雞球蟲病的診斷研究國內(nèi)外文獻綜述目錄TOC\o"1-3"\h\u32441雞球蟲病的診斷研究國內(nèi)外文獻綜述 133961.1傳統(tǒng)方法 1294911.2血清學診斷 156041.3分子生物學診斷 221701參考文獻 41.1傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法一般根據(jù)臨床癥狀、腸道病變、寄生部位、致病性和卵囊形態(tài)等指標來診斷雞球蟲?。ɡ罱返?009；JoynerandLong1974）。雞感染不同種類的球蟲往往出現(xiàn)不同的臨床癥狀和腸道病變，如感染高致病性的E.tenella或E.necatrix會出現(xiàn)精神沉郁、翅膀下垂、食欲減退、腹瀉、排血便甚至死亡，死后剖檢可見被寄生部位的腸段高度腫大，呈深紅色，漿膜層出現(xiàn)針尖大小的白色壞死點或大小不一的出血點，剪開腸道可見大量血凝塊、粘液和壞死的腸黏膜，腸壁變??；而感染E.mitis和E.praecox則主要表現(xiàn)為吸收不良、增重和飼料轉(zhuǎn)化率降低，腸道病變也較輕（李武堯2012；汪明2003）。臨床上，單個宿主常感染多種雞球蟲，從而導(dǎo)致腸道中寄生部位的重疊以及病變范圍的變化；而同種球蟲的不同蟲株在致病性方面往往也存在差異，不能單獨作為判斷種類的依據(jù)（Shirley1985）。臨床常用直接涂片法或飽和鹽水漂浮法檢查糞便樣品中的卵囊來判斷是否存在球蟲感染，利用麥克馬斯特氏法（MacMaster′smethod）得到每克糞便卵囊數(shù)（Oocystspergramoffeces，OPG）還能一定程度反映球蟲的感染強度（汪明2003）。但若想通過卵囊形態(tài)鑒別雞球蟲種類，除了E.maxima有較大的淡黃色卵囊易于區(qū)分外，其它雞球蟲卵囊無極冒，無明顯的卵孔，卵囊壁的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地相似，孢子囊的形狀和大小也無明顯區(qū)別，因此鑒別有一定難度且需要專業(yè)人員（LongandJoyner1984）。1.2血清學診斷目前有很多用于檢測雞球蟲病的血清學方法，如中和試驗、瓊脂免疫擴散法、子孢子和裂殖子溶解試驗、子孢子制動反應(yīng)、間接熒光抗體法和酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）等（Davisetal.1978）。Saatara等（1984）利用ELISA和間接血凝法（Indirecthemagglutilation，IHA）測定實驗感染雞對柔嫩艾美耳球蟲的抗體反應(yīng)，ELISA技術(shù)相對容易操作，比IHA檢測更敏感，而且只需要IHA所需抗原的一小部分。Uchida等（1994）用卵囊制備的可溶性抗原進行ELISA發(fā)現(xiàn)，3種球蟲（E.tenella、E.necatrix、E.acervulina）免疫雞血清之間存在交叉反應(yīng)，其中E.tenella和E.necatrix之間的交叉反應(yīng)更為明顯。利用免疫印跡法檢測E.tenella卵囊抗原，同源抗血清檢測出7條主條帶，E.necatrix和E.acervulina抗血清分別檢測出10條和6條主條帶。1.3分子生物學診斷1.3.1同工酶分析早期Shirley（1975）利用同工酶分析，發(fā)現(xiàn)6種艾美耳球蟲（E.brunetti、E.tenella、E.acervulina、E.maxima、E.praecox、E.necatrix）的乳酸脫氫酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的淀粉凝膠電泳存在種內(nèi)和種間差異，可以作為鑒別雞球蟲種類的指標，但由于試驗分析需要大量的卵囊和復(fù)雜的操作，此方法的臨床應(yīng)用受到了一定程度的限制。1.3.2限制性片段長度多態(tài)性分析（Restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis，RFLP）Ellis和Bumstead（1990）首次將印跡分析（Southernblot）結(jié)合RFLP應(yīng)用于雞球蟲鑒定，成功區(qū)分E.tenella、E.acervulina和E.necatrix等三種球蟲。后來Woods等（2000）在變性凝膠上對第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internaltranscribedspacer2，ITS-2）的擴增產(chǎn)物進行RFLP分析，制出了單個物種的特征圖譜，成功對澳大利亞的6種雞球蟲種類（除了E.mitis）進行了鑒定，同時也證明ITS-2是具有實用性的遺傳標記。