前言肺癌是全球最常見的癌癥，據(jù)稱死亡人數(shù)比前列腺癌，結(jié)腸癌和乳腺癌的總和還多,《1990-2017年中國及其各省的死亡率、發(fā)病率和危險因素：2017年全球疾病負(fù)擔(dān)研究的一個系統(tǒng)分析》的研究，是一項關(guān)于中國人口健康的全面研究報告。該研究根據(jù)壽命損失年數(shù)（YLL，因某種疾病少活了多少年）的多少，從282類致死原因中找出了2017年中國人的前三大死亡原因，分別是：中風(fēng)、缺血性心臟病、癌癥，而肺癌居眾多癌癥之首。根據(jù)腫瘤類型和發(fā)病階段，肺癌患者的治療通常包括手術(shù)切除和放化療。盡管外科手術(shù)切除為肺癌患者提供了最佳的治療效果，但90%患者在剛診斷時已處于中晚期，失去了最佳手術(shù)的時期，目前，服用化療藥物仍是大多數(shù)患者的唯一選擇。近年來，肺癌的靶向治療取得了較大進(jìn)展，但這些方法仍受到適用人群、應(yīng)答率等限制，因而研發(fā)針對性更強(qiáng)的治療方法具有重要意義[1]。DEAD-boxRNA解旋酶3（DDX3）是DEAD-box蛋白的高度保守家族成員，DEAD-box蛋白是ATP依賴的簇，是最大的RNA解旋酶家族。能夠解開RNA雙鏈體并涉及多個RNA加工程序，包括mRNA剪接，RNA編輯，出口，RNA衰變，核糖體生物發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控等[2,3]。DEAD-box家族的特征在于ATP酶和解旋酶活性的調(diào)節(jié)，RNA代謝的調(diào)節(jié)以及RNA結(jié)合蛋白或分子伴侶與其他蛋白或RNA相互作用的參與者。DDX3有兩個指定的同源物分別位于X和Y染色體上的DDX3X和DDX3Y[4，5]。而DDX3Y位于無精子癥的無精子因子a（AZFa）區(qū)域Y染色體，在睪丸中特異性表達(dá)，在精子成熟和雄性育性中起重要作用[6，7]。DDX3X與DDX3Y在蛋白質(zhì)上有92％的相似性，序列同一性，并編碼為662-或661個氨基酸的多肽，具體取決于mRNA選擇性剪接[8]DDX3X在大多數(shù)情況下無所不在，而DDX3Y表達(dá)僅限于男性種系在雄性育性中起作用[9]。前人的研究結(jié)果證實DDX3和KRAS都是肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵癌基因.對于DDX3作為一個RNA解旋酶在包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥中表達(dá)失調(diào)。乳腺癌中，超過30%的患者DDX3高表達(dá)[10]。宮頸癌細(xì)胞中，DDX3通過直接調(diào)控細(xì)胞周期蛋白E1(CyclinE1)的翻譯來調(diào)控細(xì)胞周期[11,12]。髓母細(xì)胞瘤中，DDX3是Wnt/β-catenin信號通路的重要組成因子[13]。盡管上述研究證實了DDX3在多種癌癥中發(fā)揮癌基因的作用，但DDX3在肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用仍處于探索階段。

材料與方法一．實驗材料1.WesternBlot所需試劑表1所需試劑配方2×Lysisbuffer30%丙烯酰胺儲存液1.5MTris-HCl(pH=8.8)1.0MTris-HCl(pH=6.8)10%SDSTris-Glycine電泳緩沖液Tris-Glycine電轉(zhuǎn)緩沖液10%過硫酸銨10XTBST洗膜緩沖液1×TBST洗膜緩沖液5%TBST-Milk封閉液1.211gTris，1.753gNaCl，2mLNP-40，調(diào)節(jié)pH值至7.5，用雙蒸水定容到100mL29g丙烯酰胺，1gN,N'-亞甲基雙丙烯酰胺，雙蒸水溶解定容到100mL，0.45μm濾膜過濾至棕色瓶，4℃保存Tris18.17g，雙蒸水溶解，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值到8.8，定容到100mLTris12.11g，雙蒸水溶解，