌液體培養(yǎng)應(yīng)形成菌絲體或孢子懸液記錄培養(yǎng)時間、培養(yǎng)物狀態(tài)(渾濁度、菌落形單菌落分離同6.1.4步驟，挑取單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，確保菌株純度記錄菌落形態(tài)，確認(rèn)無雜菌污染第7頁共13頁編號傳代前準(zhǔn)備1.確認(rèn)待傳代菌株：純培養(yǎng)物(無雜菌、形態(tài)一致),傳代次數(shù)≤4代；2.準(zhǔn)備新鮮培養(yǎng)基(TSA/TSB/SDA),滅菌后冷卻至45-50℃(平板制備)或室溫(液體培養(yǎng)基)一傳代次數(shù)超過5代的菌株禁止用于檢測，需重新復(fù)蘇原始菌株；-平板制備后倒置凝固，避免冷凝水滴落接種操作方法1:平板劃線傳代1.無菌接種環(huán)挑取單菌落；2.按四區(qū)劃線法接種至新鮮TSA/SDA平板；3.細(xì)菌35-37℃培養(yǎng)18-24h,真菌25-28℃培養(yǎng)48-72h;方法2:液體傳代1.用無菌移液管吸取0.1-0.2mL菌液，接種至10mL新鮮TSB培養(yǎng)基；2.細(xì)菌振蕩培養(yǎng)，真菌靜置培養(yǎng)每區(qū)菌落逐漸稀釋，最終形成單菌落；一液體傳代接種量不宜過多，避免營養(yǎng)競爭傳代后質(zhì)量控制1.觀察菌落形態(tài)：與標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)一致(如大腸埃希菌為圓形、光滑、乳白色菌落);2.純度驗(yàn)證：革蘭氏染色鏡檢，無雜菌(細(xì)菌為單一革蘭氏陽性/陰性，真菌為單一菌絲體/孢子);3.活性驗(yàn)證：液體培養(yǎng)物應(yīng)渾濁，平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)符合預(yù)期(10?~108CFU/mL)-若發(fā)現(xiàn)形態(tài)異?；螂s菌污染，立即啟動偏差處理；一活性驗(yàn)證可采用比濁法(麥?zhǔn)媳葷峁?粗略判定第8頁共13頁意事項(xiàng)記錄要點(diǎn)短期儲存?zhèn)€月內(nèi))1.平板儲存：純培養(yǎng)后的TSA/SDA平板，用封口膜密封，倒置儲存于2-8℃冰箱；2.液體儲存：TSB培養(yǎng)物中加入20%無菌甘油(終濃度10%),分裝至無菌離心管，密封后冷藏防止菌落受壓；-液體儲存需標(biāo)注甘油終濃度，避免凍融記錄儲存方式、儲存溫度、分裝量、儲存起始日期長期儲存1.制備菌懸液：挑取單菌落接種至TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期(18-24h);2.離心收集菌體：5000rpm,5min,棄上清，用無菌生理鹽水重懸；3.20%),輕輕混勻；4.分裝至無菌凍存管(每管0.5mL),標(biāo)注信息后放入-80℃冰箱(可先置于-20℃冷凍2h,再轉(zhuǎn)移至-80℃)生長；-凍存防止液氮進(jìn)入或泄漏；一避每次使用后剩余菌株丟棄記錄菌懸液濃度、甘油終濃度、分裝管數(shù)、凍存日期、解凍次數(shù)備用菌株儲存原始菌株復(fù)蘇后，制備3-5份備用凍存管，單獨(dú)存放，標(biāo)注“備用”字樣一備用菌株與常規(guī)使用菌株分區(qū)儲存；一月)復(fù)核備用菌株活性記錄備用菌株數(shù)量、儲存位置、復(fù)核日期及結(jié)果7.1復(fù)蘇/傳代質(zhì)量控制控制項(xiàng)目第9頁共13頁純度驗(yàn)證1.平板菌落形態(tài)均一，無雜菌菌落；2.革蘭氏染色鏡檢為單一菌體形態(tài)；3.生化鑒定(VITEK2)匹配度1.肉眼觀察菌落形態(tài)；2.革蘭氏染色鏡檢；3.生化鑒定卡檢測立即啟動偏差處理(DR-MICRO-002),廢棄該批次菌株，重新復(fù)蘇原始菌株活性驗(yàn)證1.液體培養(yǎng)物：細(xì)菌18-24h渾濁生長，真菌48-72h形成菌絲體；2.平板培養(yǎng)：菌落計(jì)數(shù)10?108CFU/mL(比濁法：0.5-1.0麥?zhǔn)蠁挝?1.觀察培養(yǎng)物狀態(tài)；2.