1.3.3隨機擴增多態(tài)性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD）Macpherson和Gajadhar（1993）首次利用RAPD技術(shù)成功鑒別來自不同宿主的7種艾美耳球蟲，其中一種來自于雞（E.tenella）。劉群等（2000）分析了國內(nèi)4種雞球蟲和多個蟲株間的RAPD多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)RAPD技術(shù)可以用于雞球蟲種類鑒定，并且可用來篩選區(qū)分不同蟲株的分子標記。RAPD的引物序列是任意的，不需要事先了解基因組序列，還可以用于篩選序列特征擴增區(qū)（Sequencecharacterizedamplifiedregion，SCAR），該區(qū)域可以作為物種特異性或蟲株特異性遺傳標記。雖然RAPD在球蟲種內(nèi)和種間鑒定都取得到了廣泛應(yīng)用，但是RAPD重復(fù)性較差，并且由于在電泳時多個序列可能隱藏在共遷移帶中，這種技術(shù)不適用于混合感染的檢測（MorrisandGasser2006）。1.3.4PCR隨著不同分子標記的發(fā)現(xiàn)和各種PCR技術(shù)的發(fā)展，PCR在雞球蟲的鑒別診斷和系統(tǒng)發(fā)育分析方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。Stucki等（1993）基于E.tenella的5S核糖體DNA（5SribosomalDNA，5SrDNA），利用反向PCR技術(shù)擴增出特異性條帶，證明核糖體RNA（RibosomalRNA，rRNA）基因可以用來鑒別球蟲種類。Tsuji等（1997）結(jié)合PCR和RAPD技術(shù)，擴增出8種雞球蟲的小亞單位核糖體RNA（SmallsubunitrRNA，SSUrRNA）基因，發(fā)現(xiàn)有8條RAPD引物可用于種類的鑒定，建立了兩步法聚合酶鏈反應(yīng)成功鑒別8種雞球蟲（當時認為E.hagani也是一種雞球蟲）。Ogedengbe等（2011）比較了球蟲部分線粒體細胞色素C氧化酶亞基（cytochromecoxidasesubunitI，COI）和接近完整的18SrDNA序列，將COI基因作為DNA條形碼標記，建立了更可靠的用于球蟲物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的DNA條形碼技術(shù)。Fernandez等（2003a，b）篩選出能夠有效區(qū)分7種雞球蟲的RAPD引物，轉(zhuǎn)換為種特異性SCAR標記后建立了能夠同時檢測7種雞球蟲的多重PCR方法。Vrba等（2010）基于SCAR標記的唯一單拷貝序列建立了可以定量檢測7種雞球蟲的定量PCR（Quantitativepolymerasechainreaction，qPCR），能夠檢測到相當于單個孢子化卵囊的DNA量。Peek等（2017）將Vrba等（2010）的方法合并為3種多重qPCR方法，同時改變了提取方法以便能夠直接分析新鮮糞便。研究顯示，盡管雞球蟲rDNA本身較為保守，但是內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internaltranscribedspacer，ITS）在蟲種之間的長度和序列相對異質(zhì)，因此可以作為良好的分子標記（王鑫等2009；夏延富2009；夏延富等2009；薛方民2007）。Schnitzler等（1998）基于4種雞球蟲的第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internaltranscribedspacer1，ITS-1）序列設(shè)計了種特異性引物，建立的PCR方法僅需約25個卵囊便能檢測出球蟲。Lew等（2003）針對ITS-1序列用巢氏PCR來鑒定雞球蟲，You（2014）建立了可同時檢測4種雞球蟲的多重PCR方法，檢測閾為1～4pg；辛玲等（2008）針對ITS-1序列建立了3種雞球蟲的單輪PCR和多重PCR方法，最小檢出量為0.5ng，范現(xiàn)成等（2019）在此基礎(chǔ)上建立了E.tenella和E.maxima雙重PCR檢測方法。Gasser等（2001；2005）對7種雞球蟲ITS-2基因進行PCR擴增，分別利用基于熒光標記的自動化電泳法和毛細管電泳法進行電泳，篩選出色譜圖上特異的色譜峰用于蟲種鑒定，在雞球蟲混合感染時同樣適用。Morgan等（2009）針對雞球蟲ITS-2序列，使用TaqManMGB技術(shù)和種特異性探針建立定量PCR（Quantitativepolymerasechainreaction，qPCR）方法，實現(xiàn)了對7種雞球蟲的特異性檢測和定量。