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值到6.8，定容到100mLSDS10g,雙蒸水溶解，定容到100mL3.02gTris，18.8g甘氨酸，10mL10%SDS定容至1L3.03gTris，14.41g甘氨酸，850mL雙蒸水，150mL甲醇現(xiàn)用現(xiàn)加，提前預(yù)冷過硫酸銨1g，雙蒸水溶解定容到10mL，分裝到1.5mLEP管中，-20℃保存2.92gNaCl,0.5mLTween-20,10mL1.0MTris-HCl(pH=8.0)，定容到500mL50mL10×TBST洗膜緩沖液,450mL雙蒸水，混勻5g脫脂奶粉，100mL1×TBST充分混勻攪拌2.瓊脂糖凝膠電泳所需試劑表2所需試劑配方50×TAE電泳緩沖液10×loading10g/L溴化乙錠(EB)溶液1%瓊脂糖凝膠Tris堿242g冰乙酸57.1mLEDTA18.6g,20gNaOH溶于終體積1000mLddH2O中，使用時稀釋50倍0.25%溴酚蘭、0.25%二甲苯青、30%甘油混勻后保存于4℃0.2gEB溶于20mL去離子水中，混勻后4℃避光保存，使用時終濃度為0.5mg/L1%瓊脂糖分別溶于1×TAE中，微波爐加熱至完全溶解細(xì)菌培養(yǎng)所需試劑表3細(xì)菌培養(yǎng)所需試劑配方LB液體培養(yǎng)基LB瓊脂平板固體培養(yǎng)基將2g胰蛋白胨，2gNaCl、1g酵母提取物溶于200mLddH2O中，121℃高壓滅菌30min，4℃保存?zhèn)溆迷?00mLLB液體培養(yǎng)基中加入3g瓊脂粉，121℃高壓滅菌30min，待溫度降至40-50℃以下時加入200μL氨芐青霉素（Amp+），混勻直接倒入平板中,待冷卻凝固后用封口膜封好倒置放于4℃保存?zhèn)溆眉?xì)胞培養(yǎng)所需試劑表4細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑配方10%FBS-RPMI1640完全培養(yǎng)液磷酸鹽緩沖液（PBS）PBS-EDTA0.25%胰蛋白酶消化液細(xì)胞凍存液含5mLFBS、45mLRPMI1640和0.1%青鏈霉素4gNaCl,0.1gKCl、1.79gNa2HPO4?12H2O、0.12gKH2PO4，溶于500mLddH2O中，121℃高壓滅菌30min，4℃保存?zhèn)溆?.37gEDTA溶于500mLPBS中，121℃高壓滅菌30min，4℃保存?zhèn)溆?.25g胰蛋白酶溶于100mLPBS中，0.22μm濾器過濾，4℃保存?zhèn)溆?0%二甲亞砜（DMSO）、90%FBS試劑盒表5試劑盒公司來源SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR?PremixExTaqTMDNA快速膠純化回收試劑盒質(zhì)粒小量提取試劑盒BCA蛋白濃度測定試劑盒質(zhì)粒大量提取試劑盒慢病毒包裝、濃縮及病毒滴度測定試劑盒Invitrogen公司產(chǎn)品全式基因生物科技有限公司產(chǎn)品Transgen公司產(chǎn)品威格拉斯（Vigorous）公司產(chǎn)品威格拉斯（Vigorous）公司產(chǎn)品QIAGEN公司產(chǎn)品MiltenyiBiotec公司產(chǎn)品儀器與設(shè)備表6儀器設(shè)備品牌冷凍臺式離心機(jī)PCR儀Real-timePCR儀熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)CO2培養(yǎng)箱-80oC冰柜MilliQPlus超純水系統(tǒng)微量加樣器電泳儀Hettich,GermanyBio-RadPTC-100Bio-RadIQ5，Bio-RadCFX96NikonRevcoThermoMilliporeEppendorf北京百晶&Bio-Rad二.實驗方法1.蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）1.1蛋白質(zhì)的提取和定量（1）細(xì)胞間收取所用細(xì)胞到1.5毫升EP管中，PBS洗沉淀兩次，加入加了100X蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，隔十分鐘渦旋幾次，4℃離心機(jī)12000rpm離心15min，吸取上清。