麥?zhǔn)媳葷岱ɑ蚱桨逵?jì)數(shù)法測定濃度若活性不足，延長培養(yǎng)時間(細(xì)菌≤36h,真菌≤96h);仍不合格則重新復(fù)蘇穩(wěn)定性驗(yàn)證的生化特性、抗菌敏感性一致對比生化鑒定結(jié)果、抗菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果(如適用)停止使用該菌株，重新復(fù)蘇原始菌株并驗(yàn)證7.2儲存質(zhì)量控制控制項(xiàng)目短期儲存菌株活性保持≥90%,無雜菌污染每15天抽查挑取少量菌株接種至新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)后驗(yàn)證純度與活性長期儲存菌株活性保持≥80%,無雜菌污染每6個月復(fù)核復(fù)蘇后進(jìn)行純度、活性、生化特性驗(yàn)證儲存環(huán)境監(jiān)控2-8℃冰箱溫度2-8℃,-80℃冰箱溫度≤-70℃,波動≤±5℃每日記錄2次溫度溫度異常時立即啟動應(yīng)急預(yù)案，轉(zhuǎn)移菌株至備用冰箱，排查設(shè)備故障第10頁共13頁×發(fā)生概率)菌株污染高風(fēng)險(4×2)1.操作前生物安全柜紫外線消毒3.操作人員穿戴無菌服、手套、口罩，避免人為污染菌株失活中風(fēng)險(3×2)1.嚴(yán)格按供應(yīng)商推薦條件復(fù)蘇、儲存，避免反復(fù)凍融；2.傳代次數(shù)不超過5代，定期復(fù)核菌株活性；3.備用菌株單獨(dú)儲存，確保應(yīng)急使用菌株變異中風(fēng)險(3×1)1.傳代過程避免過度培養(yǎng)(細(xì)菌≤24h,真菌≤72h);2.定期對比傳代菌株與原始菌株的生化特性；3.長期儲存采用甘油凍存法，減少變異概率操作失誤(如接種錯誤)低風(fēng)險(2×2)1.操作前核對菌株名稱、編號、培養(yǎng)基類型；2.關(guān)鍵步驟雙人復(fù)核(如接種量、培養(yǎng)條件);3.操作人員經(jīng)培訓(xùn)考核合格后方可上崗1.偏差識別：復(fù)蘇/傳代過程中發(fā)現(xiàn)菌株污染、失活、形態(tài)異常、傳代次數(shù)超標(biāo)等不符合控制標(biāo)準(zhǔn)的情況；2.偏差上報：發(fā)現(xiàn)偏差后24小時內(nèi)填寫《偏差處理報告》(DR-第11頁共13頁MICRO-STD-2028-002),上報質(zhì)量負(fù)責(zé)人；3.根本原因分析：采用5Why分析法，排查風(fēng)險來源(如操作污染、培養(yǎng)基不合格、設(shè)備故障等);4.糾正措施：如廢棄不合格菌株、重新復(fù)蘇原始菌株、更換培養(yǎng)基/耗材、維修設(shè)備等；5.效果驗(yàn)證：實(shí)施糾正措施后，重新進(jìn)行菌株復(fù)蘇/傳代，驗(yàn)證質(zhì)量控制指標(biāo)是否合格；6.記錄歸檔：偏差處理完成后，將報告及驗(yàn)證記錄歸檔至質(zhì)量部檔案庫，保存期限≥5年。記錄名稱編號填寫要求保存期限《標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇記錄表》記錄菌株信息、復(fù)蘇步驟、培養(yǎng)條件、質(zhì)量控制結(jié)果，操作人員簽字確認(rèn)≥5年記錄傳代次數(shù)、接種方法、培養(yǎng)條件、純度/活性驗(yàn)證結(jié)果，雙人復(fù)核簽字記錄儲存方式、溫度、分裝量、解凍次數(shù)、復(fù)核結(jié)果，管理員簽字≥5年(至菌株有效期后第12頁共13頁匯總純度、活性、生化特性驗(yàn)證結(jié)果，質(zhì)量負(fù)責(zé)人審核簽字≥5年按要求填寫偏差描述、原因分析、糾正措施、驗(yàn)證結(jié)果≥5年1.記錄填寫：需符合ALCOA+原則，內(nèi)容真實(shí)、準(zhǔn)確、完整，字跡清晰，無涂改(如需修改，需劃改并簽字注明日期);2.電子記錄：所有電子數(shù)據(jù)(如培養(yǎng)箱溫度、生物安全柜運(yùn)行日志)需自動備份，不可篡改，符合FDA21CFRPart11要求；3.歸檔流程：記錄經(jīng)審核簽字后，由質(zhì)量部檔案管理員統(tǒng)一歸檔，分類存放，建立檢索目錄；4.保存期限：所有記錄保存期限≥5年，或至菌株有效期后11.培訓(xùn)要求：所有參與菌株復(fù)蘇/傳代操作的人員需接受本規(guī)程培訓(xùn)，內(nèi)容包括操作流程、質(zhì)量控制、風(fēng)險控制、偏差處理等；2.考核要求：培訓(xùn)后進(jìn)行理論考試(≥90分合格)及實(shí)操考核(操作規(guī)范、結(jié)果合格),考核合格后方可獨(dú)立上崗；3.再培訓(xùn)：本規(guī)程修訂后