1.3.5環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）LAMP是一種簡單、快速且相對便宜的診斷工具。Barkway等（2011）開發(fā)了一套針對7種雞球蟲的種特異性LAMP檢測方法，能夠檢測到1到10個艾美耳球蟲卵囊的基因組，相當于不到一個成熟裂殖體的基因量。1.3.6納米PCR納米PCR（Nanoparticle-assistedPCR，nano-PCR）是結(jié)合納米技術(shù)與分子生物學的一種新型PCR方法，體系中的納米粒子在反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用（Alietal.2018）。首先，某些納米粒子具有良好的導(dǎo)熱性，可以提高體系加熱和冷卻的速率。Li等（2005a）發(fā)現(xiàn)金納米粒子優(yōu)異的傳熱性能可以明顯使普通PCR的靈敏度提高5~10倍，使實時熒光PCR的靈敏度提高104倍；還有研究者發(fā)現(xiàn)25nm的TiO2納米粒子能夠通過自身良好的導(dǎo)熱性提高反應(yīng)緩沖液的熱導(dǎo)率來增強PCR效率，有助于大幅減少PCR反應(yīng)周期，并增強DNA擴增（包括難以擴增的GC含量高的DNA模板）（AbdulKhaliqetal.2010）。其次，納米粒子還能發(fā)揮與單鏈結(jié)合蛋白（Singlestrandbindingprotein，SSB）類似的作用，顯著降低引物和模板的錯配從而提高特異性。Li等（2005b）發(fā)現(xiàn)金納米粒子能夠提高PCR反應(yīng)的特異性并推測可能和金納米粒子發(fā)揮的類似SSB的機制有關(guān)，其增強效果甚至超過市面上可用的SSB；而氧化石墨烯（Grapheneoxide，GO）能夠通過促進匹配的引物-模板復(fù)合物的形成，抑制錯配引物的擴增來增強PCR反應(yīng)的特異性（Wang2017）。另外，在PCR體系中，納米粒子還能夠吸附DNA聚合酶、Mg2+、寡核苷酸引物或DNA模板，使PCR反應(yīng)物聚集，提高反應(yīng)效率（Baietal.2015）。納米粒子的這些作用，使得納米PCR相較于普通PCR具有更高的敏感性和特異性，在病原檢測方面的應(yīng)用日趨廣泛。納米PCR近年來開始應(yīng)用于不同寄生性原蟲的檢測，Gabriel等（2018）使用氧化石墨烯、氧化銅、氧化鋁納米顆粒和屬特異性探針，建立了快速檢測食腦性阿米巴原蟲（Acanthamoebaspp.，Balamuthiamandrillaris，Naegleriafowleri）的納米PCR方法并優(yōu)化得到了針對不同食腦性阿米巴原蟲的最佳納米粒子用量。Upadhyay等（2020）發(fā)現(xiàn)在檢測犬巴貝斯蟲（Babesiacanisvogeli）和犬肝簇蟲（Hepatozooncanis）的PCR體系中加入氧化鋅納米絮凝劑能夠顯著增強PCR檢測靈敏度，同時在不影響DNA擴增產(chǎn)量的情況下，減少了約45%～50%的反應(yīng)時間。目前尚未有利用納米PCR特異性檢測雞球蟲的相關(guān)報道。參考文獻畢菲菲,郝振凱,孫霈,于詠蘭,索勛,劉賢勇.2018.雞球蟲病防治藥物及抗藥性研究.寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報,25(4):242-253董輝,索勛.2002.毒害艾美耳球蟲的致病性研究.寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報,9(3):129-135杜彩娟.2016.毒害艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫的構(gòu)建與篩選.[碩士學位論文].揚州:揚州大學范現(xiàn)成,馬峋,張會軍,唐歡,宋軍科,趙光輝.2019.雞柔嫩艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲雙重PCR檢測方法的建立.動物醫(yī)學進展,40(2):17-21和瀟,周宏生,楊再旭,和平.2010.雞急性小腸球蟲病診斷與藥物試驗.養(yǎng)殖與飼料,(12):16-17李超,顧小龍,盧春霞,廖琴,劉賢勇,索勛.2018.我國雞球蟲病流行病學研究進展.寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報,25(4):230-241李佳暖,李得鑫,崔元,袁萬哲,孫繼國.2018.牛病毒性腹瀉高效納米PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用.中國獸醫(yī)學報,38(2):252-254李建梅,劉丹丹,任春芝,許金俊,陶建平.2009.和緩艾美球蟲與早熟艾美球蟲的分離與鑒定.