（2）使用BCA試劑盒測樣品濃度，加入計算好的ddH2O和5×loading的體積，100℃金屬浴煮10min，存于-20℃?zhèn)溆谩?.2蛋白的SDS電泳（1）先測試是否漏液，記錄上樣順序，樣品左右兩側(cè)用蛋白Marker作為對照。（3）通電，電壓80V跑出濃縮膠后調(diào)成120V，距膠底部0.5cm處關(guān)閉電源。1.3轉(zhuǎn)膜（1）準(zhǔn)備新配好的1升電轉(zhuǎn)液和PVDF（PolyvinylideneFluoride，聚偏氟乙稀）膜(83mm×50mm)，甲醇激活PVDF膜5秒。（2）提前準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)膜物品，注意黑膠白膜，膠和膜還有濾紙之間要將氣泡排干凈。（3）轉(zhuǎn)膜放在冰盒中，通電，恒流320mA開始。1.4封閉現(xiàn)用現(xiàn)配5%脫脂牛奶，用1XTBST清洗膜5分鐘，把膜浸沒在封閉液中，搖床緩慢搖1小時。1.5孵一抗裁膜放到稀釋好的一抗中，4℃搖床過夜。1.6洗膜回收一抗，用1XTBST洗膜三次每次10min。1.7孵二抗：將膜放入用封閉液稀釋好的二抗溶液中，室溫?fù)u床輕搖一小時。1.8洗膜用1XTBST漂洗膜每次5min，洗四次。1.9發(fā)光鑒定（1）膜從TBST中取出，在干凈衛(wèi)生紙上輕點吸除溶液殘留。提前配好顯色液，切記要避光，將膜放進(jìn)凝膠成像儀中，滴加混合液到膜上，根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時間和區(qū)域，得到最佳結(jié)果。2.分子克隆構(gòu)建敲低質(zhì)粒DDX3X2.1.設(shè)計敲低DDX3X的shRNA送于北京擎科測序公司進(jìn)行合成。2.2酶切空載體plko.1，體系如下：Age12ulEcoR12ulplko.12ul10*cutsmartbuffer5ulddH2O39ul條件：37度水浴過夜2.3膠回收：將酶切的載體進(jìn)行膠回收，膠回收步驟如下：(1)切膠：先配好瓊脂糖凝膠，電泳跑膠，在UVUA光下切取目的條帶，放入稱量好的1.5毫升EP管內(nèi)。(2)加入量為膠塊質(zhì)量三倍的融膠液GM，水浴37℃，每2min震蕩一次直至完全溶解。(3)溶液移到收集柱中，室溫離心12000rpm，1min。(4)倒去融膠液，加入700ulWB，室溫離心12000rpm，1min并重復(fù)一次。(5)棄去WB，室溫空離一次12000rpm2min。(6)加入65度預(yù)熱的ddH2O，室溫離心12000rpm1min。(7)使用Nandrop測濃度。2.4合成的shRNA先融水然后退火，95度10min,關(guān)機(jī)退火4h,自然冷卻要貼條,不能開蓋。2.5連接：退火后shRNA與酶切完的載體連接，使用NEB的T4連接酶置于16度大于4h。2.6轉(zhuǎn)化：提前用紫外燈照射30min細(xì)菌工作臺。(1)從-80℃冰箱取出stbl3感受態(tài)，取感受態(tài)50ul，加入連接產(chǎn)物10ul，冰浴30min。(2)然后42度金屬浴熱激45s立即放于冰上不少于2min。(3)加入無抗生素LB500ul于37度孵箱搖床上200rpm1h。(4)在細(xì)菌工作臺輕離菌液，去一半上清，剩余菌液渦旋均勻涂布在平板上，37度孵箱過夜。(5)次日挑單克隆菌落，加入含A+抗性的LB，37度搖床搖大約6h，取一半送測序。2.7質(zhì)粒DNA中小劑量提取及定量（1）在細(xì)菌臺接種單個菌落到LB培養(yǎng)基，37℃搖床過夜；室溫1200rpm離心5分鐘，去干凈上清；（2）加入500μl已加入RNaseA的重懸液BufferP1，用移液器充分懸浮混勻細(xì)菌沉淀；（3）再加入500μlBufferP2，溫和緩慢的上下顛倒5-10次，靜置2min。裂解時間控制在5min以內(nèi)，混勻動作不可劇烈；（4）加入500μlBufferP4，立即輕柔地顛倒EP管6-8次，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀；室溫放大約10min，12,000rpm離心10分鐘，管底部形成白色沉淀。（5）柱平衡：用500μl的平衡液BL平衡吸附柱CP4，12,000rpm離心1分鐘。（6）吸取上清液不要觸碰沉淀分批加入過濾柱CS中，12,000rpm離心2min，濾液置于2mlEP管中。（7）加入0.3倍濾液體積的異丙醇，上下混勻后用移液槍吸到CP4中。（8）CP4室溫12,000rpm離心1min，倒掉廢液。（9）加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm離心1min，棄去廢液。（10）繼續(xù)加入600μl加入無水乙醇的漂洗液PW，靜置2-5分鐘，12,000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，重復(fù)漂洗一次。（11）空離2分鐘，將CP4開蓋放在室溫十分鐘，保證晾干殘留的漂洗液。（12）將CP4換一個新的干凈的1.5ml離心管，向吸附膜中間部位加入ddH2O（ddH2O提前在65度金屬浴上預(yù)熱），室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘收集質(zhì)粒溶液。（13）為了提高質(zhì)粒的回收效率，重復(fù)步驟12，測定質(zhì)粒OD260，OD280以及濃度。2.8質(zhì)粒DNA的大劑量制備及純化（1）大搖菌液接種到500ul培養(yǎng)基中活化，然后吸取50μl-100μl接種到200ml液體LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）中，37℃搖床振蕩過夜；（2）4℃離心機(jī)提前預(yù)冷，6000g,15min,離心過夜的LB培養(yǎng)基；（3）10mLBufferP1重懸細(xì)菌沉淀到50ml無酶離心管，加了lysisBlue的P1在層析柜。（4）加入10mLBufferP2，緩慢顛倒4-6次充分混勻，室溫孵育5min(此時溶液慢慢變成藍(lán)色)。（5）在孵育期間，準(zhǔn)備QIAfilterCartridge帽子，QIAfilter管口和離心管(QIArack)。（6）加10ml預(yù)冷的BufferP3,顛倒4-6次成雞蛋花狀，藍(lán)色消失。（7）溶解產(chǎn)物加到QIAfilterCartridge桶內(nèi)，室溫孵育10min。輕推塞子將溶解產(chǎn)物過濾到50ml無酶離心管中，濾液20-25ml左右。（8）加2.5ml的BufferER，顛倒10次左右充分混勻，冰上孵育30min。（9）10mlBufferQBT來平衡QIAGEN-tip500，使液體靠重力流干凈。（10）孵育好的溶解產(chǎn)物過一遍QAGEN-TiP500柱子(即液體靠重力流干凈)。（11）加30ml的BufferQC洗QIAGEN-tip兩遍。（12）加入15ml的BufferQN(提前烘箱65度預(yù)熱）洗脫DNA于一個無內(nèi)毒素?zé)o熱源質(zhì)的管子里。（13）加10.5ml常溫的異丙醇(無RNase)沉淀DNA，小心去上清，離心1h。（14）加入5ml無內(nèi)毒素的室溫的70%的乙醇，6000g，4℃離心30min，小心吸出上清。（15）室溫放幾分鐘晾干，加300ul的無內(nèi)毒素的BufferTE溶解DNA,在干凈環(huán)境中進(jìn)行。（16）提出的質(zhì)粒應(yīng)測濃度并跑電泳驗證，-20度儲存?zhèn)溆谩?.敲低質(zhì)粒DDX3X轉(zhuǎn)染細(xì)胞1.細(xì)胞生長條件本課題所用人胚腎細(xì)胞系293TN用DMEM培養(yǎng)基、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549用1640培養(yǎng)基，均為貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)基中都添加10%FBS，100U/ML青霉素和100U/ML鏈霉素。