中國動物傳染病學報,17(4):57-60李建梅.2011.四種雞艾美球蟲ITS區(qū)序列分析及毒害與巨型或柔嫩艾美球蟲間在免疫上相互影響的研究.[碩士學位論文].揚州:揚州大學李武堯.2012.育成期蛋雞暴發(fā)小腸球蟲病的診斷與治療.養(yǎng)禽與禽病防治,(5):21-22廖申權(quán),戚南山,呂敏娜,吳彩艷,李娟,蔡海明,林栩慧,胡俊菁,于林增,張健騑,謝明權(quán),孫銘飛.2020.雞球蟲病流行病學、防治藥物與疫苗研究進展.廣東農(nóng)業(yè)科學,47(11):171-181劉國昌,林瑞慶,嚴浩,胡錢江,劉麗丹,翁亞彪.2013.5株堆型艾美耳球蟲頂質(zhì)體rpoB基因的擴增及序列分析.河南農(nóng)業(yè)科學,42(2):145-148劉梅,李建梅,劉丹丹,王尚尚,沈欣悅,程旭,劉加圣,戴亞斌,陶建平.2011.一毒害艾美耳球蟲田間分離株耐藥性分析.中國家禽,33(24):30-35劉梅,劉丹丹,李建梅,王尚尚,程旭,沈欣悅,戴亞斌,陶建平.2013.不同日齡雞對毒害艾美耳球蟲的易感性研究.畜牧與獸醫(yī),45(10):13-16龍航宇,呂夢娜,郭宸旭,尹樂子,林瑞慶.2020.雞4種艾美耳球蟲單一蟲種與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染對雞生產(chǎn)性能的影響.中國獸醫(yī)雜志,56(9):30-33秦彤,周靈,由欣月,梁琳,史利軍,張建偉,李金祥,崔尚金.2019.犬細小病毒高效納米PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用.畜牧獸醫(yī)學報,50(6):1268-1274汪明.2006.獸醫(yī)寄生蟲學(第3版).北京:中國農(nóng)業(yè)出版社王鑫,韓紅玉,姜連連,趙其平,董輝,韓靜芳,黃兵.2009.雞球蟲18SrRNA基因序列的測定與分析.生物技術(shù)通報,(S1):305-309王鑫.2007.雞艾美耳球蟲純株的建立與DNA條形編碼初探.[碩士學位論文].北京:中國農(nóng)業(yè)科學院夏延富,陳兆國,陳鐵橋,米榮升,薛方民.2009.雞六種艾美耳球蟲ITS-1的克隆和序列分析.中國家禽,31(13):24-27夏延富.2009.雞球蟲不同種株的ITS序列及RAPD分析.[碩士學位論文].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學謝雯琴.2010.雞球蟲線粒體、頂質(zhì)體基因多態(tài)性及線粒體全基因組研究.[碩士學位論文].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學辛玲,許金俊,陶建平.2008.多重PCR檢測3種雞球蟲方法的建立.中國獸醫(yī)雜志,44(3):6-8薛方民.2007.雞艾美耳球蟲不同種株ITS-1、ITS-2序列的克隆和分析比較.[碩士學位論文].濟南:山東師范大學堯國榮,張輝,曾作財,方霞.2020.1例地方麻雞球蟲病繼發(fā)大腸桿菌病的診治.養(yǎng)禽與禽病防治,(2):46-47張曼.2010.牛乳中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.[碩士學位論文].楊凌:西北農(nóng)林科技大學鄭麗,任衛(wèi)科,路超,田向?qū)W,王利麗,李秀麗,鄢明華.2018.禽呼腸孤病毒納米PCR檢測方法的建立與應(yīng)用.中國獸醫(yī)科學,48(6):700-706AlexaA,RahnenfuhrerJ.2010.topGO:enrichmentanalysisforgeneontology.Rpackageversion2.8/packages/2.11/bioc/html/topGO.htmlAbdulKhaliqR,SonawanePJ,SasiBK,SahuBS,PradeepT,DasSK,MahapatraNR.2010.EnhancementintheefficiencyofpolymerasechainreactionbyTiO2nanoparticles:crucialroleofenhancedthermalconductivity.Nanotechnology,21(25):255704AliZ,JinG,HuZ,WangZ,KhanMA,DaiJ,TangY.2018.Areviewonnanopcr:history,mechanismandapplications.JNanosciNanotechnol,18(12):8029-8046AllenPC,FettererRH.2002.RecentadvancesinbiologyandimmunobiologyofEimeriaspeciesandindiagnosisandcontrolo