兩種細(xì)胞在37℃，5%CO2和濕度飽和的孵箱培養(yǎng)。2.凍存細(xì)胞復(fù)蘇提前30min將復(fù)蘇細(xì)胞所用培養(yǎng)基及PBS等放置室溫，提前30min開紫外線消毒。液氮中取出細(xì)胞后我們把凍存管用PE手套包裹，放到37℃水浴鍋中，手輕微搖凍存管，促使細(xì)胞快速溶解。800rpm離心5min，棄上清。用槍吸1ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀，移到10厘米培養(yǎng)皿中，雙手用十字交叉法緩慢晃動培養(yǎng)皿讓細(xì)胞均勻分布，置于37℃孵箱培養(yǎng)。3.細(xì)胞傳代細(xì)胞密度在80%-90%時需傳代。顯微鏡下觀察后在生物安全柜中操作，倒掉培養(yǎng)基，先加2mlPBS，輕微晃動用移液器小心吸掉PBS。加入2ml胰酶消化2-3min，等顯微鏡下看到貼壁細(xì)胞變圓，細(xì)胞的間隙變大后就加入2ml完全培養(yǎng)基中和胰酶。用移液器輕柔緩慢吹散細(xì)胞吸到15毫升離心管中。800rpm離心5min，去上清，用1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按需求比例移至培養(yǎng)皿中。置于37℃孵箱孵育。4.細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體介導(dǎo)真核生物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)）（1）轉(zhuǎn)染前天我們計數(shù)鋪板達(dá)到實驗所需密度。（2）按比例分別稀釋轉(zhuǎn)染試劑和目的質(zhì)粒，靜置5min。（4）取100ul混合液加入到稀釋質(zhì)粒中，室溫靜置20min。期間為細(xì)胞換液，更換為無抗生素的1ml培養(yǎng)基。（5）將混合物與細(xì)胞混勻，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h之后換液再培養(yǎng)24-48h。（6）轉(zhuǎn)染24h后收細(xì)胞檢測RNA變化，48h后檢測蛋白變化。5.慢病毒包裝目的質(zhì)粒：PSPAX.2:PMD2G為6：4.5：1.5，轉(zhuǎn)染試劑為neofect。（1）稀釋液Opti-MEM：轉(zhuǎn)染試劑neofect按6孔板一孔為100ul：5ul靜置5min。（2）稀釋液Opti-MEM：PSPAX2：PMD2G為100ul：4.5ug：1.5ug稀釋靜置5min。（3）取6ug目的質(zhì)粒對應(yīng)加入到稀釋后的雙質(zhì)粒系統(tǒng)輕柔混勻，做好標(biāo)記。（4）每孔100ulneofect加入到質(zhì)粒稀釋液中，靜置20min，為293T換液，換為1ml無雙抗的DMEM。（5）靜置后加入對應(yīng)孔中。培養(yǎng)48h（注：4--6h后補(bǔ)加雙抗防止細(xì)胞污染）（6）培養(yǎng)48h后收取上清，室溫離心10min，上清用0.45um過濾膜過濾。（7）病毒上清按體積比4：1加入PEG-it，充分混勻，4度冰箱靜置12h-72h。（8）6孔板鋪A549細(xì)胞，在密度為60%-70%時感染細(xì)胞。（9）感染細(xì)胞4-6h后加雙抗和puro藥篩，24h后收細(xì)胞檢測功能。4.實時定量PCR4.1Trizol法提取總RNA（1）往1.5毫升離心管內(nèi)加1毫升Trizol；（2）加200微升三氯甲烷，上下顛倒幾次混勻，室溫靜置10分鐘；（3）4℃離心15分鐘，吸取上清至新的離心管中；（4）加入同體積的異丙醇，渦旋混勻，-20℃放置一段時間來增加RNA沉淀；（5）離心15分鐘，棄上清，保留沉淀；（6）加入800微升75%乙醇，溫和振蕩懸浮沉淀；（7）離心5分鐘，盡量棄上清，重復(fù)兩次；（8）吸凈上清，室溫晾干數(shù)分鐘，沉淀不能太過干燥；（9）用無酶水溶解沉淀，測濃度。4.2逆轉(zhuǎn)錄與實時PCR（1）冰盒中向0.65mlEP管加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暫離心。（2）65℃金屬浴5min，立刻冰浴2min。（3）短暫離心，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ulM-MLV，1ulRNAseInhibitor。（4）低速渦旋，42℃金屬浴1小時，70℃金屬浴15min，進(jìn)行PCR或-80℃保存。（7）每個樣品設(shè)三個復(fù)孔，反應(yīng)體積為20μL，反應(yīng)體系：2×SYBRMix(10mM)10μL10μMPrimer10.4μL10μMPrimer20.4μLcDNA0.2μLddH2O9.0μLTotal20μL（8）儀器設(shè)置完成運行程序并保存數(shù)據(jù)。（9）分析數(shù)據(jù)：我們待程序完成后就設(shè)置樣本對照和內(nèi)參基因，分析目的基因的相對表達(dá)。5.cck8細(xì)胞增殖實驗（1）用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞要吹打均勻，在細(xì)胞間用五板96孔板鋪成每孔為100微升的細(xì)胞懸液，分別設(shè)置為0h,24h.48h,72h和96h。（2）鋪完細(xì)胞后在0h的96孔板每孔加入10微升cck8溶液，一起放入細(xì)胞間孵箱中培養(yǎng)。（3）2-3h后將0h的96孔板先在酒精燈下將孔中氣泡去除，然后用酶標(biāo)儀測定450和630nm處的吸光度。其他板數(shù)在測定時間前4h內(nèi)加入cck8溶液。（4）最后制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，來測定樣品的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果1.病例水平證實DDX3X在肺癌中作為癌基因發(fā)揮作用收集了肺癌病例，并從正常組織，肺腺癌以及癌旁組織中提取出蛋白進(jìn)行WesternBlot實驗，結(jié)果顯示DDX3X在肺癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高（圖1）。圖1.DDX3X在肺癌患者中的表達(dá)。a肺腺癌b癌旁c正常組織2.細(xì)胞水平敲低DDX3X顯著抑制肺癌細(xì)胞的生長（1）構(gòu)建敲低DDX3X的shRNA,以質(zhì)粒plko.1為載體骨架，構(gòu)建敲低DDX3X的shRNA1,shRNA2和shRNA3，使用293T進(jìn)行慢病毒包裝，感染肺癌細(xì)胞A549，WesternBlot檢測構(gòu)建shRNA的敲低效率，結(jié)果顯示：DDX3X敲低成功，其中shRNA1和shRNA2敲低效果更顯著（圖2）。圖2.DDX3X在A549細(xì)胞中敲低效率的檢測。（2）取敲低效率顯著的shRNA1和shRNA2進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗，結(jié)果顯示，敲低DDX3X后能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖（圖3）。圖3敲低DDX3X后肺癌細(xì)胞增殖的檢測。討論我們從收集的肺癌患者病例中首先通過組織提取出蛋白進(jìn)行蛋白定量，然后用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測出DDX3的蛋白水平異常升高，根據(jù)文獻(xiàn)中對DDX3在各種癌癥中表達(dá)失調(diào)的表現(xiàn)，RNA解旋酶是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)劑，在RNA代謝的幾乎所有方面都發(fā)揮作用，我們可以確定DDX3在肺癌中有很大可能作為癌基因在發(fā)揮作用，DDX3可能的致癌作用是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。它通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S過渡，從而促進(jìn)細(xì)胞生長。它調(diào)節(jié)G1/S特定的翻譯cyclinE1mRNA，RNA解旋酶活性是必需的過程[12,13,14]。此外，DDX3與DDX5交互在小鼠胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞周期的G2/M期[15,16]證據(jù)表明DDX3可以調(diào)節(jié)在腫瘤發(fā)生中至關(guān)重要的基因的轉(zhuǎn)錄。所以我們從細(xì)胞水平通過構(gòu)建敲低DDX3X的質(zhì)粒進(jìn)一步檢測DDX3在肺癌中的作用。我們以質(zhì)粒plko.1為載體骨架，構(gòu)建敲低DDX3X的shRNA1,shRNA2和shRNA3，使用293T進(jìn)行慢病毒包裝，感染肺癌細(xì)胞A549，之后蛋白質(zhì)免疫印跡法證實DDX3X敲低成功，用敲低效果更加明顯的shRNA1和shRNA2進(jìn)行了細(xì)胞增殖實驗，結(jié)果顯示敲低后的DDX3X能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖，這更加確定了DDX3在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用。此外我們發(fā)現(xiàn)DDX3在肺癌細(xì)胞中表達(dá)水平異常增高的同時，DDX6和KRAS在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平于鄰近正常組織相比也是高表達(dá)。在大腸癌中，DDX6調(diào)節(jié)基因Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜以及翻譯控制。DDX6的酵母同系物據(jù)報道DNA損傷后細(xì)胞周期停滯在G1/S的恢復(fù)中也很重要。其負(fù)責(zé)恢復(fù)在mRNA代謝的功能調(diào)節(jié)[17,18]。在人類宮頸癌細(xì)胞系中Hela，DDX6的表達(dá)在細(xì)胞過程中被上調(diào)，分化過程中增殖和下調(diào)。DDX6的耗盡會通過誘導(dǎo)DDX6阻礙細(xì)胞生長細(xì)胞周期停滯在S期。DDX6與eIF4E的交互暗示可能翻譯的翻譯啟動基因參與細(xì)胞增殖[19]。85%的患肺癌患者都被診斷為非小細(xì)胞肺癌，這里面70%的患者為肺腺癌。研究表明，肺腺癌中有30.9%的患者都攜帶著Kras基因突變，K-Ras對人類各種癌癥的影響非常大，KRAS基因可以控制調(diào)控細(xì)胞生長的路徑；異常時會讓細(xì)胞持續(xù)生長，KRAS參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞，當(dāng)K-ras基因發(fā)生突變不能產(chǎn)生正常功能蛋白就使胞內(nèi)信號傳導(dǎo)功能紊亂，細(xì)胞突變增殖失去控制進(jìn)而發(fā)生癌變。在結(jié)直腸癌的一項研究表明，DDX3通過增強(qiáng)SP1結(jié)合在KRAS啟動子上可以促進(jìn)Kras的轉(zhuǎn)錄[20]。而目前肺癌治療中仍然沒有靶向Kras的藥物。因此尋找新的下游信號通路具有重要研究意義。綜上所述，雖然現(xiàn)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展越開越迅速，但是肺癌的治愈率依舊很低，許多癌基因在肺癌的治療中起到關(guān)鍵性作用，肺癌也因各類靶基因的出現(xiàn)而發(fā)生革命性變化，所以從基因水平研究肺癌的各種發(fā)生機(jī)制，對今后肺癌的早期診斷和治療更加有關(guān)鍵指導(dǎo)意義，在此實驗中可以將DDX3X作為治療肺癌的靶基因進(jìn)行研究，從而使更多的肺癌患者在靶向治療中獲益。結(jié)論DDX3X在肺癌中作為癌基因發(fā)揮作用，敲低DDX3可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖。

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